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문제 정의
- 본 실험에선 UVB가 조사된 세포에 Hoechst 33258염색을 실시하여 apoptosis가 진행되고 있는 세포의 핵을 구별하고 관찰하였다. 그 결과 UVB를 조사하고 50 ㎍/㎖ 농도로 처리한 복분자에서 UVB를 조사한 대조군에 비해 세포핵의 농축을 억제하였다(Fig.
제안 방법
- 자외선 조사 전 6 well plate에 Hs68 세포주를 1×105 cells/well의 조건으로 배양하였으며 24시간 뒤 16시간 동안 serum starvation을 시켰다. 1 ㎖의 phosphate buffered saline(PBS)로 2번 washing 한 뒤 1 ㎖의 PBS에서 UVB 조사를 하였다(80mJ/cm2). 조사 뒤 즉시 배지를 갈아주고 24시간 각각의 샘플의 농도 (100, 50, 25, 12.
- Apoptosis 가 진행되는 세포를 관찰하기 위하여 Hoechst 염색을 실시하여 apoptosis가 진행되고 있는 세포의 핵을 관찰하였다. 상기와 같은 방법으로 Hs68 세포를 6 well plate 에서 UVB 조사시킨 후 즉시 배지를 갈아 주고 배양 시켰다.
- Free radical의 소거능을 확인하기 위해 2,2-diphenyl-1-picrylhydrazyl (DPPH; Sigma Aldrich) 소거능 측정을 이용하여 항산화 활성을 측정하였다. 96 well plate 에 샘플을 각각 100, 50, 10,5 ㎍/㎖ 농도로 희석하여 80 ㎕씩 준비 시키고 (A) 0.
- UVB 조사로 apoptosis가 진행되는 세포를 관찰하기 위하여 Hoechst 염색을 실시하고 형광현미경을 이용하여 apoptosis가 진행되고 있는 Hs68 세포의 핵을 관찰하였다. 그 결과 UVB를 조사하고 50 ㎍/㎖ 농도로 처리한 복분자에서 UVB를 조사한 대조군에 비해 세포핵의 농축을 억제하였다(Fig.
- 25 ㎍/㎖)에서 배양하였다. 대조군은 UVB 조사 없이 같은 방법으로 PBS washing과 배지교환을 해주었다.
- 복분자의 광독성 억제 활성을 알아보기 위해 Hs68 세포주에 UVB 램프 (312㎚; Viber Lourmat)를 광원으로 사용하여 자외선을 조사하였다. 대조군은 UVB를 조사하지 않았고 시험군은 UVB 조사 후 0, 6.25, 12.5, 25, 50, 100 ㎍/㎖ 농도별로 배양하여 Hs68 세포주의 생존 능력을 측정하였다. 그 결과 대조군에 비해 모든 시험군에서 농도 의존적으로 유의하게(p<0.
- 샘플을 각각 100, 50, 10, 5 ㎍/㎖의 농도로 처리하고 24시간 동안 배양한 뒤 MTT를 10 ㎕ 넣고 4시간 동안 배양하였다. 배지를 제거하고 200 ㎕의 DMSO 넣고 충분히 vortex 한 뒤 이를 ELISA reader를 이용하여 wave length 570 ㎚에서 측정하였다.
- 복분자 메탄올 추출물의 독성을 알아보기 위해 사람의 foreskin에서 유래한 Hs68 세포에 각각 5, 10, 50, 100 ㎍/㎖의 농도로 처리한 후 MTT assay를 시행하였다. Control(0 ㎍/㎖)에서의 생존율을 100%로 하였을 때 모든 농도에서 세포독성은 관찰되지 않았다(Fig.
- 복분자의 광독성 억제 활성을 알아보기 위해 Hs68 세포주에 UVB 램프 (312㎚; Viber Lourmat)를 광원으로 사용하여 자외선을 조사하였다. 대조군은 UVB를 조사하지 않았고 시험군은 UVB 조사 후 0, 6.
- 복분자의 항산화 및 광독성 억제활성을 알아보기 위해 Hs68 세포주를 이용하여 세포독성, DPPH radical 소거능, 광독성 억제 활성 및 apoptosis를 측정한 결과 다음과 같은 결론을 얻었다.
- 사람의 foreskin에서 유래한 Hs68 세포를 10%의 Fetal bovine serum (FBS;GIBCO)과 10,000 units/㎖ penicillin 과 10,000 ㎍/㎖ streptomycin을 첨가한 Dulbecco`s Modified Eagle`s Medium (DMEM; GIBCO)에서 37℃ 5% CO2의 조건에서 배양하였다.
- 24시간 뒤 배지를 제거하고 L-glutamate가 결핍된 DMEM에서 다시 24시간 동안 배양 시켰다. 샘플을 각각 100, 50, 10, 5 ㎍/㎖의 농도로 처리하고 24시간 동안 배양한 뒤 MTT를 10 ㎕ 넣고 4시간 동안 배양하였다. 배지를 제거하고 200 ㎕의 DMSO 넣고 충분히 vortex 한 뒤 이를 ELISA reader를 이용하여 wave length 570 ㎚에서 측정하였다.
- 15 mM DPPH/MeOH 를 80 ㎕에 첨가한 뒤 실온에서 10분간 반응시켰다. 샘플자체의 색이 반영되는 것을 배제하기 위하여 각각의 농도의 샘플만의 흡광도 (샘플 80㎕ + MeOH 80㎕) 를 측정하였고 (B), 대조군으로 샘플의 용매와 150 mM DPPH를 반응 시킨 것을 이용 하였다 (C). 이를 ELISA reader를 이용하여 wave length 520 ㎚에서 흡광도를 측정하였다.
