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문제 정의
- MC3KAD 환자에서 확인 동정된 D-체의 3-hydroxybutyric acid의 존재는 MC3KAD 환자의 소변에서 부분입체이성질체 유도체화를 통해 D-3-hydroxybutyric acid를 검출한 국내에서의 첫 보고이다.
가설 설정
- 본 연구에서 적용시킨 실제 임상 시료 분석에서의 이성질체 판별을 통해 지방산 산화와 케톤 생성 과정에서의 β-산화에서 유래한다는 가설을 뒷바침하였으며 이 사실을 재확인하였다1).
제안 방법
- 고해상도 GC-MS를 이용한 직접 및 간접거울상 분리 방법을 포함하여 구조 분석을 위한 다양한 분석방법이 개발되어 있다9-12). 개발된 분석 방법들은 먼저 카이랄성 하이드록시산을 휘발성 유도체로 만들어서 분석하였다. 이를 위하여 본 연구에서는, 직접적인 분석 방법에 비해 많은 장점이 있는 내구성이 높으면서 고온에서도 안정성이 있는 전통적인 방법인 비카이랄성 정지상을 이용하여 휘발성 부분 입체 이성질체 유도체를 분리하는 간접 거울상 분리법을 개발하였다.
- 과량의 반응물을 질소가스 하에서 제거 후, 농축된 잔류물을 아세토니트릴(10 μL) 존재 하에서 trifluoroacetic anhydride (20 μL)와 60℃에서 20분간 반응시켰다.
- 실험관련 데이터 및 임상적 데이터는 원 자료의 리뷰로부터 얻었다. 모든 받은 검체의 환자는 DNA검사 또는 생화학적 검사 또는 효소분석을 이용한 확진검사를 통하여 진단되었으며 이와 관련된 자료도 함께 얻었다. 급성기 및 증상이 사라진 후의 소변으로부터는 환자의 크레아티닌 수치를 측정한 후 소변 분석 전까지 -70℃에서 보관되었다.
- 본 연구에서는 비카이랄성의 비극성과 극성의 컬럼 2개를 연결한 이중 모세관 컬럼 시스템을 이용하면서 부분 입체이성질체를 유도체화하였고, 이와 동시에 GC를 이용하여 retention index의 I 라이브러리 매칭을 통하여 대사질환의 진단에 중요한 하이드록시그룹 기능단의 이성질체를 확인 동정할 수 있는 새로운 분석 방법을 확진된 유전성대사이상 질환환자의 시료에 적용하여 실용성을 확인하였다. 이 연구는 D-체 R-체의 구별이 매우 중요한 몇몇 유전성 대사이상질환의 감별 진단할 수 있는 신속하고 저렴한 분석 방법으로 그 임상 증상과 관련된 경로 이해 및 진단에 유용하게 사용될 것이다.
- 본 연구에서는, 유전성 대사이상 질환으로 확진된 환자의 소변 검체를 이용하여 비카이랄성 이중 모세관 컬럼 시스템과 retention index (I)를 이용한 스펙트럼 매칭 방법을 동시에 사용하면서 O-trifluoroacetylated (S)-(+)-3-methyl-2-butyl ester 및 (-)-menthyl esters 유도체화 하여 D체- R체 이성질체의 분리, 확인, 동정을 수행하였다.
- 비극성의 DB-5 [5% phenyl-(methylpolysiloxane)] 및 중간 극성의 DB-17 [17% phenyl-(methylpolysiloxane)]로 구성된 실리카 모세관 컬럼(J & W Scientific, Rancho Cordova, CA, USA; dimensions 30 m×0.25 mm I.D., 0.25 μm film thickness)의 이중모세관 컬럼 시스템으로 구성하여 머무름 지수(I)를 측정하였다.
- 두 불꽃 이온 검출기의 신호는 dual-channel mode의 GC Chemstation에서 동시에 처리되었다. 아이소옥탄을 용매로 한 정상탄화수소(C10-C22, 짝수만)는 외부 표준물질로 주입되었으며, 온도가 프로그램된 I값은 기존의 머무름 지수를 이용하여 인접한 탄화수수 표준품의 머무름 시간 간의 선형보정법으로 계산되었다. Retetion index (I) 매칭을 통한 카이랄성 결정과 피크의 동정을 위하여 이중 컬럼에서 측정된 31종의 카이랄산을 확인 하는데는 보고된 논문의 라이브러리 데이터베이스가 포함되었다13, 14).
