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문제 정의
- 따라서 본 실험에서는 α-MSH로 멜라닌 생성을 유도한 후 매괴화 에탄올추출물이 멜라닌생성에 미치는 영향을 조사 하였다.
- 멜라닌 합성과 관련된 신호전달 경로 중 MAPK는 MITF의 인산화에 관여하는 것으로 알려져 있다. 따라서 본 실험에서는 매괴화 에탄올추출물이 MAPK에 미치는 영향에 대해여 확인하였다. 실험 결과 α-MSH 단일처리군의 경우 ERK의 인산화가 억제되었고, p38과 JNK의 인산화가 유도 되었다.
- 이에 저자는 미백 효과가 있다고 보고된 매괴화의 멜라닌 억제 기전을 규명하고자 α-MSH로 과색소침착을 유발한 후 매괴화 에탄올추출물에 대한 tyrosinase, TRP-1, TRP-2 등의 단백질 발현 양상을 확인하였다. 또한 멜라닌 형성 경로 중 하나인 MAPKs 경로를 조사하여 보고 하는 바이다.
- 본 실험에서는 α-MSH로 인해 증가 되었던 멜라닌이 매괴화 에탄올추출물에 의해 ERK의 활성에 영향을 주어 tyroisnase 활성 조절에 관련이 있는지 알아보기 위하여 ERK 억제제인 PD98059를 사용하여, tyrosinase 활성과 멜라닌 합성을 측정 하였다.
- 이에 본 실험에서는 B16F10 세포의 세포수준에서 α-MSH 유도 후 매괴화 에탄올추출물에 의한 tyrosinase의 DOPA oxidase 활성에 미치는 영향과 tyrosinase의 활성 억제효과에 대하여 조사 하였다.
- 이에 저자는 미백 효과가 있다고 보고된 매괴화의 멜라닌 억제 기전을 규명하고자 α-MSH로 과색소침착을 유발한 후 매괴화 에탄올추출물에 대한 tyrosinase, TRP-1, TRP-2 등의 단백질 발현 양상을 확인하였다.
제안 방법
- 10 ㎝ 배양용기에 B16F10 세포를 1×105 개씩 분주하여 48시간 배양후, 매괴화 에탄올추출물을 12.5, 25㎍/㎖로 처리하고 1시간 후 α-MSH (100 nM)를 처리하였다.
- B16F10 세포를 chamber slide에 2×103 개씩 분주한 후 24시간 배양 후, 매괴화 에탄올추출물을 12.5, 25 ㎍/㎖씩 처리한 다음 1시간 뒤 α-MSH (100 nM) 를 처리하였다.
- B16F10 세포에서 세포생존율에 미치는 영향을 알아보기 위하여 매괴화 에탄올추출물을 6.25, 12.5, 25, 50, 100 ㎍/㎖의 농도로 처리하고, 48시간 배양하여 MTT assay를 실시하였다.
- B16F10 세포의 멜라닌 정량은 Hosoi 등 (1985)의 방법을 변형하여 사용하였다. 10 ㎝ 배양용기에 1×105 개씩 분주하여 24시간 배양 후, 매괴화 에탄올 추출물 12.
- 5 ㎎/㎖이 되도록 처리하고 3시간 배양하였다. MTT 용액을 처리한 배지를 제거하고 은박지로 포장하여 빛을 차단 후 실온에서 건조시킨 다음 DMSO로 용해시켜 ELISA reader 를 이용하여 570 ㎚ 파장의 흡광도를 측정하였다.
- 전기영동이 끝난 후 polyvinylidene difluoride membrane (Millipore, Bedford, MA, USA)에 전이 시켰다. Membrane은 5% skim milk-TBST (20 mM Tris-HCl, pH 7.5, 150 mM NaCl, 0.1% Tween 20)에서 1시간 동안 blocking 하고, tyrosinase, TRP-1, TRP-2, p-CREB, MITF, p-ERK, p-38, SAPK/JNK 등의 측정하고자 하는 1차 antibody를 1:1000으로 희석하여 실온에서 2시간 반응시켰다. TBST로 3회 세척한 후 tyrosinase, actin, TRP-1 및 TRP-2는 2차 항체를 1:1000으로 희석하여 실온에서 1시간 동안 반응시켰다.