- 이를 위해 Hs68(Human Foreskin fibroblast line;ATCC, CRL-1635) 세포주를 이용하여 복분자의 세포독성, DPPH radical 소거능, 광독성 억제 활성 및 apoptosis를 측정하였다.
- 등 여러 가지 질환에 대한 효능이 보고되고 있다. 이에 저자는 사람의 foreskin에서 유래한 Hs68 세포에 자외선을 조사하여 인위적으로 광독성을 유발시킨 후 복분자 추출물의 광독성 억제 효과를 평가하였다.
- 1 ㎖의 phosphate buffered saline(PBS)로 2번 washing 한 뒤 1 ㎖의 PBS에서 UVB 조사를 하였다(80mJ/cm2). 조사 뒤 즉시 배지를 갈아주고 24시간 각각의 샘플의 농도 (100, 50, 25, 12.5, 6.25 ㎍/㎖)에서 배양하였다. 대조군은 UVB 조사 없이 같은 방법으로 PBS washing과 배지교환을 해주었다.
- 2 ㎍/㎖ 의 농도로 10분간 배양하고. 형광현미경 EVOS fluorescence microscopy에서 관찰 하였다.
대상 데이터
- UVB 램프(312㎚; Viber Lourmat)를 광원으로 사용하였다. 자외선 조사 전 6 well plate에 Hs68 세포주를 1×105 cells/well의 조건으로 배양하였으며 24시간 뒤 16시간 동안 serum starvation을 시켰다.
- 복분자는 ㈜HMAX(제천, 한국)에서 구입하였다. 복분자 1 ㎏을 분쇄하여 메탄올(5 L)에 넣고 상온에서 overhead stirrer를 이용하여 3일 동안 추출하였다.
데이터처리
- 각 실험군간 통계적 유의성을 분석하기 위하여 Student t-test 를 사용하였다. 모든 결과는 각 실험군의 평균값 ± 표준편차 (Mean ± SD)로 나타내었고, 유의확률(p-value)은 p<0.
- 모든 결과는 각 실험군의 평균값 ± 표준편차 (Mean ± SD)로 나타내었고, 유의확률(p-value)은 p<0.05로 하였다.
성능/효과
- 1. 복분자 메탄올 추출물은 5, 10, 50, 100 ㎍/㎖ 농도에서 세포독성이 없었다.
- 2. 복분자의 DPPH radical 소거효과를 측정한 결과 50, 100 ㎍/㎖ 농도에서 농도 의존적으로 유의하게 높은 항산화 효과가 있었다.
- 3. 복분자의 광독성 억제 활성을 알아보기 위해 Hs68 세포주의 생존 능력을 측정한 결과 대조군에 비해 6.25, 12.5, 25, 50, 100 ㎍/㎖ 농도에서 농도 의존적으로 유의하게 cell viability가 증가하였다.
- 4. UVB를 조사하고 50 ㎍/㎖ 농도로 처리한 복분자에서 UVB를 조사한 대조군에 비해 세포핵의 농축을 억제하였다.
- DPPH의 환원성을 이용하여 복분자의 DPPH radical 소거능을 측정한 결과 5 ㎍/㎖ 농도에서 14.12±5.64%, 10 ㎍/㎖ 농도에서 32.17±4.95%로 소거 효과가 높지 않았으나 50 ㎍/㎖ 농도에서는94.9±0.68%, 100 ㎍/㎖ 농도에서는 95.93±0.81%로 50 ㎍/㎖ 농도 이상에서 농도 의존적으로 유의하게(p<0.05) 높은 항산화 효과가 있는 것으로 나타났다(Fig. 2).
- UVB 조사로 apoptosis가 진행되는 세포를 관찰하기 위하여 Hoechst 염색을 실시하고 형광현미경을 이용하여 apoptosis가 진행되고 있는 Hs68 세포의 핵을 관찰하였다. 그 결과 UVB를 조사하고 50 ㎍/㎖ 농도로 처리한 복분자에서 UVB를 조사한 대조군에 비해 세포핵의 농축을 억제하였다(Fig. 4).
- 그 결과 대조군에 비해 모든 시험군에서 농도 의존적으로 유의하게(p<0.05) cell viability가 증가하였다(Fig. 3).
- 대조군은 UVB를 조사하지 않았고 시험군은 UVB 조사 후 0, 6.25, 12.5, 25, 50, 100 ㎍/㎖ 농도별로 배양하여 Hs68 세포주의 생존 능력을 측정한 결과 대조군에 비해 모든 시험군에서 농도 의존적으로 유의하게(p<0.05) cell viability가 증가하였다(Fig. 3).
- 복분자의 항산화 효과를 알아보기 위해 DPPH의 환원성을 이용하여 복분자의 DPPH radical 소거효과를 측정한 결과 5 ㎍/㎖ 농도에서는 14.12±5.64%, 10 ㎍/㎖ 농도에서는 32.17±4.95%로 소거 효과가 높지 않았으나 50 ㎍/㎖ 농도에서는 94.9±0.68%, 100㎍/㎖ 농도에서는 95.93±0.81%로 50 ㎍/㎖ 농도 이상에서 농도 의존적으로 유의하게(p<0.05) 높은 항산화 효과가 있는 것으로 나타났다(Fig. 2).
- 실험에 사용된 복분자 메탄올 추출물의 독성을 알아보기 위해 Hs68 세포에 각각 5, 10, 50, 100 ㎍/㎖의 농도로 처리한 후 MTT assay를 시행한 결과 모든 농도에서 세포독성은 관찰되지 않았다(Fig. 1).
후속연구
- 본 연구를 통해 복분자의 항산화와 광독성 억제 효과를 확인할 수 있었지만 향후 자외선 차단과 피부손상 완화 효과 및 유전자 발현을 통한 기전 연구 등 후속 연구가 이루어져야 할 것으로 생각된다.
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