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문제 정의
- 본 실험에서는 사상자탕 추출물(SSJ)과 가미사상자탕 추출물(GSJ)의 항염증 및 항산화 효과를 연구하고 비교한 결과 다음과 같은 결론을 얻었다.
제안 방법
- 유도된 NO는 염증상태에서 부종 등을 일으키고 염증매개체의 생합성을 촉진시켜 염증을 심화시킬 수 있다9). 이러한 연구 결과를 토대로, 본 실험에서는 사상자탕과 가미사상자탕의 염증성 피부질환에 대한 효능 평가를 하기 위해, 각질형성세포인 HaCaT 세포와 대식세포인 RAW 264.7 세포를 이용하여 사상자탕 물추출물(SSJ)과 가미사상자탕 물추출물(GSJ)의 항염증 및 항산화 효과를 실험하였다10).
- 배양액을 얻어 원하는 농도로 희석한 뒤 IL-6,TNF-α(eBioscience, San Diego, CA, USA),RANTES, IP-10, MDC(R&D systems Inc.,Minneapolis, USA) ELISA Kit를 이용하여 제조사의 지시에 따라 ELISA를 시행하고 450 nm 파장에서 마이크로 스펙트로 포토미터로 분석하였다.
- 1 μg/ml)을 처리하고 4시간 동안 CO2 배양기에 두었다. MTT 시약을 버리고 DMSO를 처리한 뒤 30분 동안 CO2 배양기에서 배양한 후 540 nm 파장에서 마이크로 스펙트로 포토미터(Molecular Device, Sunnyvale,CA, USA)로 분석하였다.
- 7 세포를 2×105 cells/ml 로 48 well에 분주하고 24시간 동안 안정화 시킨 후, 시료를 처리하고 한 시간 뒤에 LPS(1 µg/ml)로활성화 시킨 다음, 이후 24시간 동안 CO2 배양기에서 배양하였다. 배양액을 얻어 NO assayKit(iNtRON Biotechnology, Sungnam, Korea)를 사용하여 제조사의 지시에 따라 NO assay를 시행하고 540 nm 파장에서 마이크로 스펙트로포토미터로 분석하였다.
- 배양액을 버리고 PBS로 세척한 후 세포를 회수하여 용해물을 얻었다. 이 용해물을SDS-page Gel에 분리하고 멤브레인에 옮겨서blocking한 후 1차 antibody를 16시간 동안 4℃에서 반응시킨 후, 2차 antibody를 1시간 동안 실온에서 반응시키고 Chemi Doc 이미지 분석기기(Bio-Rad Laboratories, Hercules, CA)로 현상하여 분석하였다.
- RAW 264.7 세포와 HaCat 세포(5×105cells/ml)에 사상자탕 추출물(SSJ)과 가미사상자탕 추출물(GSJ)을 농도별로(0-800 µg/ml) 처리하고 24시간 배양 후 MTT assay로 측정한 결과모든 농도에서 독성을 나타내지 않았다(Table 1, Table 2).
- HaCaT 세포를 이용하여 케모카인(RANTES,IP-10, MDC)을, RAW 264.7 세포를 이용하여사이토카인(TNF-α, IL-6)과 NO를 측정하였다.
- 사상자탕(蛇床子湯)에 관하여서는 『外科正宗』에 음낭습진의 일종인 신낭풍(腎囊風)을 치료한다고 기록되어 있으며, 임상에서도 주로 염증성피부질환에 많이 사용되고 있다. 본 실험에서는사상자(蛇床子), 고삼(苦蔘), 당귀(當歸), 위령선(威靈仙)에 백부근(百部根)과 부평초(浮萍草)를 추가하여 가미사상자탕(加味蛇床子湯) 처방을 구성하고 이 처방의 추출물(GSJ)과 사상자탕 추출물(SSJ)의 항염증 및 항산화 효과를 실험하고 그 효과를 비교하였다.
대상 데이터
- 사상자(蛇床子), 고삼(苦蔘), 당귀(當歸), 위령선(威靈仙), 백부근(百部根), 부평초(浮萍草)를동경제약(주)(Seoul, Korea)에서 구입하여 사상자탕(1:1:1:1) 또는 가미사상자탕(1:1:1:1:1:1) 처방에 따라 무게를 재고 사상사탕 80 g, 가미사상자탕 120 g에 증류수 1ℓ를 넣어 100℃에서 2시간동안 끓였다. 끓인 약재를 Whatman No.