- 1% L-DOPA와 실온에서 4시간 반응시켰다. PBS 로 2회 세척하고 10% formalin 용액으로 30분간 고정한 후 PBS로 2회 세척 하고 에탄올로 탈수시킨 다음 봉입하여 광학현미경으로 관찰하였다.
- TBST로 3회 세척한 후 tyrosinase, actin, TRP-1 및 TRP-2는 2차 항체를 1:1000으로 희석하여 실온에서 1시간 동안 반응시켰다. TBST로 3회 세척 후 WEST-ZOLⓇ(plus) Western blot detection system(iNtRON, Korea)을 사용하여 ChemiDoc으로 촬영하였다.
- 결과에서 보는 바와 같이 tyrosinase, TRP-1 단백질 발현의 감소가 MITF 발현 감소로 인한 결과인지 알아보기 위하여 매괴화 에탄올추출물과 α-MSH를 처리하고 단백질 발현의 변화를 측정하였다.
- 1 M PMSF를 혼합한 lysis buffer를 200 ㎕씩 분주하고 세포를 수거하여 얼음에서 30분간 용해시킨 다음 4℃, 15,000 rpm에서 30분간 원심분리하여 얻은 상층액을 tyrosinase 활성 측정에 사용하였다. 단백질 정량은 Bradford 시약으로 595 ㎚에서 흡광도를 측정하여 동량의 단백질 양을 계산하였으며, 계산된 단백질과 0.1 M SPB (pH 6.8)의 총량이 150 ㎕가 되도록 분주하고 0.1% (W/V) L-DOPA를 50 ㎕씩 분주하여 37℃에서 1시간 반응시켰으며, 30분 간격으로 475 ㎚에서 흡광도의 변화를 측정하였다.
- 멜라닌 합성 억제에 있어서 어떠한 멜라닌 합성 관련 단백질을 억제하는지 밝히기 위해 tyrosinase, TRP-1, TRP-2 관련 단백질 발현을 조사하였다. 실험 결과 대조군에 비해 α-MSH 단일처리군은 tyrosinase 단백질 발현이 현저하게 증가되었으며, 매괴화 에탄올추출물과 α-MSH를 병용처리 한 경우 tyrosinase, TRP-1의 단백질 발현이 12.
- 본 연구에서는 α-MSH에 의해 유도된 B16F10 세포에서 매괴화 에탄올추출물의 멜라닌 합성 억제효과및 작용기전에 대해 멜라닌 양과 tyrosinase 활성을 측정하여 유의한 결과를 얻었으며, p-ERK, MITF, tyrosinase 등의 단백질 발현은 Western blot을 통해 조사하여 다음과 같은 결론을 얻었다.
대상 데이터
- Dulbecco's modified Eagle's medium (DMEM)과 fetal bovine serum (FBS)은 Gibco사 (NY, USA) 제품을, dimethyl sulfoxide (DMSO), alphamelanocyte stimulating hormone (α-MSH), bovine serum albumin (BSA), triton X-100, ethylenediamine tetraacetic acid (EDTA), phenylmethyl sulfonyl fluoride (PMSF), goat polyclonal IgG tyrosinase, TRP-1, TRP-2는 Santa Cruz사 (CA, USA) 제품을 anti-Goat, anti-Rabbit, anti-Mouse IgG HRP conjugate antibody, hybond-ECL nitrocellulose membrane, Western Blotting detection reagent는 Amersham Biosciences사 (Buckinghanshire, England) 제품을, non-fat skim milk는 Becton사 (Le Pont de Claix, France) 제품을, leupeptin, aprotonin, sodium fluoride (NaF), sodium orthovanadate (Na3VO4), N,N,N',N'-tetrametylethylenediamine (TEMED), thiazolyl blue tetrazolium bromide (MTT), L-3,4-dihydroxyphenyl alanine (L-DOPA)은 Sigma 사 (St. Lousi, MO, USA) 제품을, 단백질 정량 시약은 Bio-Rad (CA, USA)사 제품을 사용하였다.
