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문제 정의
- 따라서 본 연구에서는 식물공장에서 대량 생산시스템에 의해 생산된 브로콜리 새싹이 건강기능식품과 식품 신소재로 산업적 이용이 가능하도록 하기 위한 연구의 일환으로 식물공장에서 재배한 브로콜리 새싹의 분획 용매에 따라 항산화 효과를 분석하고, 항산화 물질인 sulforaphane 함유량을 확 인하고자 하였다. 이를 통하여 식물공장 생산 시스템을 활용 한 고기능성 생리 활성 브로콜리 새싹 생산체계 구축을 위한 기초자료를 제공하고자 하였다.
- 또한, 식량 확보 차원에서 식물공 장 도입의 필요성이 증대되고 있어, 브로콜리 새싹을 식물공장에서 대량 생산시스템을 활용하여 재배하고 있다. 이를 분획 용매에 따라 항산화 효과를 분석하고, 항산화 물질인 sulforaphane 함유량을 확인하여, 이를 식물공장 생산 시스템에 활용하여 고기능성 생리 활성 브로콜리 새싹 생산체계 구축을 위한 기초자료로 제공하고자 하였다.
- 따라서 본 연구에서는 식물공장에서 대량 생산시스템에 의해 생산된 브로콜리 새싹이 건강기능식품과 식품 신소재로 산업적 이용이 가능하도록 하기 위한 연구의 일환으로 식물공장에서 재배한 브로콜리 새싹의 분획 용매에 따라 항산화 효과를 분석하고, 항산화 물질인 sulforaphane 함유량을 확 인하고자 하였다. 이를 통하여 식물공장 생산 시스템을 활용 한 고기능성 생리 활성 브로콜리 새싹 생산체계 구축을 위한 기초자료를 제공하고자 하였다.
제안 방법
- HPLC(High Performance Liquid Chromatography)는 Young-Rin Associates를 이용하였으며, mobile phase는 acetonitrile / water (20/80), 16 min(Gradient) - acetonitrile / water(60/40), 25 min acetonitrile / water(20/80)에서 μBondapak C18(3.9×300 mm) 컬럼을 사용하였으며, flow rate는 0.8 mL/min였고, UV 254, 327 nm에서 측정하였다.
- TLC 분석은 항산화 활성이 높았던 EtOA, BuOH 분획 추출물을 가지고 (BuOH : MeOH : H2O - 4 : 1 : 2, v/v/v), (CHCl3 : Hexane : BuOH : MeOH : H2O : AcOH - 4 : 2 : 2 : 2 : 1 : 0.5, v/v/v/v/v/v), (CHCl3 : BuOH : MeOH : H2O : AcOH - 2 : 4 : 1 : 2 : 1 v/v/v/v/v)을 전개 용매로 TLC를 실시하였다. TLC상의 spot은 UV-Lamp로 확인한 후 5% H2SO4로 각각 발색하여 확인하였다.
- 5, v/v/v/v/v/v), (CHCl3 : BuOH : MeOH : H2O : AcOH - 2 : 4 : 1 : 2 : 1 v/v/v/v/v)을 전개 용매로 TLC를 실시하였다. TLC상의 spot은 UV-Lamp로 확인한 후 5% H2SO4로 각각 발색하여 확인하였다. TLC 결과, 모든 분획 추출물에서 공통적으로 Rf 값이 같은 동일선상의 물질로 확인되었다.
- 건조된 브로콜리 새싹을 70% EtOH 용매를 가하여 shaking incubator(NB-205V.N-Biotek INC. Korea)에서 12시간씩 3회 반복 추출하였다. 추출된 시료는 여과(Whatman No.
- 5, v/v/v/v/v/v) 후 UV 254 nm, 334 nm에서 확인하였고, 5% 황산 용액을 도포 후 발색하여 확인하였다. 그리고 동일한 Rf 값을 갖는 spot의 분획을 회수한 후, 감압 농축하여 5개의 소분획물(LH1~LH5)을 얻어 항산화 활성 실험을 하였다.
