[국내논문]Sprague Dawley 쥐에서 장내 유래 Lactobacillus sp. KP-3의 중금속 축적 저해 효과 The Inhibitory Effects of Intestine-oriented Lactobacillus sp. KP-3 on the Accumulation of Heavy Metals in Sprague Dawley rats원문보기
유산 균주들을 신생아 및 성인의 분변으로부터 분리하여 그 중에서도 가장 중금속 흡착능이 크고 중금속에 내성이 있다고 사료되는 균주 KP-3를 선별하여 동정한 결과 Lactobacillus sp.으로 밝혀졌다. 동물 실험에서는 생후 4주령의 Sprague dawley male rat에게 선별한 균주 KP-3를 투여하여 혈액 및 장기 내의 중금속 축적 저해효과가 어느 정도인지 조사하였다. 실험군으로는 SD rat 한 마리당 Lactobacillus sp. KP-3와 중금속 10 ppm을 혼합하여 약 100 ml/day씩 7일간 투여하였다. 대조군으로 중금속과 멸균 생리 식염수를 혼합하여 투여한 군과 Lactobacillus sp. KP-3와 멸균 생리 식염수를 혼합하여 투여한 군, 멸균 생리 식염수 만을 투여한 군으로 분리하여 SD rat 한 마리당 약 100 ml/day씩 7일간 투여하였다. 혈액, 간장 및 신장의 시료를 채취하여 카드뮴(Cd), 크롬(Cr), 납(Pb) 등의 중금속 축적량을 측정하였다. 측정 결과 크롬(Cr)은 신장에 주로 축적되었고, 납(Pb)은 간장과 신장에 주로 많은 축적을 보였고, 실험군인 Lactobacillus sp. KP-3와 중금속을 혼합하여 투여한 군에서는 중금속만을 투여한 군보다 중금속 축적량이 낮은 것으로 나타났다. 카드뮴(Cd), 크롬(Cr), 납(Pb)의 평균 중금속 축적 저해율은 각각 41.8%, 33.4% 44.2%로 나타났다. 특히, 혈액에서의 중금속 축적 저해율은 약 70%로 매우 높게 나타났고 혈액에서의 카드뮴 축적 저해율은 100%로 나타났다. 본 실험에서 탐색하여 최적화된 유산균이라고 생각되는 Lactobacillus sp. KP-3균주는 실험 결과에 의하면 중금속 축적 저해에 효과가 있는 것으로 여겨지며, 또한 유산균이 함유된 식품을 지속적으로 섭취함으로써 체내의 중금속의 축적 억제에 도움이 크게 되리라 생각된다.
유산 균주들을 신생아 및 성인의 분변으로부터 분리하여 그 중에서도 가장 중금속 흡착능이 크고 중금속에 내성이 있다고 사료되는 균주 KP-3를 선별하여 동정한 결과 Lactobacillus sp.으로 밝혀졌다. 동물 실험에서는 생후 4주령의 Sprague dawley male rat에게 선별한 균주 KP-3를 투여하여 혈액 및 장기 내의 중금속 축적 저해효과가 어느 정도인지 조사하였다. 실험군으로는 SD rat 한 마리당 Lactobacillus sp. KP-3와 중금속 10 ppm을 혼합하여 약 100 ml/day씩 7일간 투여하였다. 대조군으로 중금속과 멸균 생리 식염수를 혼합하여 투여한 군과 Lactobacillus sp. KP-3와 멸균 생리 식염수를 혼합하여 투여한 군, 멸균 생리 식염수 만을 투여한 군으로 분리하여 SD rat 한 마리당 약 100 ml/day씩 7일간 투여하였다. 혈액, 간장 및 신장의 시료를 채취하여 카드뮴(Cd), 크롬(Cr), 납(Pb) 등의 중금속 축적량을 측정하였다. 측정 결과 크롬(Cr)은 신장에 주로 축적되었고, 납(Pb)은 간장과 신장에 주로 많은 축적을 보였고, 실험군인 Lactobacillus sp. KP-3와 중금속을 혼합하여 투여한 군에서는 중금속만을 투여한 군보다 중금속 축적량이 낮은 것으로 나타났다. 카드뮴(Cd), 크롬(Cr), 납(Pb)의 평균 중금속 축적 저해율은 각각 41.8%, 33.4% 44.2%로 나타났다. 특히, 혈액에서의 중금속 축적 저해율은 약 70%로 매우 높게 나타났고 혈액에서의 카드뮴 축적 저해율은 100%로 나타났다. 본 실험에서 탐색하여 최적화된 유산균이라고 생각되는 Lactobacillus sp. KP-3균주는 실험 결과에 의하면 중금속 축적 저해에 효과가 있는 것으로 여겨지며, 또한 유산균이 함유된 식품을 지속적으로 섭취함으로써 체내의 중금속의 축적 억제에 도움이 크게 되리라 생각된다.
