옥수수는 세계적으로 가장 중요한 작물이다. 옥수수의 소비가 꾸준히 증가하고 있지만, 생산량은 연작과 Fusarium spp.와 같은 토양전염성 곰팡이병의 감염에 의해 줄어들고 있다. 최근에 우리나라를 포함해 전 세계적으로 F. subglutinans와 F. temperatum에 의해 발생되는 옥수수 밑둥썩음병의 발생이 많이 보고되고 있다. 본 연구에서는 병에 걸리지 않은 건전한 옥수수 토양 근권에서 F. subglutinans와 F. temperatum에 대치배양을 통해 항균활성을 보이는 3 균주(GC02, GC07, GC08)를 선발하였다. 선발된 3 균주 중 GC02와 GC07이 균사생장을 효과적으로 억제하였다. 그리고 16s rRNA에 기반하여 분석한 결과, GC02는 Bacillus methylotrophicus, GC07은 B. amyloliquefaciens 그리고 GC08은 B. thuringiensis로 동정되었다. 또한, GC02와 GC07은 포자발아의 억제에도 효과적이었다. 3개의 Bacillus 균주들은 모두 protease의 활성이 강하게 나타났으며, cellulase 활성은 GC07과 GC08에서만 나타났다. 그리고 불용성 인산의 가용화와 siderophore의 생산은 GC02와 GC07이 비교적 GC08에 비해 우수한 것으로 나타났다. 옥수수 줄기에 2개의 Fusarium과 접종하여 발병억제효과를 검정한 결과 B. amyloliquefaciens GC07이 가장 효과적인 방제효과를 나타내었다. 또한 B. methylotrophicus GC02와 B. amyloliquefaciens GC07은 다른 식물병원성 진균들도 효과적으로 균사생장을 억제하였다. 따라서, B. methylotrophicus GC02와 B. amyloliquefaciens GC07은 식물병원성 진균방제에 생물학적 방제제로서 역할이 가능하다고 판단된다.
옥수수는 세계적으로 가장 중요한 작물이다. 옥수수의 소비가 꾸준히 증가하고 있지만, 생산량은 연작과 Fusarium spp.와 같은 토양전염성 곰팡이병의 감염에 의해 줄어들고 있다. 최근에 우리나라를 포함해 전 세계적으로 F. subglutinans와 F. temperatum에 의해 발생되는 옥수수 밑둥썩음병의 발생이 많이 보고되고 있다. 본 연구에서는 병에 걸리지 않은 건전한 옥수수 토양 근권에서 F. subglutinans와 F. temperatum에 대치배양을 통해 항균활성을 보이는 3 균주(GC02, GC07, GC08)를 선발하였다. 선발된 3 균주 중 GC02와 GC07이 균사생장을 효과적으로 억제하였다. 그리고 16s rRNA에 기반하여 분석한 결과, GC02는 Bacillus methylotrophicus, GC07은 B. amyloliquefaciens 그리고 GC08은 B. thuringiensis로 동정되었다. 또한, GC02와 GC07은 포자발아의 억제에도 효과적이었다. 3개의 Bacillus 균주들은 모두 protease의 활성이 강하게 나타났으며, cellulase 활성은 GC07과 GC08에서만 나타났다. 그리고 불용성 인산의 가용화와 siderophore의 생산은 GC02와 GC07이 비교적 GC08에 비해 우수한 것으로 나타났다. 옥수수 줄기에 2개의 Fusarium과 접종하여 발병억제효과를 검정한 결과 B. amyloliquefaciens GC07이 가장 효과적인 방제효과를 나타내었다. 또한 B. methylotrophicus GC02와 B. amyloliquefaciens GC07은 다른 식물병원성 진균들도 효과적으로 균사생장을 억제하였다. 따라서, B. methylotrophicus GC02와 B. amyloliquefaciens GC07은 식물병원성 진균방제에 생물학적 방제제로서 역할이 가능하다고 판단된다.
Maize (Zea mays L.) is an economically important crop in worldwide. While the consumption of the maize is steadily increasing, the yield is decreasing due to continuous mono-cultivation and infection of soil-borne fungal pathogens such as Fusarium species. Recently, stalk rot disease in maize, cause...
