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문제 정의
- 각 유기산 및 아미노산을 대사이상질환의 진단과 관련된 조건문을 만들기 위한 소스를 만들었다. 이 자료를 토대로 프로그램 소스 (Scheme 1)를 구성한 뒤 최종적인 결과 자동해석 시스템 프로그램을 제작하였다 (Table 3).
- 본 연구에서는 임상적 스크리닝 및 진단을 목적으로 GC-MS를 사용하여 기존의 방법보다 신속, 간편하게 유기산과 아미노산을 정량분석하는 방법을 개발하였다. 이 시스템을 실제 유전성 대사질환 환자 (프로피온산뇨증, 메틸말론산뇨증, PKU 등 다수 질환)의 검체를 적용해 봄으로써 이 방법의 유용함을 제시하였다.
- 본 연구에서는 저자의 연구실에서 이전 연구로부터 개발된 GC-MS를 이용한 유기산과 아미노산의 동시개발법에 기초한 자료를 근간으로 하예8) 개인용 컴퓨터를 기반으로 GC-MS 크로마토그램 데이터를 자동으로 해석함으로써 한번의 GC-MS 분석으로 유전성 대사이상질환인 유기산뇨증이나 아미노산혈증모두를 진단할 수 있는 방법을 개발하였다. 이를 위해 각 대사질환 진단의 유용한 대사물들에 대한 정상인과 환자를 구분하는 cut-off 치가 자동으로 체크되는 시스템을 구축하였다.
제안 방법
- GC/MS의 scanning mode에서의 크로마토그램으로부터 각 아미노산과 유기산의 TMS-TFA 스펙트럼을 얻었고, 이를 확인 동정하여 library로 제작하였다 (가칭 HMP0033.1ib). 이 library는 미지의 피크가 발견될 때 피크 동정용으로 사용되었다.
- 얻고 확인 동정하였다. TMS-TFA 유도 체화반응 후 아미노산과 유기산의 분자량 (fomular weight, FW), 유도체화한 분자량 (M+), 머무름 시간 (retention time, RT), 상대머무름 시간 (relative retention time, RRT), 상대 반응요소 (relative response factor, RRF), selected ion monitoring(SIM)을 위한 정량이온(quantitation ion, QI) 확인이온(confirmation ion, CI)에 대한 주요 정보를 구하였다. 각 아미노산과 유기산의 머무름 시간 등에 대한 정보를 가지고 SIM 프로그램을 완성시키고 각 화합물의 RT, 이온강도 등을 근거로 SIM 이온을 선택하였다.
- 시료주입 시의 split 비율은 1:10으로 하였다. m/z 50-550까지 full scan mode로 스캔하여 유도 체화한 분열양상을 확인하였다.
- 최종 결과 보고서이다. 가장 가능성이 높은 진단명부터 목록에 1, 2, 3 과같이 번호순으로 나오도록 프로그램을 만들었다. 적용한 환자의 여지에서는 이미 확진된 프로피온산뇨증이 1번 목록으로 뜨므로 이 환자를 정확히 진단할 수 있음을 확인하였다.
- TMS-TFA 유도 체화반응 후 아미노산과 유기산의 분자량 (fomular weight, FW), 유도체화한 분자량 (M+), 머무름 시간 (retention time, RT), 상대머무름 시간 (relative retention time, RRT), 상대 반응요소 (relative response factor, RRF), selected ion monitoring(SIM)을 위한 정량이온(quantitation ion, QI) 확인이온(confirmation ion, CI)에 대한 주요 정보를 구하였다. 각 아미노산과 유기산의 머무름 시간 등에 대한 정보를 가지고 SIM 프로그램을 완성시키고 각 화합물의 RT, 이온강도 등을 근거로 SIM 이온을 선택하였다. SIM 모드의 정량을 위해 사용된 선택 이온들의 대부분은 TMS 유도체화된 분자이온(molecular ion, M*)이거나 분자이온에서 (가公기가 떨어진 M-15 이온이었다.
- 개발한 방법이 실제 진단에 유용하게 진단에 응용될 수 있는지 유기산 대사이상질환인 Propionic aciduria, Methylmalonic aciduria 환자와 아미노산 대사이상질환인 Maple syrup urine disease, phenylketoneuria, hyperphenylalaniemia (PKU), homocystinuria, cystinuria, lysinuria, nonketotic-hyperglycinemia 의 혈장여지 및 소변 여지로 올바른 자동해석의 결과지가 생성되는지 검토하였다.
