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문제 정의
- 을 加味하여 조제하였다. 따라서 본 연구에서는 加味紫雲膏의 화상치료 효과를 보기 위하여 2도 화상 mouse의 조직학적 변화를 관찰하였고, 혈관투과성 변화와 염증반응을 관찰하기 위하여 혈액학적 검사를 통한 백혈구 수치, 혈소판수치, 적혈구 및 헤모글로빈 수치, 헤마토크리트를 측정하였고, 손상된 상처부위의 진피층의 기질형성과 더불어 혈관생성과 관련 있는 VEGF와 PI3K 및 그 하위기전에 Akt 발현 등의 변화를 통해 화상 및 상처치유 효과를 검토하였다.
제안 방법
- 가미자운고가 2도 화상조직 회복에 관여하는 바를 알아보기 위하여 실험동물 27마리를 정상군, 화상유도군, 가미자운고 처리군의 세 군으로 설정하고, 2도 화상 처리한 mouse를 15일 동안 이틀에 한 번씩 가미자운고를 도포하면서 병리 조직학적 관찰과 혈액학적 변화를 관찰 하였고, 혈관신생단백질의 발현에 미치는 영향을 확인한바 다음과 같은 결론을 얻었다.
- 가미자운고로 제조한 화상연고를 적용하지 않는 군을 대조군으로 하고 연고 처치군은 예비실험결과 유의한 것으로 추정되는 400 ㎎/mouse 농도의 화상연고를 적용하였다. 일반적으로 2도 화상은 일주일 정도 지나면 가피(crust)가 형성되고 15~20일 정도면 치유된다고 알려져 있으므로 치료기간 관찰을 위하여 15일 동안 이틀에 한 번씩 연고를 도포하여가며 매번 도포시마다 상처의 길이를 재어 치유 현상을 관찰하였고 완치단계에서 치료 전후 피부조직의 변화를 관찰하기 위하여 정상 피부와 화상부위의 피부를 떼어내어 병리 조직학적 관찰을 실시하였다.
- 따라서 실험에 사용한 가미자운고는 80 % 에탄올의 추출물을 바셀린((주)성광제약)25)과 함께 섞어 부착성을 높인 후 사용하였다. 가미자운고를 사용하기 위해 가미자운고의 농도가 100 ㎎/㎖이 되도록 탈이온수에 녹인 후, 여기에 바셀린 100 ㎕씩 넣어 후 교반하여 바셀린과 혼합된 연고를 조제하였다.
- 이때 연고는 화상과 상처를 입은 부위가 덮일 정도로 충분히 도포하였다. 각 군은 다시 화상 유발 후 1, 8, 15일로 구분하였고 각각 3마리씩 배정하였다.
- 구축된 화상 모델을 이용하여 가미자운고가 화상후의 변화된 피부조직에 미치는 조직학적 개선효과를 확인하였다. 가미자운고 처리군(Fig.
- 화상부위는 가로 세로의 길이를 곱하여 화상면적을 곱하여 구하였다. 대조군과 처리군의 각 동물의 화상부위 크기를 날짜별로 구하여 평균하였다.
- 본 실험에서는 화상의 치유효과를 극대화하기 위하여 紫雲膏의 기본 구성약물 紫草, 當歸에 항균효과21) 와 항염작용22)이 보고된 甘草와 淸熱, 排膿의 효과가 있는 金銀花, 黃芩, 黃柏23)을 加味하여 조제하였다. 따라서 본 연구에서는 加味紫雲膏의 화상치료 효과를 보기 위하여 2도 화상 mouse의 조직학적 변화를 관찰하였고, 혈관투과성 변화와 염증반응을 관찰하기 위하여 혈액학적 검사를 통한 백혈구 수치, 혈소판수치, 적혈구 및 헤모글로빈 수치, 헤마토크리트를 측정하였고, 손상된 상처부위의 진피층의 기질형성과 더불어 혈관생성과 관련 있는 VEGF와 PI3K 및 그 하위기전에 Akt 발현 등의 변화를 통해 화상 및 상처치유 효과를 검토하였다.
- . 실험동물인 mouse 27마리를 정상군, 화상유도군 및 가미자운고 처리군의 세 군으로 나누어 실험하였다. 먼저 mouse를 마취시킨 후 등 부위를 전기면도기를 이용하여 털을 깨끗이 제거하였다.