- Lipopolysaccharide(LPS), cyclosporinA(CsA), 3- (4, 5-dimethylthiazol-2-yl)-2, 5diphenyltetrazolium bromide(MTT),dimethylsulfoxide(DMSO)는 시그마알드리치코리아(Yong-in, Korea)에서 구입하였고, iNOS monoclonal antibody(mAb), β-actin mAb, TNF-α, interferon(IFN)-γ는 Santa Cruz Biotechnology사(Santa Cruz, CA)에서 구입하였다.
- 실험에 사용한 RAW 264.7 세포는 한국세포주은행(KTCC, Seoul, Korea)에서 분양받았으며 HaCat 세포는 현진원 교수님(Cheju National University, Korea)으로부터 분양 받아 사용하였다. RAW 264.
- 7 세포는 한국세포주은행(KTCC, Seoul, Korea)에서 분양받았으며 HaCat 세포는 현진원 교수님(Cheju National University, Korea)으로부터 분양 받아 사용하였다. RAW 264.7 세포와 HaCat 세포는 100 units/ml penicilin/streptomycin과 10% fetal bovine serum(FBS)이 함유된 DMEM 배지를 사용하여 37℃, 5% CO2 인큐베이터에서 배양하였다. Lipopolysaccharide(LPS), cyclosporinA(CsA), 3- (4, 5-dimethylthiazol-2-yl)-2, 5diphenyltetrazolium bromide(MTT),dimethylsulfoxide(DMSO)는 시그마알드리치코리아(Yong-in, Korea)에서 구입하였고, iNOS monoclonal antibody(mAb), β-actin mAb, TNF-α, interferon(IFN)-γ는 Santa Cruz Biotechnology사(Santa Cruz, CA)에서 구입하였다.
- 양성대조군으로서 CsA(1 µM)를 사용하였다.
데이터처리
- 실험 결과는 mean ± standard deviation (SD)으로 기록되었으며 SPSS 프로그램을 이용하여 일원배치 분산분석 (ANOVA)으로 유의성을 검증하였다.
성능/효과
- 사상자탕 추출물(SSJ)과 가미사상자탕 추출물(GSJ)이 HaCaT 세포에서 발현되는 RANTES와IP-10 생성을 억제하는 것으로 확인되었으며SSJ보다 GSJ의 효과가 더 큰 것으로 나타났다(Fig. 1A, 1B). 그러나 MDC 생성에는 영향을 미치지 않은 것으로 나타났다(Fig.
- 사상자탕 추출물(SSJ)과 가미사상자탕 추출물(GSJ)이 RAW 264.7 세포에서 발현되는 IL-6와TNF-α 생성을 억제하는 것으로 확인되었으며 SSJ보다 GSJ의 효과가 더 큰 것으로 나타났다(Fig. 2).
- 사상자탕 추출물(SSJ)과 가미사상자탕 추출물(GSJ)이 RAW 264.7 세포에서 발현되는 Nitric Oxide 생성을 억제하는 것으로 확인되었으며SSJ보다 GSJ의 효과가 더 큰 것으로 나타났다(Fig. 3).
- 사상자탕 추출물(SSJ)과 가미사상자탕 추출물(GSJ)이 RAW 264.7 세포에서 iNOS 발현을 감소시키는 것으로 확인되었으며 SSJ보다 GSJ의효과가 더 큰 것으로 나타났다(Fig. 4).
- 결론적으로, 사상자탕 추출물(SSJ)과 가미사상자탕 추출물(GSJ)은 염증반응이 유도된 HaCaT세포에서 RANTES, IP-10 분비를 억제하였고, RAW 26.47 세포에서 TNF-α, IL-6 분비 및 NO 생성을 억제하였다.
- 이를 토대로 세포에 독성이 없는 농도를 확인한 후 LPS로 염증 반응이 유도된 RAW264.7 세포에 사상자탕 추출물(SSJ)과 가미사상자탕 추출물(GSJ)을 처리하여 사이토카인을 측정한 결과, TNF-α와 IL-6 모두 농도 의존적으로 유의성 있게 감소되었으며, 농도 200 µg/ml에서 GSJ가 SSJ보다 TNF-α와 IL-6를 유의적으로 감소시켰다(Fig. 2).