To investigate the effect of lactic acid bacteria on the heavy metal adsorption from internal organs and blood, lactic acid bacteria were isolated from human feces. Some strains resistant to heavy metals were selected by incubation in agar media containing each of chrome and cadmium salts. Among the...
To investigate the effect of lactic acid bacteria on the heavy metal adsorption from internal organs and blood, lactic acid bacteria were isolated from human feces. Some strains resistant to heavy metals were selected by incubation in agar media containing each of chrome and cadmium salts. Among them, a strain named KP-3 was ultimately chosen due to its higher growth rate in selective broth medium containing the heavy metals at the concentration of 0.01%. The strain was identified as Lactobacillus sp. based on its morphological, cultural and physiological characteristics. For evaluating the ability to prevent accumulation of heavy metals by selected Lactobacillus sp. strain in vivo, Sprague Dawley rats were fed with heavy metal salts (cadmium, chrome and lead) with or without cultured whole cells for 7 days. The amounts of heavy metals accumulated in liver, kidney and blood were analyzed. As a result, chrome was accumulated to kidney mostly, and lead was frequently found in liver and kidney. Experimental group (rats fed with lactic acid bacteria) showed less accumulation of heavy metal than control group (rats fed with saline solution). The inhibition rates of heavy metal accumulation were calculated to 41.8% (Cd), 33.4% (Cr) and 44.2% (Pb). Especially, feeding lactic acid bacteria strongly reduced accumulation of cadmium in blood. The results showed that feeding Lactobacillus sp. KP-3 could prevent the bioaccumulation of heavy metals in the living body.
To investigate the effect of lactic acid bacteria on the heavy metal adsorption from internal organs and blood, lactic acid bacteria were isolated from human feces. Some strains resistant to heavy metals were selected by incubation in agar media containing each of chrome and cadmium salts. Among them, a strain named KP-3 was ultimately chosen due to its higher growth rate in selective broth medium containing the heavy metals at the concentration of 0.01%. The strain was identified as Lactobacillus sp. based on its morphological, cultural and physiological characteristics. For evaluating the ability to prevent accumulation of heavy metals by selected Lactobacillus sp. strain in vivo, Sprague Dawley rats were fed with heavy metal salts (cadmium, chrome and lead) with or without cultured whole cells for 7 days. The amounts of heavy metals accumulated in liver, kidney and blood were analyzed. As a result, chrome was accumulated to kidney mostly, and lead was frequently found in liver and kidney. Experimental group (rats fed with lactic acid bacteria) showed less accumulation of heavy metal than control group (rats fed with saline solution). The inhibition rates of heavy metal accumulation were calculated to 41.8% (Cd), 33.4% (Cr) and 44.2% (Pb). Especially, feeding lactic acid bacteria strongly reduced accumulation of cadmium in blood. The results showed that feeding Lactobacillus sp. KP-3 could prevent the bioaccumulation of heavy metals in the living body.