- 개인용 PC를 이용한 결과 자동화 시스템 개발을 위하여 Excel macro를 이용한 결과 자동해석 시크템을 위한 조건문을 만들기 위해 주요대사물들을 And, Or 혹은 No로 그룹을 나누어 분류하였다. 각 유기산 및 아미노산을 대사이상질환의 진단과 관련된 조건문을 만들기 위한 소스를 만들었다.
- 분석대상이 되는 유기산 및 아미노산의 종류를 선정하기 위해 유전성 대사이상 질환을 진단할 수 있는 파라미터나 진단 marker가 될 수 있는 103종의 주요 아미노산 및 유기산을 대상으로확립되어진 TMS-TFA 유도체화 반응을 하였다. 이 중 아미노산 1 종 (citrulline)과 유기산 12 종은 이 유도체를 적용하기에 적합하지 않아 최종적으로는 90 종이 분석대상이 되었다.
- 아미노산과 유기산의 표준품을 TMS와 TFA 유도 체화한 후 이로부터 얻어진 GC-MS 크로마토그램에서 각각의 아미노산과 유기산의 스펙트럼을 얻고 확인 동정하였다. TMS-TFA 유도 체화반응 후 아미노산과 유기산의 분자량 (fomular weight, FW), 유도체화한 분자량 (M+), 머무름 시간 (retention time, RT), 상대머무름 시간 (relative retention time, RRT), 상대 반응요소 (relative response factor, RRF), selected ion monitoring(SIM)을 위한 정량이온(quantitation ion, QI) 확인이온(confirmation ion, CI)에 대한 주요 정보를 구하였다.
- 분석하였다. 여기서 나온 크로마토그램의 대사물의 유무 및 과 소량에 관한 정보를 유전성대사이상 질환과 짝지어 데이터 베이스를 만들어 개인용 컴퓨터를 이용하여 Excel macro 프로그램을 만들어 자동해석하는 시스템을 개발하였다. 이를 이용하여 프로피온산뇨증 환자의 검체에 적용해본 결과 정확한 진단이 가능하였으므로 앞으로 이 진단법은 편리하고 유용하게 사용될 수 있으리라 사료된다.
- 운반이나 보관이 용이한 소변이나 혈장 여지로부터 유기산과 아미노산을 동시에 추출하여 TMS-TFA유도체화한 후 GC-MS로 분석하였다. 여기서 나온 크로마토그램의 대사물의 유무 및 과 소량에 관한 정보를 유전성대사이상 질환과 짝지어 데이터 베이스를 만들어 개인용 컴퓨터를 이용하여 Excel macro 프로그램을 만들어 자동해석하는 시스템을 개발하였다.
- 개발하였다. 이 시스템을 실제 유전성 대사질환 환자 (프로피온산뇨증, 메틸말론산뇨증, PKU 등 다수 질환)의 검체를 적용해 봄으로써 이 방법의 유용함을 제시하였다. 이 방법은 유전성 대사질환인 mass screening, 유기산과 아미노산 대사이상질환 환자의 진단, 그리고 환자의 follow-up 모니터링에 유용하게 이용할 수 있을 것으로 사료된다.
- 각 유기산 및 아미노산을 대사이상질환의 진단과 관련된 조건문을 만들기 위한 소스를 만들었다. 이 자료를 토대로 프로그램 소스 (Scheme 1)를 구성한 뒤 최종적인 결과 자동해석 시스템 프로그램을 제작하였다 (Table 3). 확진된 유전성 대사이상질환 검체로의 적용하기 위해 개발된 GC-MS 크로마토그램의 quality 의 점검, 유기산 프로파일, 아미노산 프로파일, 정상인의 연령별 정량 수치에 대해 재점검하기 위해 실제 대사이상질환 환자를 진단하여 보았다.
- 개발하였다. 이를 위해 각 대사질환 진단의 유용한 대사물들에 대한 정상인과 환자를 구분하는 cut-off 치가 자동으로 체크되는 시스템을 구축하였다.
