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문제 정의
- 특히 현재 사용되고 있는 항염증제가 위염, 신장염 및 심장 질환 같은 문제를 일으킨다고 보고되어, 그 사용이 일부 제한되고 있다[12, 23]. 보다 안정적인 항염증제가 필요한 실정 이므로 본 연구에서는 노화를억제한다고 알려진 Brunfelsia grandiflora 유래의 scopoletin을이용하여 LPS로 유도한 RAW 264.7 세포의 염증 반응을 조사하고자 한다. Scopoletin (7-Hydroxy-6-methoxycoumarin)은 coumarin유도체로 Erycibe obtusifolia, Aster tataricus 그리고 Foeniculum vulgare 같은 많은 약제식물에 함유되어 있다[31].
- 또한 scopo- letine 복강내 상처에서 특히 과 발현된 염증성 cytokine을하향 조절하는 효과를 가지는 것으로 보고 되어졌다[32]. 하지만, 이와 같은 효과의 정확한 기전은 아직 밝혀진 바가 없어 Raw264.7 세포주에서 scopoletin이 가지는 항염증 효과에 대하여 연구하고자 하였다.
제안 방법
- Raw264.7 세포로부터 생성된 NO의 양은 Griess 시약을 이용하여 세포 배양액 중에 존재하는 NO2 -의 형태로서 측정하였다. Raw264.
- Scopoletin의 zymosan A에 의해 활성화된 Raw264.7 세포의 식균작용 억제능을 조사하였다. Fig.
- 그 다음 10% skim milk를 nitrocellulose membrane에전 처리하고 목적 단백질에 대한 1차 항체(anti-iNOS, anti- COX-2, anti-IL-1β, anti-TNFα 그리고 anti β-actin)를 처리한다음 2차 항체를 처리 후, chemiluminescent ECL kit (Amer- sham Pharmacia Biotech Piscataway, USA)를 사용하여 목적단백질을 검출하였다. Western blot의 band는 LAS3000® im- age analyzer (Fujifilm Life Science, Tokyo, Japan)를 이용하여관찰하였다.
- 조사하였다. scopoletin로 전 처리된 Raw264.7 세포에 LPS로 자극하였고, β-actin으로 단백질의 정량화를 나타내었다. NO를 생성하는 iNOS의 발현을 조사한 결과 4 μM 이상의 농도에서 iNOS의 단백질 발현 수준을 공 시험군과 비슷한 수준까지 억제하였다.
- scopoletin의 염증관련 cytokine의 단백질 수준에서의 발현억제효과를 조사하였다. scopoletin로 전 처리된 Raw264.
- 10 μg의 세포용출액을 10% Tris–HCl gel에서 전기영동후 단백질을 전기적으로 nitrocellulose membrane으로 전이시켰다. 그 다음 10% skim milk를 nitrocellulose membrane에전 처리하고 목적 단백질에 대한 1차 항체(anti-iNOS, anti- COX-2, anti-IL-1β, anti-TNFα 그리고 anti β-actin)를 처리한다음 2차 항체를 처리 후, chemiluminescent ECL kit (Amer- sham Pharmacia Biotech Piscataway, USA)를 사용하여 목적단백질을 검출하였다. Western blot의 band는 LAS3000® im- age analyzer (Fujifilm Life Science, Tokyo, Japan)를 이용하여관찰하였다.
- 7 세포를 분리하여 DMEM배지를 이용하여 24well plate에 24 hr 배양하였다. 세포에 scopoleitn을 1, 2, 4, 8 그리고 16 μM 농도를 전처리 하고 1 hr 후 배양액을 제거하였다. PBS 1 g/100 ml에 녹인 뒤 30분간 가열과정을 거쳐 활성화시킨 zymosan A 10 μl와 NBT (nitroblue tetrazolium) 20 μl 그리고 PBS 470 μl를 처리하였다.