- . 실험에 쓰인 加味紫雲膏는 紫草, 當歸, 黃柏, 甘草, 黃芩, 金銀花로 이루어져있고 80 % 에탄올의 추출물을 바셀린과 함께 섞어 부착성을 높인 후 사용하였고 외용약을 통한 화상치료의 효과를 살펴보았다. 加味紫雲膏를 구성하는 약재의 효능을 살펴보면 紫草는 性은 寒無毒하고 味는 甘하여 心, 肝經으로 들어가고 凉血活血 解毒透疹하여 痲疹 瘡瘍 濕疹 水火湯傷을 치료한다23).
- 1 % Tween-20)로 상온에서 1시간 동안 blocking 한 후, 여러 가지 1차 항체를 4℃에서 over night(O/N)으로 반응시킨 후, PBST로 washing후 HRP-conjugated 2차 항체를 상온에서 1시간 동안 반응시킨다. 역시 PBST를 사용하여 washing 과정을 거친 다음에 Electrochemiluminescence detection system(Amersham-Pharmacia Biotech, Buckinghamshire, England)을 이용하여 X -ray film으로 결과를 확인하였다.
- 가미자운고로 제조한 화상연고를 적용하지 않는 군을 대조군으로 하고 연고 처치군은 예비실험결과 유의한 것으로 추정되는 400 ㎎/mouse 농도의 화상연고를 적용하였다. 일반적으로 2도 화상은 일주일 정도 지나면 가피(crust)가 형성되고 15~20일 정도면 치유된다고 알려져 있으므로 치료기간 관찰을 위하여 15일 동안 이틀에 한 번씩 연고를 도포하여가며 매번 도포시마다 상처의 길이를 재어 치유 현상을 관찰하였고 완치단계에서 치료 전후 피부조직의 변화를 관찰하기 위하여 정상 피부와 화상부위의 피부를 떼어내어 병리 조직학적 관찰을 실시하였다.
- 전혈의 채취는 EDTA 항응고제가 들어있는 tube를 이용하여 채취하였다. 채취한 전혈은 자동혈구계산기를 이용하여 혈액 기본치인 백혈구수(white blood cells, WBC), 적혈구수(red blood cells, RBC), 혈색소량(hemoglobin, Hb), 적혈구용적(hematocrit, HCT) 및 혈소판수(platelet, PLT)를 측정하였다. 나머진 혈액은 tube (Axygen Scientific, INC.
- 탈수가 끝난 조직을 파라핀블록을 만들어서 박절기(Lipshaw Model-45, USA)를 이용하여 5 ㎛두께로 연속절편을 제작하였고 Hematoxylin & Eosin(H&E)과 Masson's Trichrome 염색을 실시하여 광학 현미경(BH-2, Olympus, Japan)으로 관찰하였다.
- 화상 모델을 이용하여 가미자운고의 화상 개선효과를 확인하였다. 화상 실험은 Bruen, Min등의 방법을 응용하였으며, 일반적으로 2도 화상은 일주일 정도 지나면 가피(crust)가 형성되고 15~20일 정도면 치유된다고 알려져 있으므로 치료기간 관찰을 위하여 15일 동안 이틀에 한 번씩 연고를 도포하여가며 매번 도포 시마다 상처의 길이를 재어 치유 현상을 관찰하였고 완치단계에서 치료 전후 피부조직의 변화를 관찰하기 위하여 정상 피부와 화상부위의 피부를 떼어내어 병리 조직학적 관찰을 실시하였다.
- 화상 모델을 이용하여 화상의 모델을 구축하였다. 정상군(Fig.
- 화상 모델의 가미자운고에 의한 혈액학적 변화 중 백혈구의 수치 변화를 관찰하였다. 정상군에 비해서 1일, 8일, 15일 모두 화상유도군에서 유의하게 백혈구 수치가 증가하였고, 가미자운고 처리군에서는 치료 8일째와 15일째 증가된 백혈구 수치가 유의하게 감소하였다.
- 화상 모델의 가미자운고에 의한 혈액학적 변화 중 적혈구의 수치 변화를 관찰하였다. 정상군에 비해 화상유도군에서 1일, 8일에는 유의하게 적혈구 수치가 감소하였으나 15일에서는 변화가 없었다.
- 화상 모델의 가미자운고에 의한 혈액학적 변화 중 헤마토크리트의 수치 변화를 관찰하였다. 정상군에 비해서 1일, 8일, 15일 모두에서 정상군과 화상유도군, 가미자운고 처리군에서 모두 유의한 변화가 관찰되지 않았다(Fig.
- 화상 모델의 가미자운고에 의한 혈액학적 변화 중 헤모글로빈의 수치 변화를 관찰하였다. 정상군에 비해서 1일, 8일, 15일 모두 화상유도군에서 유의하게 헤모글로빈이 변화하였으나 15일째는 1일과 8일과는 반대로 헤모글로빈 수치가 증가하였다.