-
5) 혈장 및 소변으로 정도관리 물질의 제작 및 농도범위 설정
정상으로 판명된 혈장 및 소변 검체를 분류하여 모두 모아 합친 후 pooled plasma와 pooled urine을 만들어서 정도관리 물질로 사용하였다. 이검체로부터 정도관리용 아미노산과 유기산의 농도 범위를 설정하여 이 범위내에서 10회 씩 실험하여 평균, 표준편차, 농도범위를 구하였다.
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6) 연령별 참고치 (reference range) 결정
정상인의 혈장 및 소변을 연령별(생후 0 - 1개월, 1개월 - 2세, 2 - 18세)로 분류하여 참고치를 구하였다.
- 혈장 및 소변 검체는 연령별 (생후 0 - 1개월, 1개월 - 2세, 2 - 18세)로 분류하여 유기산 (Table 1)과 아미노산 (Table 2)의 연령별 참고치를 구하였고 이 결과를 이미 보고된 문헌과 비교하였다 (본 논문에서는 생후 0 - 1개월의 참고치만 보고함). phosphorate와 같이 진단에 크게 관련이 없는 대사물 및 그 밖의 아미노산 (arginine, branched chain amino acid)을 제외하고는 이미 보고된 문헌과 유사한 참고 수치를 보였으며, 대부분의 경우 본 연구의 참고 수치는 보고된 문헌에 비해 약간 높은 수치를 보였다.
- 확정된 분석대상 화합물로 TMS-TFA 유도 체화한 90개의 유기산과 아미노산 화합물들의 질량스펙트럼을 얻은 후 이를 HP Chem Station 내에서 library로 만들었다 (HMP0033.1). 크로마토그램으로부터 library matching의 quality 를 확인한 결과 90% 이상의 양호한 matching quality rate 를 얻을 수 있었다.
- 이 자료를 토대로 프로그램 소스 (Scheme 1)를 구성한 뒤 최종적인 결과 자동해석 시스템 프로그램을 제작하였다 (Table 3). 확진된 유전성 대사이상질환 검체로의 적용하기 위해 개발된 GC-MS 크로마토그램의 quality 의 점검, 유기산 프로파일, 아미노산 프로파일, 정상인의 연령별 정량 수치에 대해 재점검하기 위해 실제 대사이상질환 환자를 진단하여 보았다.
대상 데이터
- 내부표준물질인 tropic acid는 Sigma-Aldrich 사(MA, USA)에서 구입하였고, 표준물질인 아미노산 표준품 (glycine 및 propionylglycine, isobutyrylglycine, isovalerylglycine, tiglylglycine), 유기산 표준품 (3-hydroxy propionic acid, Methylmalonic acid, Glutaric acid, Methylcitric acid) 도 Sigma-Aldrich 사" (MA, USA) 에서 구입하였다. 지시약인 methyl orange 와 유도체화 시약인 N-Methyl-N- (trimethylsilyl)-trifluoroacetamide(MSTFA) 및 N-Methyl- bis(trifluoro acetamide(MBTFA)# Sigma 사 (MA, USA) 로부터 구입하였다.
- GC-MS 시스템은 Hewlett-Packard 6890 Gas chromatgraphy 오} HP 5973 Mass selective detector 를 이용하였다. 컬럼으로는 Hewlett-Packard^] fused silica capillary column Ultra 2 (5% Phenyl methyl siloxane, 25m x 0.
- 지시약인 methyl orange 와 유도체화 시약인 N-Methyl-N- (trimethylsilyl)-trifluoroacetamide(MSTFA) 및 N-Methyl- bis(trifluoro acetamide(MBTFA)# Sigma 사 (MA, USA) 로부터 구입하였다. HPLC grade 인 아세토니트릴, trifluoroacetic acid, sulfosalicylic acid (SSA)를 Merck(Germany) 사에서 구입하였다. 직경이 6mm 인 혈액여지는 Schleicher and Schunel사(S&S #900; Dassel, Germany) 로부터 공급받았다.
- 33// m)를 사용하였고, 농축을 위해 Thermo vap (PIERCE Model 18780)을 사용하였다. 시료 전처리 과정을 위해 TAITEC (Tokyo, JAPAN) 사의 incubator/ shaker를 사용하였다.
- 하였다. 이 중 아미노산 1 종 (citrulline)과 유기산 12 종은 이 유도체를 적용하기에 적합하지 않아 최종적으로는 90 종이 분석대상이 되었다.