- Mouse 흑색종 세포주 B16F10 세포는 한국 세포주 은행 (KCLB, Korea)에서 구입하여 사용하였다.
- 8%)의 건조된 추출물을 얻어 시료로 사용하였다. 매괴화 에탄올추출물 시료는 DMSO에 녹여 사용하였으며, DMSO는 최종 0.01% 이하의 농도 범위에서 사용하였다.
- 본 실험에 사용된 매괴화(玫瑰花, Rosae rugosae Flos)는 경동시장(서울, 한국)에서 구입하여 사용하였다.
- 분양받은 B16F10 세포는 5% FBS가 첨가된 DMEM을 사용하여 37℃, 5% CO2 incubator에서 배양하였다. 그리고 48시간 주기로 배양액을 교체하여 주었으며 0.
- 이에 본 실험에서는 B16F10 세포의 세포수준에서 α-MSH 유도 후 매괴화 에탄올추출물에 의한 tyrosinase의 DOPA oxidase 활성에 미치는 영향과 tyrosinase의 활성 억제효과에 대하여 조사 하였다. 양성 대조군으로 기존의 in vitro, in vivo 실험에서 tyrosinase의 활성 억제 효능이 인정되어 현재 대표적인 arbutin, hydroquionoe 등의 미백제 중의 하나로 잘 알려져 있는 미백화합물21)인 코직산을 양성대조군으로 사용하였다. Fig.
- 매괴화 꽃봉오리 부분을 자연건조한 후 건조된 매괴화 200 g을 에탄올 2L를 가하여 실온에서 sonication 시킨 후 3일간 추출한 것을 일차로 거즈 여과한 다음 filter paper로 vacuum pump를 이용하여 여과하였다. 여과된 매괴화 에탄올추출물을 rotary evaporator로 감압 농축하여 27.60 g (수득율 :13.8%)의 건조된 추출물을 얻어 시료로 사용하였다. 매괴화 에탄올추출물 시료는 DMSO에 녹여 사용하였으며, DMSO는 최종 0.
- 원심분리기 (centrifuge HA-12, micro 17TR centrifuge), clean bench, CO2 incubator는 한일기기사 (Inchun, Korea) 제품을, ELISA reader는 Bio-T 사 (Winooski, USA) 제품을, Electrophoresis power supply는 Amersham사 (Buckinghanshire, England) 제품을, ChemiDoc image analysis는 Bio-Rad사 (CA, USA) 제품을, 감압농축기는 EYELA사 (Rotary evaporator N-100, Digital water bath SB-1000, Temp controller coolace CCA-1100, Japan) 제품을 사용하였다.
데이터처리
- 모든 실험은 3회 반복하였으며, 평균 ± 표준편차로 표시하였고, SigmaPlot (San Jose, CA, USA)의 Student's t-test를 이용하여 p-value를 구하였으며, p<0.05인 경우 *로 표기하였고, p<0.01인 경우**(##)로 표기하여 유의성을 나타내었다.
이론/모형
- B16F10 세포의 세포내 tyrosinase 활성은 Martinez-Esparza 등 (1998)의 방법으로 측정하였다. 10 ㎝ 배양용기에 B16F10 세포를 1×105 개씩 분주하여 48시간 배양후, 매괴화 에탄올추출물을 12.