- 브로콜리 분획물들의 SOD 유사 활성 및 hydroxyl radical 소거능 또한 매우 높았고, 분획물에 따라 약간의 차이를 나타내었으나, 전자 공여능이 다른 분획물보다 ethyl acetate와 butanol에서 높게 측정되었다. 따라서, 활성이 대체적으로 높은 butanol 분획층을 이용하여 open column chromatography, TLC 및 HPLC를 통 해 활성 물질을 분리․정제하였다.
- 이에 본 연구는 식물공장에서 생육 환경을 조절하여 재배 한 브로콜리 새싹의 70% EtOH 추출물을 chloroform, n-hexane, ethyl acetate, butanol, water의 용매로 분획하였고, 이 분획물로 총 페놀 함량, SOD 유사 활성, 전자공여능, 하이드록시 라디컬 유사 활성을 분석하여 항산화 활성을 알아보았다. 또한 용매를 분리하여 TLC와 HPLC 분석을 통해 활성물질을 확인하고, 이에 따른 함량을 분석하였다.
- 브로콜리 새싹 추출물을 chloroform, n-hexane, ethyl acetate, butanol로 분획 후 활성이 우수했던 ethyl acetate 층과 butanol 층을 이용하여, Sephadex LH-20, 4×50 cm, methanol(0~100%) 의 조건에서 용출하였다. 분취한 시료는 UV-vis spectrophoto- meter에 의해 흡수파장을 확인하였으며, 같은 파장의 분획물은 합쳐 LH1에서 LH5까지 나누었다.
- 브로콜리 새싹 추출물로부터 항산화 활성이 높았던 butanol 층을 이용하여 정제된 물질을 동정하기 위해 Sephadex LH-20, Methanol(100) 조건에서 LH1~LH5까지의 subfractions을 얻어 각종 생리 활성 실험에 사용하였다. 브로콜리 정제 추출물의 총 페놀 함량을 측정한 결과, LH3(3.
- 브로콜리 새싹 추출물을 chloroform, n-hexane, ethyl acetate, butanol로 분획 후 활성이 우수했던 ethyl acetate 층과 butanol 층을 이용하여, Sephadex LH-20, 4×50 cm, methanol(0~100%) 의 조건에서 용출하였다.
- 이에 본 연구는 식물공장에서 생육 환경을 조절하여 재배 한 브로콜리 새싹의 70% EtOH 추출물을 chloroform, n-hexane, ethyl acetate, butanol, water의 용매로 분획하였고, 이 분획물로 총 페놀 함량, SOD 유사 활성, 전자공여능, 하이드록시 라디컬 유사 활성을 분석하여 항산화 활성을 알아보았다. 또한 용매를 분리하여 TLC와 HPLC 분석을 통해 활성물질을 확인하고, 이에 따른 함량을 분석하였다.
- Korea)에서 12시간씩 3회 반복 추출하였다. 추출된 시료는 여과(Whatman No.2) 후 감압농축(Rotary evaporator N-1,000, EYELA)한 다음 CHCl3, hexane, EtOA, BuOH, water에 의해 순차적으로 분획하여 각 종 분석에 사용하였다.
대상 데이터
- 본 실험에 사용된 브로콜리 새싹은 (주)미스바알텍의 식물 공장에서 430~460 nm 파장 범위의 LED 청색 광원을 발아 2일(암조건), 4일 동안 하루에 10시간씩 조사시켰으며, 온도범위는 21~23℃, 습도는 45~60%로 조절하여 브로콜리 새싹을 재배하였다. 이 브로콜리 새싹을 저온열풍건조기 60℃에서 24시간 동안 건조하였고, 전 처리된 브로콜리 새싹은 200 mesh로 분쇄하여 분리․동정 후 분석시료로 사용하였다.