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문제 정의
In vitro 상에서 가장 뛰어난 중금속 내성 및 중금속 흡착능을 보인 유산균이 in vivo 상에서도 효과를 나타낼 수 있는지 알아보기 위해 실험동물을 가지고 체내 중금속 축적 저해능을 조사하였다. 본 실험은 중원대학교 동물실험 윤리위원회의 승인하에 표준 작업 지침에 따라 수행되었다(JWU 2014-0611).
흡수된 카드뮴은 주로 간과 신장에 전신 부하량의 1/2~2/3가 축적되어 건강에 영향을 주며, 흡수한계를 초과하게되면 노출량에 관계없이 일정하게 축적되는 것으로 밝혀져 있다[43, 45]. 또한, 음식물 섭취와 같은 식생활 측면에서 인체에 유해한 중금속의 문제를 해결하고자 하는 본 연구는 생균체를 혼합하여 투여함으로써 식품을 통해 섭취된 유해한 중금속에 유산균이 어떠한 영향을 미치는지에 대한 실험을 하였다.
본 연구에서는 인체에 이롭고 광범위하게 활용되어 왔으며 안전한 균주로 인식되고 있는 유산균[11]중 중금속 내상과 흡착력이 우수한 균주를 탐색하였다. 그런 다음 탐색된 최적의 균주를 납, 수은, 카드뮴, 크롬 등 인체에 치명적 영향을 주는 잘 알려진 유해한 중금속들이 체내에 쌓이는 것을 저해할 수 있는지 ICP-MS (inductively coupled plasma-mass spectrometer) [2]를 이용하여 장기 및 혈액에 잔존하는 중금속 함량 분석을 통해 동물 실험을 통해 확인하였다.
제안 방법
중금속 내성을 보인 유산균주들의 배양 희석액 2 ml를 실험군의 경우 6가 크롬 포준원액(1,000 ppm) 8,000 ppm과 혼합하고, 대조군으로는 멸균 증류수 8 ml와 혼합하였다. 37℃ 배양기에서 10분간 방치한 다음 각각의 반응액을 원심분리하여 상층액을 제거한 다음 균체를 동결건조하였다. 실험군과 대조군의 동결건조후의 균체의 무게를 측정하였고, 실험군의 균체 무게에서 대조군의 균체 무게를 빼어 균체가 흡착한 중급속의 무게를 산출함으로써 균체에 흡착된 중금속의 양을 측정하였다.
Ether로 마취시킨 실험동물을 개복한 뒤 심장에서 직접 3~5ml의 혈액을 채취하여 EDTA가 담긴 시험관에 담아 즉시 냉장 보관 하였다. 신장과 간장은 각각 일정 부위를 3~4 g 적출하여 생리식염수에 수세한 후 액체 질소에 담가 순간 냉동시킨 다음 즉시 -60℃에서 냉동보관 하였다.
본 연구에서는 인체에 이롭고 광범위하게 활용되어 왔으며 안전한 균주로 인식되고 있는 유산균[11]중 중금속 내상과 흡착력이 우수한 균주를 탐색하였다. 그런 다음 탐색된 최적의 균주를 납, 수은, 카드뮴, 크롬 등 인체에 치명적 영향을 주는 잘 알려진 유해한 중금속들이 체내에 쌓이는 것을 저해할 수 있는지 ICP-MS (inductively coupled plasma-mass spectrometer) [2]를 이용하여 장기 및 혈액에 잔존하는 중금속 함량 분석을 통해 동물 실험을 통해 확인하였다.
선별된 균주의 담즙산 내성을 조사하기 위해 oxgall을 농도별로 첨가한 MRS agar에 균주를 접종하여 배양한 다음 생성된 집락수를 계측하였다. 내산성을 측정하기 위해 초기 pH를 다양하게 조절한 MRS broth에 균주를 배양한 다음 660 nm에서의 흡광도를 측정하였다.