- 화상 모델의 가미자운고에 의한 혈액학적 변화 중 혈소판의 수치 변화를 관찰하였다. 정상군에 비해서 8일, 15일에서 화상유도군에서 유의하게 혈소판이 감소하였고, 가미자운고 처리군은 치료 8일과 15일째 혈소판 수치가 비치료군에 비해 유의하게 증가하였다.
- 화상 모델을 이용하여 가미자운고의 화상 개선효과를 확인하였다. 화상 실험은 Bruen, Min등의 방법을 응용하였으며, 일반적으로 2도 화상은 일주일 정도 지나면 가피(crust)가 형성되고 15~20일 정도면 치유된다고 알려져 있으므로 치료기간 관찰을 위하여 15일 동안 이틀에 한 번씩 연고를 도포하여가며 매번 도포 시마다 상처의 길이를 재어 치유 현상을 관찰하였고 완치단계에서 치료 전후 피부조직의 변화를 관찰하기 위하여 정상 피부와 화상부위의 피부를 떼어내어 병리 조직학적 관찰을 실시하였다. Fig.
대상 데이터
- 본 실험에서 사용한 약재인 가미자운고는 자초(Lithospermi Radix) 40 g, 당귀(Angelica Gigantis Radix) 60 g, 감초(Glycyrrhizae Radix) 40 g, 황백(Coptidis Rhizoma), 황금(Scutellaria Radix), 금은화(Ronicerae Flos) 각각 20 g의 총량 200 g의 약재를 옴니허브(Youngcheon, Korea)에서 구입하여 상온에서 2 L의 80 % 에탄올에 Ultra-sonicator (Branson, U.S.A)에서 15분간 sonication을 시킨 다음 약간의 break time (10분)을 가진 (발열반응이 일어남) 후 재차 한 번 더 반복한다. 추출된 액은 3 ㎜ 여과지(Whatman, Maidstone, England)를 이용하여 감압여과한다.
- 실험동물 mouse를 urethane으로 마취시킨 후 개복 하여 복대동맥에서 혈액 10 ml을 채취하였다. 전혈의 채취는 EDTA 항응고제가 들어있는 tube를 이용하여 채취하였다.
- 실험동물은 (주)오리엔트로부터 BALB/c mouse (웅성, 4~6주령, 중앙실험동물)를 분양 받아 사용하였으며, 사육실 온도는 25±1 ℃, 습도 55±10 %를 유지하였고, 명암은 12시간 주기로 조도 150~300 Lux의 사육환경에서 일주일간 적응 순화시켰으며, 사료는 (주)오리엔트로부터 상용화되고 있는 배합사료를 이용하였다.
데이터처리
- Values are expressed as mean±standard deviation (mean±S.D.), and analyzed by one-way ANOVA and multiple comparisons were performed by Tukey HSD test.
- (표준편차)로 요약하였으며, Student t-test 혹은 ANOVA로 분석하였다. 각 군간의 차이는 사후검정을 시행하였으며, 각 실험은 3회씩 반복처리되었다. p-value는 각각 0.
- 실험결과의 통계처리는 SPSS 프로그램을 사용하였고, 실험결과의 모든 분석은 각 그룹의 측정값을 Mean(평균) ± S.D.(표준편차)로 요약하였으며, Student t-test 혹은 ANOVA로 분석하였다.
이론/모형
- 화상 실험은 Bruen, Min등의 방법을 응용하였다26,27). 실험동물인 mouse 27마리를 정상군, 화상유도군 및 가미자운고 처리군의 세 군으로 나누어 실험하였다.
성능/효과
- 1. 가미자운고 처리군이 비처리군에 비하여 화상치유 효과가 큰 것을 확인할 수 있었다.
- 2. 가미자운고가 화상후의 변화된 피부조직에 미치는 조직학적 개선효과의 경우 가미자운고 처리군이 비처리군에 비해 상피층의 형성을 통한 회복과 상피층 전반에 걸친 기저세포들의 분열을 관찰할 수 있었다.
- 3. 정상군에 비해서 모든 화상유도군에서 유의하게 백혈구 수치가 증가하였고, 가미자운고 처리군에서는 비처리군에 비해 백혈구 수치가 유의하게 감소하였다.
- 4. 화상 모델의 혈소판의 수치 변화를 보면 정상군에 비해서 화상유도군에서 유의하게 혈소판이 감소하였고, 가미자운고 처리군에서는 혈소판 수치가 비치료군에 비해 유의하게 증가하였다.