- 7 세포를 DMEM배지를 이용하여 1×105 cell/well 로 조절한 후 24 well plate에 접종하고 37℃, 5% CO2의 습윤배양기에서 배양하였다. 세포에 scopoletin을 1, 2, 4, 8 and 16 μM 농도를 전처리하고 1 hr 뒤 LPS를 1 μg/ml 처리한 뒤 24 hr 배양하였다. 세포배양 상등액과 동량의 Griess 시약을 혼합하여 96 well plate 에서 10분 동안 반응시킨 후 540 nm에서흡광도를 측정하고 그 비를 %값으로 환산 하였다.
대상 데이터
- 7 세포는 American Type of Culture Collection, Manassas, USA으로부터 제공받았다. Raw264.7 세포는 5% CO2및 37℃에서 95% 이상의 습도를 유지한 배양기에서 10% fetal bovine serum, 2 mM glutamine and 100 μg/ml penicillin -streptomycin을 포함하는 DMEM 배지에서 배양하였다.
- 부터 구입하였다. Raw264.7 세포는 American Type of Culture Collection, Manassas, USA으로부터 제공받았다. Raw264.
- 세포배양을 위한 Dulbecco’s Modified Eagle’s Medium (DMEM), Trypsin-EDTA, penicillin / streptomycin / am- photericin (각각 10, 000 U/ml, 10, 000 μg/ml 및 2, 500 μg/ml), fetal bovine serum (FBS) 시약은 Gibco BRL, Paisley, Scotland 로 부터 구입하였다. Raw264.
데이터처리
- Data are given as means of values ± SD from three independent experiments. Level of sig- nificance was identified statistically (**, p<0.01; ***, p<0.001) using Student’s t test.
- Data are given as means of values ± SD from three independent experiments. Level of sig- nificance was identified statistically (**, p<0.01; ***, p<0.001) using Student’s t test.
- Data are given as means of values ± SD from three independent experiments. Level of significance was identified statisti- cally (**, p<0.01) using Student’s t test.
- Data are given as means of values ± SD from three independent experiments. Level of sig- nificance was identified statistically (**, p<0.01; ***, p<0.001) using Student’s t test.
- from three independent experiments. Level of significance was identified statistically using Student’s t test.
- 시료농도에 대해 평균±표준편차로 나타내었다. 각 시료농도 군에 대한 유의차 검정은 대조군과 비교하여 Student’s test 한 후 p<0.05 값을 통계적으로 유의성 있는 결과로 간주하였다.
- 각 실험은 3회 이상 반복실험을 통하여 그 결과를 얻어 각각의 시료농도에 대해 평균±표준편차로 나타내었다. 각 시료농도 군에 대한 유의차 검정은 대조군과 비교하여 Student’s test 한 후 p<0.
이론/모형
- Hansen [17]의 방법에 따라 Raw264.7세포에 대한 scopo- leitn의 세포독성을 MTT (3-(4, 5-dimethyl-2-yl)-2, 5-diphe- nyltetrazolium bromide)를 이용하여 측정하였다.
- LPS에 의해 Raw264.7 세포로부터 생성되는 NO에 대한 scopoletin의 억제효과를 세포배양액으로부터 Griess assay 방법에 의해 측정하였다. Fig.
- scopoletin의 대식세포에 독성을 미치지 않는 농도를 결정하기 위하여 MTT assay를 수행하였다. Fig.
성능/효과
- 또한 scopoletine 급성염증과 만성염증을 유발한다고 알려진 Ⅱ.-6 와 이와 협동적으로 작용하는 IL-1β의 단백질 발현조절 효과를 조사한 결과, scopoletin 처리군에서 IL-6과 IL-1β 둘 다 4와 8μM 농도에서 단백질 발현 수준이 감소하였다.
- 7 세포로부터 생성되는 NO에 대한 scopoletin의 억제효과를 세포배양액으로부터 Griess assay 방법에 의해 측정하였다. Fig. 2에서 보는 바와 같이 scopoletin의 1, 2, 4, 8 그리고 16 μM 처리농도에서 NO의 생성억제 효과를측정한 결과 8 μM 이상의 농도로 처리한 세포군에서 NO의생성 함량은 대조군와 비교했을 때 약 20% 정도 NO의 생성이억제되는 것으로 나타났다.