대조군은 중금속 용액과 멸균 생리 식염수를 1:1(v/v)로 혼합하여 투여한 군, 선별된 생균체 현탁액과 멸균 생리 식염수를 1:1 (v/v)로 혼합하여 투여한 군, 멸균 생리 식염수만을 투여한 군으로 분리하여 마리당 평균 100 ml/day씩 7일간 자유 급식을 실시하였다.
중금속 내성 및 흡착능이 뛰어난 균주를 최종적으로 선정하여 각종 형태학적 및 생화학적 조사를 실시하였다. 또한 API 50 CHL kit를 가지고 당 이용성, arginine과 esculin 분해능 등을 조사하였으며[22, 33], 이를 토대로 APILAB program을 이용하여 균주를 동정하였다.
01%의 균주를 선별하였다. 선별된 균주를 중금속 0.01%로 동일한 농도의 MRS broth에 접종하여 24시간 배양한 후 적정 농도로 희석한 후 spectrophotometer를 사용하여 660nm에서의 흡광도를 측정하여 중금속을 함유한 액체 배지에서의 생육을 조사하였다.
선별된 균주의 담즙산 내성을 조사하기 위해 oxgall을 농도별로 첨가한 MRS agar에 균주를 접종하여 배양한 다음 생성된 집락수를 계측하였다. 내산성을 측정하기 위해 초기 pH를 다양하게 조절한 MRS broth에 균주를 배양한 다음 660 nm에서의 흡광도를 측정하였다.
37℃ 배양기에서 10분간 방치한 다음 각각의 반응액을 원심분리하여 상층액을 제거한 다음 균체를 동결건조하였다. 실험군과 대조군의 동결건조후의 균체의 무게를 측정하였고, 실험군의 균체 무게에서 대조군의 균체 무게를 빼어 균체가 흡착한 중급속의 무게를 산출함으로써 균체에 흡착된 중금속의 양을 측정하였다.
실험군은 선별된 균주를 매일 배양하여 동일 농도(2.0 O.D., 660 nm)의 생균체 현탁액으로 준비하여 10 ppm의 중금속 용액에 1:1 (v/v)로 혼합한 것을 급수통에 담아 마리당 평균 100ml/day씩 7일간 자유급식을 실시하였다.
장기 및 혈액에 축적된 중금속 함량을 알아보기 위해 전처리 과정을 거친 시료를 filter paper로 걸러 ICP-MS (inductively coupled plasma-mass spectrometer, Model : ELAN 6,100, Perkin-Elmer SCIEX, Source : Argon plasma 6,000 k, Mass Resolution : 0.3-3.0 amu, RF Power : 1150w, Sample injection Flow rate : 0.86 ml/min)를 사용하여 정량 분석하였다. 기기검출 한계(0.
중금속 내성 및 흡착능이 뛰어난 균주를 최종적으로 선정하여 각종 형태학적 및 생화학적 조사를 실시하였다. 또한 API 50 CHL kit를 가지고 당 이용성, arginine과 esculin 분해능 등을 조사하였으며[22, 33], 이를 토대로 APILAB program을 이용하여 균주를 동정하였다.
유산균이 섭취되고 난 후 위에서 생존하여 장에 안정적으로 도달하기 위해서는 내담즙산이 필수적이며 더불어 내산성을 갖추고 있을수록 가능성이 높다. 하지만 본 연구에서는 선별된 균주를 생균체 상태로 동물에게 투여하여 그 효능을 조사하고자 하였기에 내담즙성 및 내산성이 뛰어난 균주를 선별하려는 것보다 우선은 장내 정착이 가능할지를 동물실험 수준에서 확인하는 것에 더 중점을 두어 내담즙성 및 내산성을 측정하였다.
대상 데이터
중금속 내성을 지닌 균주를 대상으로 실험하였지만 중금속 흡착능은 균주에 따라 서로 큰 격차를 보이는 경향을 나타내었다. 그래서 6가 크롬 흡착능이 가장 뛰어나고 카드뮴을 함유한 액체 배지에서 가장 높은 생육을 나타냈던 KP-3 균주를 이번 실험에 사용할 최종 균주로 선별하였다.