- 5. VEGF와 PI3K 및 그 하위기전에 pAkt 발현의 경우 가미자운고 처리군이 비치료군에 비해 유의하게 세 단백질의 발현을 증가시켰다.
- 화상 실험은 Bruen, Min등의 방법을 응용하였으며, 일반적으로 2도 화상은 일주일 정도 지나면 가피(crust)가 형성되고 15~20일 정도면 치유된다고 알려져 있으므로 치료기간 관찰을 위하여 15일 동안 이틀에 한 번씩 연고를 도포하여가며 매번 도포 시마다 상처의 길이를 재어 치유 현상을 관찰하였고 완치단계에서 치료 전후 피부조직의 변화를 관찰하기 위하여 정상 피부와 화상부위의 피부를 떼어내어 병리 조직학적 관찰을 실시하였다. Fig. 2와 3에서 보는 바와 같이 가미자운고를 도포한 실험군에서 대조군에 비하여 화상치유 효과가 큰 것을 확인할 수 있었으며, 화상유발 15일의 피부 사진을 보면 월등히 개선된 것을 확인할 수 있었다. 이러한 결과들로 인하여 본 실험에 사용된 가미자운고는 화상 개선효과가 있는 것으로 사료된다(Fig.
- 정상군에 비해서 1일, 8일, 15일 모두 화상유도군에서 유의하게 헤모글로빈이 변화하였으나 15일째는 1일과 8일과는 반대로 헤모글로빈 수치가 증가하였다. 가미자운고 처리군에서는 치료 1일째와 8일째 헤모글로빈 수치가 비치료군에 비해 유의하게 증가하였다. 15일째는 헤모글로빈 수치가 정상군보다 유의한 증가를 보여주었으나 비치료군에 비해서는 유의한 증가를 보여주지 못했다(Fig.
- 결론적으로 加味紫雲膏는 화상조직의 회복을 현저히 촉진시켰으며, 혈액학적 개선효과 또한 보여주었다. 그 기전에 대한 연구로는 VEGF의 발현과 하위기전인 PI3K 및 Akt 단백질의 발현을 촉진시킴으로 보아 보통 생존 경로인 PI3K-Akt Pathway의 증진에 의한 혈관생성이 촉진되어 상처회복에 기여한 것으로 보여지지만 구체적인 메커니즘에 대한 추가적인 연구가 필요할 것으로 생각된다.
- 또한 외치법의 충실한 발전 외에 “火毒內攻”으로 다종변증이 발생하는 것을 주의하였다.
- 실험결과 화상이 유발된 실험동물의 경우 조직학적 관찰에서 일반적으로 많은 경우인 2도 화상을 확인할 수 있었으며, 가미자운고의 도포 치료 15일째 조직학적으로 상피조직의 재생과 진피층의 회복을 관찰할수 있었고, 그 사이 2차적인 감염 등은 발생하지 않았다. 또한 화상부위의 외관적인 양상 또한 회복추세를 뚜렷이 보여주었고, 화상의 가로세로의 직경 또한 비치료군에 비해 유의하게 감소함을 보여주었다. 혈액학적 변화의 경우 염증반응의 진행과 관련된 백혈구의 수치가 화상 정상군에 비해서 1일, 8일, 15일 모두 화상유도군에서 유의하게 백혈구 수치가 증가하였고, 가미자운고 처리군에서 8일째와 15일째 증가된 백혈구 수치가 유의하게 감소하였다.
- 실험결과 화상이 유발된 실험동물의 경우 조직학적 관찰에서 일반적으로 많은 경우인 2도 화상을 확인할 수 있었으며, 가미자운고의 도포 치료 15일째 조직학적으로 상피조직의 재생과 진피층의 회복을 관찰할수 있었고, 그 사이 2차적인 감염 등은 발생하지 않았다. 또한 화상부위의 외관적인 양상 또한 회복추세를 뚜렷이 보여주었고, 화상의 가로세로의 직경 또한 비치료군에 비해 유의하게 감소함을 보여주었다.
- 2와 3에서 보는 바와 같이 가미자운고를 도포한 실험군에서 대조군에 비하여 화상치유 효과가 큰 것을 확인할 수 있었으며, 화상유발 15일의 피부 사진을 보면 월등히 개선된 것을 확인할 수 있었다. 이러한 결과들로 인하여 본 실험에 사용된 가미자운고는 화상 개선효과가 있는 것으로 사료된다(Fig. 2 3).
- 이상의 결과 가미자운고는 화상조직의 회복을 현저히 촉진시켰으며, 혈액학적 개선효과 또한 보여주었다. VEGF의 발현과 하위 기전인 PI3K 및 Akt 단백질의 발현을 촉진시킴으로 보아 PI3K-Akt aPathway의 증진에 의한 혈관생성이 촉진되어 상처회복에 기여한 것으로 보인다.