- USA) 에서 구입하였다. 지시약인 methyl orange 와 유도체화 시약인 N-Methyl-N- (trimethylsilyl)-trifluoroacetamide(MSTFA) 및 N-Methyl- bis(trifluoro acetamide(MBTFA)# Sigma 사 (MA, USA) 로부터 구입하였다. HPLC grade 인 아세토니트릴, trifluoroacetic acid, sulfosalicylic acid (SSA)를 Merck(Germany) 사에서 구입하였다.
- HPLC grade 인 아세토니트릴, trifluoroacetic acid, sulfosalicylic acid (SSA)를 Merck(Germany) 사에서 구입하였다. 직경이 6mm 인 혈액여지는 Schleicher and Schunel사(S&S #900; Dassel, Germany) 로부터 공급받았다.
- 를 이용하였다. 컬럼으로는 HP 의 Ultra 2 (Crosslinked 5% PH ME Siloxane, 50m x 0.2mm x 0.33// m)를 사용하였고, 농축을 위해 Thermo vap (PIERCE Model 18780)을 사용하였다. 시료 전처리 과정을 위해 TAITEC (Tokyo, JAPAN) 사의 incubator/ shaker를 사용하였다.
- 컬럼으로는 Hewlett-Packard^] fused silica capillary column Ultra 2 (5% Phenyl methyl siloxane, 25m x 0.2mm, film thickness 0.33/z m)를 사용하였다. 오븐온도는 8CTC에서 2분간 유지하고 80t!에서 290°C 까지 분당 5P씩 증가시켰으며, 29(TC에서 5분간 유지 시켰다.
데이터처리
- 사용하였다. 이검체로부터 정도관리용 아미노산과 유기산의 농도 범위를 설정하여 이 범위내에서 10회 씩 실험하여 평균, 표준편차, 농도범위를 구하였다.
성능/효과
- 1) 과 아미노산인 valine (Fig. 2) propionylglycine, library 의 mat사ling quality는 각각 93%, 92%, 94%로 매우 양호함이 확인되었다.
- (본 논문에서는 생후 0 - 1개월의 참고치만 보고함). phosphorate와 같이 진단에 크게 관련이 없는 대사물 및 그 밖의 아미노산 (arginine, branched chain amino acid)을 제외하고는 이미 보고된 문헌과 유사한 참고 수치를 보였으며, 대부분의 경우 본 연구의 참고 수치는 보고된 문헌에 비해 약간 높은 수치를 보였다. 이것은 검체수집 즉시 fresh specimen을 검사하는 것이 아니고 검체가 검사실로 도착하는데 1일이 소요되므로 그 사이에 검체의 변화로 보이나, 이러한 근소한 변화가 본 소프트웨어 프로그램을 이용하여 유전성 대사이상질환을 정확히 진단하는데 영향을 주지는 않았다.
- 가장 가능성이 높은 진단명부터 목록에 1, 2, 3 과같이 번호순으로 나오도록 프로그램을 만들었다. 적용한 환자의 여지에서는 이미 확진된 프로피온산뇨증이 1번 목록으로 뜨므로 이 환자를 정확히 진단할 수 있음을 확인하였다.
- 1). 크로마토그램으로부터 library matching의 quality 를 확인한 결과 90% 이상의 양호한 matching quality rate 를 얻을 수 있었다. 유기산인 mevalonolactone (Fig.
후속연구
- 이 시스템을 실제 유전성 대사질환 환자 (프로피온산뇨증, 메틸말론산뇨증, PKU 등 다수 질환)의 검체를 적용해 봄으로써 이 방법의 유용함을 제시하였다. 이 방법은 유전성 대사질환인 mass screening, 유기산과 아미노산 대사이상질환 환자의 진단, 그리고 환자의 follow-up 모니터링에 유용하게 이용할 수 있을 것으로 사료된다.
- 여기서 나온 크로마토그램의 대사물의 유무 및 과 소량에 관한 정보를 유전성대사이상 질환과 짝지어 데이터 베이스를 만들어 개인용 컴퓨터를 이용하여 Excel macro 프로그램을 만들어 자동해석하는 시스템을 개발하였다. 이를 이용하여 프로피온산뇨증 환자의 검체에 적용해본 결과 정확한 진단이 가능하였으므로 앞으로 이 진단법은 편리하고 유용하게 사용될 수 있으리라 사료된다.
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