- 이 연구에서는 고비용의 카이럴 컬럼 사용을 하지 않으면서, 장시간의 시료 전처리 과정 및 일반적으로 GC 분석만으로는 이성질체를 D-체와 L-체가 구분할 수 없는 문제점을 해결하고 실제 임상시료에 적용하였다. 이 새로운 방법은 극성이 다른 2개의 컬럼을 사용한 점과 머무름 지수(I) 라이브러리를 결합하는 방식으로 구성하여 개발되었다13, 14). 희귀질환인 대사이상질환 중에서도 특히 매우 드문 몇 몇 유전성 대사이상증 환자의 소변을 개발된 방법으로 적용하여 이성질체를 분리 확인 동정하였다.
- 이 연구에서는 고비용의 카이럴 컬럼 사용을 하지 않으면서, 장시간의 시료 전처리 과정 및 일반적으로 GC 분석만으로는 이성질체를 D-체와 L-체가 구분할 수 없는 문제점을 해결하고 실제 임상시료에 적용하였다. 이 새로운 방법은 극성이 다른 2개의 컬럼을 사용한 점과 머무름 지수(I) 라이브러리를 결합하는 방식으로 구성하여 개발되었다13, 14).
- 개발된 분석 방법들은 먼저 카이랄성 하이드록시산을 휘발성 유도체로 만들어서 분석하였다. 이를 위하여 본 연구에서는, 직접적인 분석 방법에 비해 많은 장점이 있는 내구성이 높으면서 고온에서도 안정성이 있는 전통적인 방법인 비카이랄성 정지상을 이용하여 휘발성 부분 입체 이성질체 유도체를 분리하는 간접 거울상 분리법을 개발하였다.
- 증발건고 잔사에는 toluene (20 μL), acetyl chloride (1 μL) 및 (S)-(+)-3-methyl-2-butanol (20 mL) 또는 (-)-menthol solution (100 mL)을 첨가한 후, 액체 혼합물을 100℃에서 1시간 가열하여 부분 입체이성질체 유도체를 만들었다.
- 에테르층 추출물은 황산마그네슘으로 건조시킨 후 여과 및 중발 건조하였다. 카이랄산을 유도체화한 O-TFA-(S)-(+)-3-methyl-2-butyl ester 및 O-TFA-(-)-menthyl ester 모두 상기와 같이 전처리하여 GC로 직접 분석하였다13, 14).증발건고 잔사에는 toluene (20 μL), acetyl chloride (1 μL) 및 (S)-(+)-3-methyl-2-butanol (20 mL) 또는 (-)-menthol solution (100 mL)을 첨가한 후, 액체 혼합물을 100℃에서 1시간 가열하여 부분 입체이성질체 유도체를 만들었다.
- 이 새로운 방법은 극성이 다른 2개의 컬럼을 사용한 점과 머무름 지수(I) 라이브러리를 결합하는 방식으로 구성하여 개발되었다13, 14). 희귀질환인 대사이상질환 중에서도 특히 매우 드문 몇 몇 유전성 대사이상증 환자의 소변을 개발된 방법으로 적용하여 이성질체를 분리 확인 동정하였다.
대상 데이터
- (-)-Menthol, (S)-(þ)-3-methyl-2-butanol, 염화아세트산, trifluoroacetic anhydride는 Sigma-Aldrich Korea (Seoul, South Korea)에서, n-탄화 수소 표준품(C10-C22, 짝수만)은 Polyscience (Niles, IL, USA)에서 구입하였다.
- (-)-Menthol, (S)-(þ)-3-methyl-2-butanol, 염화아세트산, trifluoroacetic anhydride는 Sigma-Aldrich Korea (Seoul, South Korea)에서, n-탄화 수소 표준품(C10-C22, 짝수만)은 Polyscience (Niles, IL, USA)에서 구입하였다. Analytical grade의 아세토나이트릴, 톨루엔, 아이소옥탄 및 다이에틸 에테르는 Fisher Scientific (Fair Lawn, NJ, USA)에서 구입하였다. 그 외 모든 화학물질은 analytical grade였으며 수령한 상태 그대로 사용하였다.
- 아이소옥탄을 용매로 한 정상탄화수소(C10-C22, 짝수만)는 외부 표준물질로 주입되었으며, 온도가 프로그램된 I값은 기존의 머무름 지수를 이용하여 인접한 탄화수수 표준품의 머무름 시간 간의 선형보정법으로 계산되었다. Retetion index (I) 매칭을 통한 카이랄성 결정과 피크의 동정을 위하여 이중 컬럼에서 측정된 31종의 카이랄산을 확인 하는데는 보고된 논문의 라이브러리 데이터베이스가 포함되었다13, 14).
- 본 연구에서는 두 개의 불꽃 이온화 검출기 및 HP 3365A GC Chemstation (Hewlett-Packard, Avondale, PA, USA)인터페이스가 적용된 분할/비분할 주입 시스템이 장착된 Hewlett-Packard HP model 5890A gas chromatograph series II를 사용하였다. 주입구 및 검출기의 온도는 각각 260℃와 280°C였다.