이론/모형
- 1 g의 lecithin을 chloroform 10 mL에 녹인 후 각 시험관에 100 μL씩 주입시킨 후 질소가스를 이용하여 용매를 완전히 제거한 추출물 0.1 mL와 Tris-KCl buffer(0.01 M Tris-HCl, 0.175 M KCl(pH 7.4)에 2 mM FeSO4, 2 mM ascorbic acid를 첨가하 여 혼합하고 37℃에서 30분간 incubating 후 과산화 지질을 TBARS법(2-thiobarbutric acid relative substance)으로 측정하였다(Muller HE 1985).
성능/효과
- HPLC 분석 결과, 각 분획추출물에서 같은 시간대에 동일 피크가 존재하는 것을 확인하였다. 이들 물질은 TLC 결과, 각 분획 추출물에서 공통적으로 Rf 값이 같은 동일선상의 물질과 동일할 것으로 사료되었다.
- 18 mg/100 g)의 순으로 높은 함량이 확인되었다. HPLC 분석결과, 처리방법과 추출용매에 따라 유효성분인 sulforaphane의 용출량에 영향을 미치는 것으로 나타났다. Choi JH(2004)는 SFE/HPLC를 이용하여 브로 콜리의 sulforaphane 함량을 분석한 결과, 67.
- 07%) 순으로 높게 나타났고, Kim 등(2012)의 연구에서도 BuOH과 EtOA 의 활성이 높은 것으로 나타났다. Hydroxyl radical 소거능은 BuOH(91.08%), EtOA(89.59%), water(87.54%), hexane(86.10%), CHCl3(85.76%) 순으로 높았으며, hydrogen radical 소거능은 water(71.40%), BuOH(71.37%), hexane(70.66%), EtOA(69.11%), EtOA(55.24%)의 소거능을 보였다. Lecithin oxidation는 water (71.
- TLC상의 spot은 UV-Lamp로 확인한 후 5% H2SO4로 각각 발색하여 확인하였다. TLC 결과, 모든 분획 추출물에서 공통적으로 Rf 값이 같은 동일선상의 물질로 확인되었다. 이 결과로부터 항산화 활성에 효과가 있는 물질일 것으로 사료되었다.
- 6 mg/ 100 g으로 측정되었다. 그러나 본 연구에서는 추출 용매를 분획하여 sulforaphane 함량을 분석한 결과, 각 층에서의 함량은 이전 연구결과보다 다소 낮게 측정되었다. Kim 등(1997)의 연구에 따르면 품종, 재배지역 등 시료에 따라 sulforaphane 함량이 다르다는 연구가 보고되어, 결과의 차이가 있는 것으 로 해석되었다.
- 분획물의 항산화 활성을 비교한 결과, butanol과 ethyl acetate 층에서 높은 항산화 활성을 보였고, 이에 butanol 층을 대상으 로 Sephadex LH-20에 분리하여 같은 파장을 나타내는 LH1에 서 LH5까지 5개의 층으로 나누어 분석한 결과, LH3의 정제 추출물이 높은 항산화 효과를 가지고 있는 것으로 나타났다. 다시 분획물을 TLC로 분리한 결과, Rf 값이 동일한 물질로 발견되었고, HPLC 분석을 실시한 결과, 각 분획물에서 동일한 피크가 존재하였으며, 이 물질들은 TLC 분석 결과와 비교하였을 때 Rf값이 같은 물질일 것이라 생각되었다. 또한 sulforaphane 함량은 chloroform, butanol층에서 높은 것으로 나타나, butanol 층에서 항산화 활성을 나타내는 것이 sulforaphane 함량이 높 은 것과 관련이 있을 것으로 생각된다.
- 따라서 브로콜리 새싹의 추출물이 체내 및 식품에서 유용한 기능성 소재로서 이용 가치가 높음을 확인할 수 있었다.