중금속은 생리식염수에 용해시켜 사용하였고, Sigma사 제품을 구입하여 사용하였다. 미생물 배양에 사용한 배지 및 시약은 Difco사 또는 Junsei사의 제품을 이용하였다.
중금속 내성 균주의 분리
분변으로부터 분리한 200개의 유산 균주를 0~0.1% 사이의 각각의 농도별로 카드뮴용액을 첨가한 MRS agar에 도말하여 배양하였다. 카드뮴 농도가 높아짐에 따라 생존한 균주의 수는 조금씩 감소하였으며, 이중 0.
사람의 분변에서 분리한 유산균주를 0~0.1% 사이의 농도별로 중금속 용액을 첨가한 MRS agar에 도말한 후 모두 생존한 농도인 0.01%의 균주를 선별하였다. 선별된 균주를 중금속 0.
본 실험은 중원대학교 동물실험 윤리위원회의 승인하에 표준 작업 지침에 따라 수행되었다(JWU 2014-0611). 실험군 및 대조군 각 조건별로 8마리씩의 수컷 Sprague dawley (SD) rat을 사용하였고, cage 당 2마리씩 수용하였다.
유산균의 투여에 의한 중금속 축적 억제능을 조사하기 위해 생후 4주령의 수컷 Sprague dawley (SD) rat을 ㈜대한바이오링크에서 분양받아 사용하였고, ㈜삼양사의 흰쥐용 고형사료로서 적응시켰다. 사육장의 온도는 25℃로 유지하였으며 실험 시작 하루 전까지 식이와 식수를 자유롭게 먹을 수 있도록 하였다.
실험에 사용한 모든 시약은 특급 또는 1급 시약을 사용하였다. 중금속은 생리식염수에 용해시켜 사용하였고, Sigma사 제품을 구입하여 사용하였다. 미생물 배양에 사용한 배지 및 시약은 Difco사 또는 Junsei사의 제품을 이용하였다.
3)이 담긴 Eppendorf tube에 넣어 현탁하고 멸균 생리 식염수로 희석하여 분리용 고체 배지에 도말한 다음 37℃에서 2일간 배양하였다[36]. 형태학적으로 유산균으로 추정되는 colony를 1차적으로 순수 분리하여 200개 균주를 획득하였으며, 분리한 균주들은 MRS agar에 계대 보관하며 실험에 이용하였다.
성능/효과
5%의 저해율로 Lactobacillus sp. KP-3 투여에 의한 가장 높은 저해 효과를 보였고, 장기별로는 혈액에서의 중금속 축적 저해율이 평균 약 70%로 가장 높았다. 특히 눈에 띄는 점은 실험에 사용된 Lactobacillus sp.
크롬 축적 저해율을 비교해보면 크롬과 Lactobacillus sp. KP-3를 혼합하여 투여한 군의 경구 간장, 신장, 혈액에서 각각 57%, 18%, 33%의 저해율을 나타냈다.
또한 Lactobacillus sp. KP-3의 내산성을 조사한 결과(Fig. 2) 초기 배지 pH가 6 이상에서는 생육에 영향을 받지 않았으나 pH 6 이하부터 생육이 저해되었으며 pH 5 이하부터는 급격한 생육 저해를 보였다. 낮은 pH에서도 미미한 생육을 보이기는 했지만 Lactobacillus sp.
본 실험에서는 인체에 유해한 6가 크롬 표준원액을 사용하여 실험하였으며 간장에서의 크롬 축적량의 신장이나 혈액에서보다 대체로 높게 나타났다.
중금속 내성이 있다고 판단되는 20개의 선별된 균주를 중금속 0.01%로 동일한 농도의 MRS broth에서 24시간 동안 배양한 다음 적정 농도로 희석하여 660 nm에서의 흡광도를 측정한 결과 KP-3 균주가 2.279의 흡광도로 다른 균주들에 비해 가장 높은 생육을 보였다.