- 개씩 부착시키고 매괴화 에탄올추출물을 처리하여 48시간 배양하였다. 배양된 세포를 모두 수거하여 lysis buffer (50 mM HEPES, 150 mM NaCl, 1% Triton X-100, 5 mM EGTA, 100 mM NaF, 1 mM Na3VO4, 2 mM PMSF, 10 ㎍/㎖ leupeptin, 10 ㎍/㎖ aprotinin) 로 4℃에서 60분간 용해시킨 후, 13,000 rpm에서 30분간 원심분리하여 얻은 세포 용해액은 Bradford 방법을 이용하여 단백질정량을 하였다. 동량의 세포 용해액 (단백질 100 ㎍)은 2×sample buffer와 혼합하여 95℃에서 5분간 끓인 후 12% SDS-polyacrylamide gel에 전기영동하여 단백질을 분리하였다.
성능/효과
- α-MSH와 매괴화 에탄올추출물을 병용처리한 군에서는 억제되었던 ERK의 인산화가 12.5, 25 ㎍/㎖에서 농도 의존적으로 회복되었으며, p38과 JNK에는 영향을 미치지 못하는 것으로 확인하였다.
- 1. 매괴화 에탄올추출물은 멜라닌 생성과 tyrosinase 활성을 유의성 있게 감소 시켰다.
- 2. 매괴화 에탄올추출물은 DOPA 염색을 통해 세포 수준에서 관찰한 결과 tyrosinase 활성을 감소 시켰다.
- 3. 매괴화 에탄올추출은 tyrosinase, TRP-1 단백질 발현을 농도 의존적으로 억제 시켰다.
- 4. 매괴화 에탄올추출물은 멜라닌 생성과 관련된 단백질의 전사를 조절하는 CREB, MITF의 발현을 감소 시켰다.
- 5. 매괴화 에탄올추출물은 ERK 인산화를 유도하여 tyrosinase, TRP-1, MITF 단백질의 발현을 감소 시켰다.
- 6. 매괴화 에탄올추출물에 의해 억제되었던 tyrosinase, TRP-1, MITF 단백질의 발현이 ERK 억제제인 PD98059에 의해 증가 하였다.
- 결과에서 확인 하였던 MITF의 발현 감소는 인산화 된 CREB은 전사인자인 MITF의 promotes에 binding 되어 α-MSH에 의해 증가된 tyrosinase의 활성을 MITF의 proteosomal degradation을 일으켜 ERK의 경로를 통하여 MITF의 발현을 억제 시켰다고 사료된다.
- 그 결과 Fig. 5(A & B)에 나타난 바와 같이 α-MSH 단일처리군은 대조군에 비하여 멜라닌 생성이 증가하였으나, 매괴화 에탄올추출물과α-MSH를 병용처리한 군에서는 멜라닌 생성을 농도의존적으로 감소 시켰다.
- 그러나 α-MSH와 매괴화 에탄올추출물 병용 처리군은 농도 의존적으로 감소하였음을 관찰할 수있었으며, 양성 대조군인 α-MSH와 코직산을 병용 처리한 군은 α-MSH 단일 처리 군에 비해 큰 변화는 관찰되지 않았다(Fig. 7).
- 그러나 Fig. 3,4의 결과를 미루어 보아 α-MSH와 매괴화 에탄올추출물을 병용 처리한 군에서 tyrosinase의 활성이 농도 의존적으로 억제효과를 보였으며, 생태학적으로 관찰 했을 때 세포의 색깔이 현저히 옅어지는 것을 관찰 할 수 있었다 .
- 따라서 매괴화 에탄올추출물은 α-MSH에 의해 유도된 B16F10 세포의 멜라닌 합성을 tyrosinase, TRP-1 단백질의 발현을 조절함으로써 억제하는 것으로 사료되며.
- 또한 Fig. 4의 실험 결과와 같이 매괴화 에탄올 추출물은 α-MSH 단일처리군은 대조군에 비하여 tyrosinase의 활성이 증가하였으나, 매괴화 에탄올추출물과 α-MSH를 병용처리한 군에서는 tyrosinase 활성을 농도 의존적으로 감소시켰다.