- 소변시료는 지방산 산화 대사이상환자들(short chain 3-hydroxy acyl-CoA dehydrogenase deficiency, medium chain 3-ketoacyl-CoA thiolase deficiency) 및 유기산 대사이상환자(β-ketothioloase 결핍증)들로부터 채취되었다. 유전성 대사이상 환자의 소변시료는 크레아티닌 수치와 함께 일본의 시마네 의과 대학과(Department of Pediatrics, Shimane Medical University, Shimane 693-8501, Japan)와 예일대학교 소아과 및 의학유전학과(Department of Pediatrics and Human Genetics at Yale University, New Haven, CT, USA)로부터 제공 받았다. 실험관련 데이터 및 임상적 데이터는 원 자료의 리뷰로부터 얻었다.
성능/효과
- 3에서 확인된 3-hydroxy butyric acid는 Kim 등14)의 보고와 일치하여 머무름 시간은 D-체가 L-체보다 빨랐으며 retention index matching을 통하여 D-체임이 확인되었다14). 단쇄 히드록시 코에이 탈수소 효소결핍증(short chain 3-hydroxy acyl-CoA dehydrogenase 결핍증, SCHADD)와 중쇄 케토아실 코에이 치올라제 효소결핍증(medium chain 3-ketoacyl-CoA dehydrogenase 결핍증, MC3KAD)에서 3-hydroxybutyric acid의 이성질체가 D-체로 판별됨에 따라 SCHADD와 MC3KAD가 모두가 대표적인 동일한 지방산 산화 대사경로를 거치면서 L-대사경로가 아닌 D-대사경로로 대사된다는 점을 시사하였다. 본 연구에서 적용시킨 실제 임상 시료 분석에서의 이성질체 판별을 통해 지방산 산화와 케톤 생성 과정에서의 β-산화에서 유래한다는 가설을 뒷바침하였으며 이 사실을 재확인하였다1).
- 인체에서의 대부분의 대사경로가 L-대사경로를 거치므로 연구에 적용된 보든 대사이상질환환자의 소변시료에서 L-lactic acid가 검출되었으나, MC3KAD에서는 L체와 D체의 lactic acid15)가 동시에 소변에서 검출되었다. 이와 관련된 보고는 전무하므로 추후 추가 연구가 필요하다고 본다(Fig.
후속연구
- L-, D- lactic acid와 glutaric aciduria type 2 및 medium chain 3-ketoacyl- CoA thiolase deficiency간의 연관성이나 적절한 가설을 추론하기에는 환자의 수(전 세계적으로 희귀한 질환이므로)가 제한되어 있으므로 추가 연구가 필요하다고 본다.
- 본 연구에서 지방산 산화와 케톤 생성은 D-체 형성의 경로로 대사된다는 점이 확인되었지만 명확한 생화학적 기전을 밝히기 위해서는 추후 다른 분자생물학적인 연구가 더 필요하리라고 여겨진다. 또한, 본 연구에서 응용한 예와 같이 임상증상만으로는 확인이 어려운 선천성 대사이상질환의 감별진단에 유용하게 이용할 수 있을 것이다.
- 본 연구에서 지방산 산화와 케톤 생성은 D-체 형성의 경로로 대사된다는 점이 확인되었지만 명확한 생화학적 기전을 밝히기 위해서는 추후 다른 분자생물학적인 연구가 더 필요하리라고 여겨진다. 또한, 본 연구에서 응용한 예와 같이 임상증상만으로는 확인이 어려운 선천성 대사이상질환의 감별진단에 유용하게 이용할 수 있을 것이다.
- 본 연구에서는 비카이랄성의 비극성과 극성의 컬럼 2개를 연결한 이중 모세관 컬럼 시스템을 이용하면서 부분 입체이성질체를 유도체화하였고, 이와 동시에 GC를 이용하여 retention index의 I 라이브러리 매칭을 통하여 대사질환의 진단에 중요한 하이드록시그룹 기능단의 이성질체를 확인 동정할 수 있는 새로운 분석 방법을 확진된 유전성대사이상 질환환자의 시료에 적용하여 실용성을 확인하였다. 이 연구는 D-체 R-체의 구별이 매우 중요한 몇몇 유전성 대사이상질환의 감별 진단할 수 있는 신속하고 저렴한 분석 방법으로 그 임상 증상과 관련된 경로 이해 및 진단에 유용하게 사용될 것이다.
- 가 동시에 소변에서 검출되었다. 이와 관련된 보고는 전무하므로 추후 추가 연구가 필요하다고 본다(Fig. 3).
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