- 이상의 본초의 主治와 效能으로 볼 때 加味紫雲膏는 淸熱凉血 祛瘀止痛 養血生肌 排膿療瘡하는 외용약으로 火傷으로 인한 초기 염증단계 뿐만 아니라 創傷治癒의 모든 단계에 유효할 것으로 사료된다.
- 화상 모델의 가미자운고에 의한 혈액학적 변화 중 백혈구의 수치 변화를 관찰하였다. 정상군에 비해서 1일, 8일, 15일 모두 화상유도군에서 유의하게 백혈구 수치가 증가하였고, 가미자운고 처리군에서는 치료 8일째와 15일째 증가된 백혈구 수치가 유의하게 감소하였다. 특히 15일째의 경우 정상수준에 가까운 백혈구수치를 보여주었다(Fig.
- 화상 모델의 가미자운고에 의한 혈액학적 변화 중 헤모글로빈의 수치 변화를 관찰하였다. 정상군에 비해서 1일, 8일, 15일 모두 화상유도군에서 유의하게 헤모글로빈이 변화하였으나 15일째는 1일과 8일과는 반대로 헤모글로빈 수치가 증가하였다. 가미자운고 처리군에서는 치료 1일째와 8일째 헤모글로빈 수치가 비치료군에 비해 유의하게 증가하였다.
- 화상 모델의 가미자운고에 의한 혈액학적 변화 중 헤마토크리트의 수치 변화를 관찰하였다. 정상군에 비해서 1일, 8일, 15일 모두에서 정상군과 화상유도군, 가미자운고 처리군에서 모두 유의한 변화가 관찰되지 않았다(Fig. 9).
- 화상 모델의 가미자운고에 의한 혈액학적 변화 중 혈소판의 수치 변화를 관찰하였다. 정상군에 비해서 8일, 15일에서 화상유도군에서 유의하게 혈소판이 감소하였고, 가미자운고 처리군은 치료 8일과 15일째 혈소판 수치가 비치료군에 비해 유의하게 증가하였다. 1일째는 변화가 없었다(Fig.
- 5). 혈소판의 경우 정상군에 비해서 8일, 15일에서 화상 유도군에서 유의하게 혈소판이 감소하였고, 가미자운고 처리군은 치료 8일과 15일째 혈소판 수치가 비치료군에 비해 유의하게 증가하였다. 1일째는 변화가 없었다(Fig.
- 또한 화상부위의 외관적인 양상 또한 회복추세를 뚜렷이 보여주었고, 화상의 가로세로의 직경 또한 비치료군에 비해 유의하게 감소함을 보여주었다. 혈액학적 변화의 경우 염증반응의 진행과 관련된 백혈구의 수치가 화상 정상군에 비해서 1일, 8일, 15일 모두 화상유도군에서 유의하게 백혈구 수치가 증가하였고, 가미자운고 처리군에서 8일째와 15일째 증가된 백혈구 수치가 유의하게 감소하였다. 특히 15일째의 경우 정상수준에 가까운 백혈구수치를 보여주었다(Fig.
후속연구
- 결론적으로 加味紫雲膏는 화상조직의 회복을 현저히 촉진시켰으며, 혈액학적 개선효과 또한 보여주었다. 그 기전에 대한 연구로는 VEGF의 발현과 하위기전인 PI3K 및 Akt 단백질의 발현을 촉진시킴으로 보아 보통 생존 경로인 PI3K-Akt Pathway의 증진에 의한 혈관생성이 촉진되어 상처회복에 기여한 것으로 보여지지만 구체적인 메커니즘에 대한 추가적인 연구가 필요할 것으로 생각된다.
- VEGF의 발현과 하위 기전인 PI3K 및 Akt 단백질의 발현을 촉진시킴으로 보아 PI3K-Akt aPathway의 증진에 의한 혈관생성이 촉진되어 상처회복에 기여한 것으로 보인다. 이 연구결과를 바탕으로 기존 한의학적인 화상치료에 대한 개념과 분자생물학적 기전을 밝힘으로써 한약제제의 활성화에 기여할 수 있을 것으로 생각한다.
- 이 연구의 제한점으로는 혈액투과성에 관련된 단핵구나 대식세포에 대한 혈액학적 자료가 없이 백혈구의 수치만을 보았다는 것과, 염증매개인자인 TNF-α, Interluekin 1 및 6 등의 발현에 대한 자료가 없다는 점이다.
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