- 분획물의 항산화 활성을 비교한 결과, butanol과 ethyl acetate 층에서 높은 항산화 활성을 보였고, 이에 butanol 층을 대상으 로 Sephadex LH-20에 분리하여 같은 파장을 나타내는 LH1에 서 LH5까지 5개의 층으로 나누어 분석한 결과, LH3의 정제 추출물이 높은 항산화 효과를 가지고 있는 것으로 나타났다. 다시 분획물을 TLC로 분리한 결과, Rf 값이 동일한 물질로 발견되었고, HPLC 분석을 실시한 결과, 각 분획물에서 동일한 피크가 존재하였으며, 이 물질들은 TLC 분석 결과와 비교하였을 때 Rf값이 같은 물질일 것이라 생각되었다.
- Choi 등 (2008)은 올리브잎의 생리 활성 연구에서 butanol 분획물에서 총 플라보노이드, 총 페놀 함량이 높게 측정되었다고 보고하였고, 이 결과는 본 실험의 결과와 일치하였다. 브로콜리 분획물들의 SOD 유사 활성 및 hydroxyl radical 소거능 또한 매우 높았고, 분획물에 따라 약간의 차이를 나타내었으나, 전자 공여능이 다른 분획물보다 ethyl acetate와 butanol에서 높게 측정되었다. 따라서, 활성이 대체적으로 높은 butanol 분획층을 이용하여 open column chromatography, TLC 및 HPLC를 통 해 활성 물질을 분리․정제하였다.
- 브로콜리 새싹 추출물의 용매 분획별 sulforaphane 함량을 분석한 결과, CHCl3(56.76 mg/100 g), BuOH(49.16 mg/100 g), water(5.67 mg/100 g), EtOA(2.18 mg/100 g)의 순으로 높은 함량이 확인되었다. HPLC 분석결과, 처리방법과 추출용매에 따라 유효성분인 sulforaphane의 용출량에 영향을 미치는 것으로 나타났다.
- 브로콜리 새싹 추출물로부터 항산화 활성이 높았던 butanol 층을 이용하여 정제된 물질을 동정하기 위해 Sephadex LH-20, Methanol(100) 조건에서 LH1~LH5까지의 subfractions을 얻어 각종 생리 활성 실험에 사용하였다. 브로콜리 정제 추출물의 총 페놀 함량을 측정한 결과, LH3(3.27 mg/mL), LH4(3.23 mg/ mL), LH2(2.66 mg/mL), LH1(2.29 mg/mL) 순으로 나타났고, SOD 유사 활성은 LH2(96.90%), LH3(95.59%), LH1(95.34%), LH4(94.90%), LH5(94.04%) 순으로 높은 활성을 보였으며, 전자공여능은 LH2(90.70%), LH3(87.22%), LH1(81.08%), LH5 (64.19%)로 나타났고, hydroxyl radical 소거능은 LH2(96.76%), LH3(96.62%), LH1(96.45%), LH4(96.42%), LH5(96.31%) 순으로 높은 소거능을 보였다. 페놀 화합물의 함량과 항산화 효과가 밀접한 관련이 있다는 보고와 비교하여 볼 때, 총 페놀 화합물의 함량이 높은 LH3 정제 추출물이 대체적으로 우수한 항산화 효과를 보여주었다.
- TLC 결과, 모든 분획 추출물에서 공통적으로 Rf 값이 같은 동일선상의 물질로 확인되었다. 이 결과로부터 항산화 활성에 효과가 있는 물질일 것으로 사료되었다.
- HPLC 분석 결과, 각 분획추출물에서 같은 시간대에 동일 피크가 존재하는 것을 확인하였다. 이들 물질은 TLC 결과, 각 분획 추출물에서 공통적으로 Rf 값이 같은 동일선상의 물질과 동일할 것으로 사료되었다.
- 31%) 순으로 높은 소거능을 보였다. 페놀 화합물의 함량과 항산화 효과가 밀접한 관련이 있다는 보고와 비교하여 볼 때, 총 페놀 화합물의 함량이 높은 LH3 정제 추출물이 대체적으로 우수한 항산화 효과를 보여주었다.
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