- 7 세포의 식균작용 억제능을 조사하였다. Fig. 3에서 보는 바와 같이 NBT 발색법을 이용하여 식균작용 억제능을 조사한 결과 zy- mosan A를 처리 하에서 scopoletine 1, 2 and 4 μM 농도에서는 식균작용을 억제시키지 못하였으나, 8 μM 이상의 농도 에서 약 10% 정도의 식균작용 억제능을 나타내었다.
- 7 세포에 LPS로 자극하였고, β-actin으로 단백질의 정량화를 나타내었다. NO를 생성하는 iNOS의 발현을 조사한 결과 4 μM 이상의 농도에서 iNOS의 단백질 발현 수준을 공 시험군과 비슷한 수준까지 억제하였다. COX-2의 단백질 수준에서의 발현억제효과를 조사한 결과 scopoletine COX-2의 발현을 LPS 군보다 억제하였지만 많은 효과를 나타내지 못하였다.
- 1에서 보는 바와 같이 scopoletine 농도가 증가하더라도 세포독성이 나타나지 않았다. 따라서 scopoletine 16 μM 농도 이하의 범위에서는 세포독성이 없는 것으로 관찰되었다.
- -6, 그리고 8 hr에 발현이 일어나는 TNF-α의 발현을 감소시켜 염증을 억제시키는 것으로 사료된다. 따라서 scopoletin이 과도하게 일어나는 식균작용과 NO와 PGE2의 생성을 iNOS와 COX- 2 단백질 수준에서 억제하여 염증의 진행을 막고, 염증 반응을 활성화 시키는 IL-1β, TNF-α, IL-6 같은 염증성 매개인자의 발현을 억제하여 만성 염증을 억제하는 것으로 사료된다. 이러한 연구결과를 바탕으로 scopoletin이 만성 염증을 억제시키는 새로운 생의학 소재로 이용될 수 있으리라 기대된다.
- -1 β, IL-6을 억제하는 것으로 나타났다. 또한 TNF-α의 발현을 8 hr 및 24 hr에서 조사한 결과 8h에서 발현이 감소하는 것으로 나타났다. 이는 scopoletin이 염증성 cytokine인 IL-1β, Ⅱ.
- 7에서도 억제 효능을 나타냈다[20]. 본 연구에서 LPS로 자극된 Raw264.7 세포에서 scopoletine NO의 생성을 억제하는 것으로 나타났다. 또한 NO와 PGE2는 각각 NOS와 COX-2에 의해서 생산된다[34].
- [28]. 본 연구에서 scopoeltine LPS로 자극된 Raw264.7 세포에서 농도가 증가함에 따라 iNOS와 COX-2의 발현을 감소시키는 것으로 나타났다. 이는 scopoletin이 NO와 PGE를 감소시키는 것이 단백질 발현감소에서 기인한 것으로 사료된다.
- 따라서 염증매개체의 분비가 증가할수록 식균작용도 증가하므로 만성적으로 지속되는 염증을 억제하기 위해서는 식균작용을 억제시켜야 한다. 본 연구에서 scopoeltine LPS로 자극된 Raw264.7 세포에서 농도가 증가함에 따라 macrophage의 식균작용을감소시키는 것으로 나타났다. 식균작용이 계속 지속된다면 염증이 만성적으로 일어나고 있는 것 인데, scopoletine 이러한식균작용을 감소시켜 만성적으로 일어나는 염증을 억제 시킬것으로 사료된다.
후속연구
- 따라서 scopoletin이 과도하게 일어나는 식균작용과 NO와 PGE2의 생성을 iNOS와 COX- 2 단백질 수준에서 억제하여 염증의 진행을 막고, 염증 반응을 활성화 시키는 IL-1β, TNF-α, IL-6 같은 염증성 매개인자의 발현을 억제하여 만성 염증을 억제하는 것으로 사료된다. 이러한 연구결과를 바탕으로 scopoletin이 만성 염증을 억제시키는 새로운 생의학 소재로 이용될 수 있으리라 기대된다.
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