- HaCaT 세포를 이용하여 이들 케모카인을 측정한 결과, 사상자탕 추출물(SSJ)과 가미사상자탕 추출물(GSJ)은 RANTES와 IP-10 생성을 모두 억제하는 것으로 나타났으며, 농도 200µg/ml에서 SSJ보다 GSJ의 효과가 더 큰 것으로확인되었다(Fig. 1A, 1B).
- 2). 그리고 Nitric oxide를 측정한 결과 SSJ와 GSJ 모두 RAW 264.7 세포에서 발현되는 Nitric Oxide 생성을 억제하는 것으로 확인되었으며 SSJ보다 GSJ의 효과가 더 큰 것으로 나타났다(Fig. 3). 또한, SSJ와 GSJ는 NO의 생성을 유도하는 iNOS도 감소시키는 효과를 나타냈으며 GSJ의 효과가 SSJ보다 더 큰 것으로 확인되었다(Fig.
- 3). 또한, SSJ와 GSJ는 NO의 생성을 유도하는 iNOS도 감소시키는 효과를 나타냈으며 GSJ의 효과가 SSJ보다 더 큰 것으로 확인되었다(Fig. 4).
- 1. 세포 독성 실험 결과, 사상자탕 추출물(SSJ)과 가미사상자탕 추출물(GSJ)은 0-800µg/ml 농도에서 독성을 나타내지 않았다.
- 5. 사상자탕 추출물(SSJ)과 가미사상자탕 추출물(GSJ)의 효과를 비교한 결과, 가미사상자탕 추출물(GSJ)이 사상자탕 추출물(SSJ)보다 농도 200 µg/ml에서 RANTES, IP-10,TNF-α, IL-6 그리고 NO를 억제하는 효과가 더 우수한 것으로 나타났다.
- 3. RAW 264.7 세포에서 사이토카인을 측정한 결과, 사상자탕 추출물(SSJ)과 가미사상자탕 추출물(GSJ)은 TNF-α와 IL-6의 생성을 농도 의존적으로 억제하는 것으로 나타났다.
- 47 세포에서 TNF-α, IL-6 분비 및 NO 생성을 억제하였다. 따라서 두 처방 모두 항염증 및 항산화 효과가 있다고 할 수 있으며, 두 처방의 비교에서는 가미사상자탕 추출물(GSJ)이 사상자탕 추출물(SSJ)보다 더 효과가 좋은 것으로 나타났다. 본 실험의 결과들을 고려해 봤을때, 이들 약물 각각의 효과 및 기전에 대하여 추가적인 연구가 이루어져야 할 것으로 생각되며, 적용 가능한 다양한 염증성 질환이나 알러지 질환 중에서 타겟 질환을 선정한 뒤 동물 실험을 수행하면 좋은 결과를 얻을 수 있을 것으로 사료된다.
- 2. HaCat 세포에서 케모카인을 측정한 결과, 사상자탕 추출물(SSJ)과 가미사상자탕 추출물(GSJ)은 RANTES와 IP-10 생성을 농도의존적으로 억제하였으나 MDC 생성에는영향을 미치지 않은 것으로 나타났다.
- 4. RAW 264.7 세포에서 NO 생성과 iNOS 발현 측정 결과, 사상자탕 추출물(SSJ)과 가미사상자탕 추출물(GSJ)은 NO 생성과 iNOS발현을 농도 의존적으로 억제하는 것으로 나타났다.
- 결론적으로, 사상자탕 추출물(SSJ)과 가미사상자탕 추출물(GSJ) 모두 항염증 및 항산화 효과가 있다고 할 수 있으며, 두 처방의 비교에서는 가미사상자탕 추출물(GSJ)이 사상자탕 추출물(SSJ)보다 효과가 더 우수한 것으로 사료된다.
후속연구
- 따라서 두 처방 모두 항염증 및 항산화 효과가 있다고 할 수 있으며, 두 처방의 비교에서는 가미사상자탕 추출물(GSJ)이 사상자탕 추출물(SSJ)보다 더 효과가 좋은 것으로 나타났다. 본 실험의 결과들을 고려해 봤을때, 이들 약물 각각의 효과 및 기전에 대하여 추가적인 연구가 이루어져야 할 것으로 생각되며, 적용 가능한 다양한 염증성 질환이나 알러지 질환 중에서 타겟 질환을 선정한 뒤 동물 실험을 수행하면 좋은 결과를 얻을 수 있을 것으로 사료된다.
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