1과 같았다. 첨가된 oxgall의 농도에 따라 균주의 생육에는 크게 영향을 미치지는 않는 경향을 나타냈으며 최대 첨가 농도인 1.5%에서의 생존 균수와 무 첨가 시 생존균수에 차이가 거의 없었다. 이를 통해 Lactobacillus sp.
최종적으로 선정한 KP-3 균주를 MRS broth에서 18시간 동안 배양한 뒤 Gram staining을 실시하여 광학 현미경으로 morphology를 관찰한 결과 Gram양성 간균으로 나타났다. KP-3 균주는 glucose로부터 가스를 생성하지 않았고 catalase 및 oxidase 모두 음성으로 나타났으며, 15℃부터 45℃까지의 온도 범위 모두 생육하였고 pH 2.
1% 사이의 각각의 농도별로 카드뮴용액을 첨가한 MRS agar에 도말하여 배양하였다. 카드뮴 농도가 높아짐에 따라 생존한 균주의 수는 조금씩 감소하였으며, 이중 0.01% 농도를 기준으로 하여 생존한 20개의 중금속 내성 균주를 선별하였다(Table 2).
후속연구
체내의 혈액순환계통에 들어온 6가크롬은 적혈구의 세포막을 빠르게 통과하며 세포 내에서 세포 밖으로 이동할 수 없기 때문에 적혈구와 함께 존재하게 된다[1, 44]. 이처럼 체외로 잘 배출되지 않는 크롬이 유산균을 섭취함으로서 축적 저해 효과를 나타내었기에 혈중 크롬 함량 감소 효과를 얻을 수 있으리라 기대가 되고 호흡기 감염이 되었을 경우에도 체내의 크롬 농도를 줄일 수 있을 것으로 기대된다.
질의응답
핵심어
질문
논문에서 추출한 답변
인체에 독성을 가진 중금속 중 카드뮴의 특징은 무엇인가?
그런 인체에 독성을 가진 중금속 중 카드뮴은 매우 유해하며 자연계에서는 상대적으로 적은 농도로 존재하지만[18, 43] 각종 공장과 산업장에서 이용이 증가하고 있어서 인체에 미치는 건강 영향 평가 결과 급성·만성 중독을 일으키는 환경오염 물질로서 관심이 높아지게 되었다[8, 9, 12].
ADI란 무엇인가?
이런 위험에 쉽게 노출 될 수 있는 우리의 인체는 음식물이나 물, 공기, 토양과 같은 주변 환경에 노출되어 사람마다 어느정도의 차이는 있겠지만 중금속을 항시 섭취하게 된다. 특히 한국인이 식품을 통해 섭취하게 되는 유해적인 중금속의 섭취량이 인체 허용 1일 섭취량인 ADI (acceptable daily intake)에 근접해 있고[19], 이런 중금속이 인체 내에 들어가면 쉽게 배출되지가 않고 그 중 유독성 중금속은 다소 낮은 농도로도 인체조직과 반응하여 천천히 독성을 띄고 일정 수준을 넘어 중독이 되면 회복하여 완치가 불가능하기 때문에 현대 식품 사회에 큰 문제가 되고 있다[14, 47].
미생물에 의한 중금속의 흡수방법은 무엇이 있는가?
중금속의 흡수가 미생물에 의한 경우에는 보편적으로는 두 가지 방법에 의하여 일어난다고 알려져 있다. 먼저 세포표면에 존재하는 음이온 그룹에 대한 양이온의 결합에 의해 세포표면에 흡착되는 방법이고 두 번째로는 대사 작용에 의하여 세포 내에 축적되는 과정인 것으로 알려져 있는데 현재는 세포 표면 흡착에 관한 연구가 주로 이루어지고 있다[24]. 유산균은 당분을 분해하여 유산을 생성하는 세균을 총칭하며 그 종류가 대단히 많고 genus와 species에 따라 성상이 다르다.
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