- 실험 결과 PD98059와 매괴화 에탄올추출물을 함께 처리한 경우와 매괴화 에탄올추출물을 단독 처리한 경우를 비교하였을 때 매괴화 에탄올추출물에 의해 억제되었던 멜라닌 함량과 tyrosinase 활성이 PD98059 처리에 의하여 회복되는 것을 확인할 수 있다. 또한 PD98059와 매괴화 에탄올추출물을 같이 처리한 경우에는 매괴화 에탄올추출물에 의해 억제되었던 MITF, tyrosinase 및 TRP-1 단백질 발현이 다시 증가 되는 것을 확인할 수 있다(Fig. 9). Fig.
- 실험 결과 α-MSH 단일처리군의 경우 ERK의 인산화가 억제되었고, p38과 JNK의 인산화가 유도 되었다.
- 실험 결과 CREB와 MITF는 α-MSH 단일처리군의 경우 대조군에 비하여 단백질의 발현이 모두 증가 하였다.
- 실험 결과 Fig. 2에서 보는 바와 같이 대조군에 비해 α-MSH 단일 처리군에서 증가 하였던 수지상 돌기가 α-MSH와 매괴화 에탄올추출물을 병용 처리한 군에서 농도 의존적으로 감소하였다.
- 본 실험에서는 α-MSH로 인해 증가 되었던 멜라닌이 매괴화 에탄올추출물에 의해 ERK의 활성에 영향을 주어 tyroisnase 활성 조절에 관련이 있는지 알아보기 위하여 ERK 억제제인 PD98059를 사용하여, tyrosinase 활성과 멜라닌 합성을 측정 하였다. 실험 결과 PD98059와 매괴화 에탄올추출물을 함께 처리한 경우와 매괴화 에탄올추출물을 단독 처리한 경우를 비교하였을 때 매괴화 에탄올추출물에 의해 억제되었던 멜라닌 함량과 tyrosinase 활성이 PD98059 처리에 의하여 회복되는 것을 확인할 수 있다. 또한 PD98059와 매괴화 에탄올추출물을 같이 처리한 경우에는 매괴화 에탄올추출물에 의해 억제되었던 MITF, tyrosinase 및 TRP-1 단백질 발현이 다시 증가 되는 것을 확인할 수 있다(Fig.
- 실험 결과 대조군 (100 ± 11.0%)과 비교하였을 때매괴화 에탄올추출물 6.25, 12.5, 25, 50, 100 ㎍/㎖의 농도에서 48시간 후 각각의 생존율은 98 ± 18.4%, 90 ± 1.1%, 79 ± 1.9%, 39 ± 1.3%, 17 ± 2.9%로 매괴화 에탄올추출물의 농도가 증가함에 따라 세포증식이 억제 되었다.
- 실험 결과 대조군에 비해 α-MSH 단일처리군은 tyrosinase 단백질 발현이 현저하게 증가되었으며, 매괴화 에탄올추출물과 α-MSH를 병용처리 한 경우 tyrosinase, TRP-1의 단백질 발현이 12.5, 25 ㎍/㎖에서 농도 의존적으로 감소되었다.
- 앞선 실험 결과 Fig. 3, 4에서 α-MSH에 의해 증가 되었던 epidermal-melanin network 확장을 매괴화 에탄올 추출물이 tyrosinase의 활성을 억제 하여 멜라닌 세포에 존재 하는 멜라노좀의 수송역할을 하는 수지상 돌기의 형성을 억제하는 것을 확인 하였다.
- 이는 매괴화 에탄올추출물이 α-MSH에 의해 증가 되었던 epidermal-melanin network 확장을 억제하여 α-MSH 단독 처리시에 비해 병용처리시 세포의 색깔이 옅어 진 것으로 사료되며, 또한 단일 화합물이 아닌 추출물임을 감안할 때 미백 활성을 가지고 있는 매우 좋은 천연물로 판단된다.
- 이상의 결과 매괴화 에탄올추출물은 α-MSH에 의해 자극된 B16F10 세포에서 CREB/MITF/MAPK/ERK 의 활성화를 통하여 tyrosinase, TRP-1의 멜라닌 생성 관련 단백질을 억제함으로서 멜라닌생성을 저해 한다.
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