Maize (Zea mays L.) is an economically important crop in worldwide. While the consumption of the maize is steadily increasing, the yield is decreasing due to continuous mono-cultivation and infection of soil-borne fungal pathogens such as Fusarium species. Recently, stalk rot disease in maize, caused by F. subglutinans and F. temperatum has been reported in Korea. In this study, we isolated bacterial isolates in rhizosphere soil of maize and subsequently tested for antagonistic activities against F. subglutinans and F. temperatum. A total of 1,357 bacterial strains were isolated from rhizosphere. Among them three bacterial isolates (GC02, GC07, GC08) were selected, based on antagonistic effects against Fusarium species. The isolates GC02 and GC07 were most efficient in inhibiting the mycelium growth of the pathogens. The three isolates GC02, GC07 and GC08 were identified as Bacillus methylotrophicus, B. amyloliquefaciens and B. thuringiensis using 16S rRNA sequence analysis, respectively. GC02 and GC07 bacterial suspensions were able to suppress over 80% conidial germination of the pathogens. GC02, GC07 and GC08 were capable of producing large quantities of protease enzymes, whereas the isolates GC07 and GC08 produced cellulase enzymes. The isolates GC02 and GC07 were more efficient in phosphate solubilization and siderophore production than GC08. Analysis of disease suppression revealed that GC07 was most effective in suppressing the disease development of stalk rot. It was also found that B. methylotrophicus GC02 and B. amyloliquefaciens GC07 have an ability to inhibit the growth of other plant pathogenic fungi. This study indicated B. methylotrophicus GC02 and B. amyloliquefaciens GC07 has potential for being used for the development of a biological control agent.
Maize (Zea mays L.) is an economically important crop in worldwide. While the consumption of the maize is steadily increasing, the yield is decreasing due to continuous mono-cultivation and infection of soil-borne fungal pathogens such as Fusarium species. Recently, stalk rot disease in maize, caused by F. subglutinans and F. temperatum has been reported in Korea. In this study, we isolated bacterial isolates in rhizosphere soil of maize and subsequently tested for antagonistic activities against F. subglutinans and F. temperatum. A total of 1,357 bacterial strains were isolated from rhizosphere. Among them three bacterial isolates (GC02, GC07, GC08) were selected, based on antagonistic effects against Fusarium species. The isolates GC02 and GC07 were most efficient in inhibiting the mycelium growth of the pathogens. The three isolates GC02, GC07 and GC08 were identified as Bacillus methylotrophicus, B. amyloliquefaciens and B. thuringiensis using 16S rRNA sequence analysis, respectively. GC02 and GC07 bacterial suspensions were able to suppress over 80% conidial germination of the pathogens. GC02, GC07 and GC08 were capable of producing large quantities of protease enzymes, whereas the isolates GC07 and GC08 produced cellulase enzymes. The isolates GC02 and GC07 were more efficient in phosphate solubilization and siderophore production than GC08. Analysis of disease suppression revealed that GC07 was most effective in suppressing the disease development of stalk rot. It was also found that B. methylotrophicus GC02 and B. amyloliquefaciens GC07 have an ability to inhibit the growth of other plant pathogenic fungi. This study indicated B. methylotrophicus GC02 and B. amyloliquefaciens GC07 has potential for being used for the development of a biological control agent.
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문제 정의
따라서 본 연구에서는 병이 발생하지 않은 건전한 옥수수 포장에서 미생물을 분리하여 F. subglutinans와 F. temperatum에 항균활성을 보이는 길항미생물을 동정하고 조사함으로써 옥수수 밑둥썩음병을 방제할 수 있는 생물학적 방제제로의 효과를 평가하였다.
옥수수 밑둥썩음병원균 2종을 비롯한 대부분의 식물병원성 곰팡이들은 발아하여 부착기를 형성하고 식물체 표면을 뚫고 들어감으로써 병을 일으킨다(Howard와 Ferrari, 1989). 따라서 선발된 길항미생물이 포자의 발아를 억제할 수 있는지 알아보았다(Fig. 3). 그 결과 B.
temperatum은 유전적으로 매우 가까운 관계에 있다(Scauflaire 등, 2011). 따라서 옥수수 밑둥썩음병원균에 항균활성을 보인 세 균주의 적용범위를 알아보기 위하여 다른 식물병원성 진균들과 대치배양을 수행 하였다(Table 1). 시험에 사용된 식물병원성 진균들은 Sordariomycetes, Ascomycetes, Leotiomycetes로 서로 다른 강(Class) 으로 선발하였다.
길항미생물은 진균의 외막을 분해할 수 있는 가수분해효소를 이용하여 식물병원균의 세포벽을 분해시키는 용균작용을 통해 항균활성을 보인다. 따라서 항균활성을 보이는 3개의 균주에 대하여 세균이 내는 가수분해효소 중 cellulase와 protease의 활성을 갖는지 확인해 보았다. 그 결과 B.
제안 방법
25ºC에서 15일간 배양한 후 clear zone 형성 유무로 인산가용 활성을 검정하였다.
Phylogenetic tree based on 16s rRNA sequences of bacterial isolates. DNA sequences from the NCBI nucleotide database were aligned using the ClustalW program in MEGA 6.0, and constructed using the neighbor-joining method with 1,000 bootstrap replicates. The scale bar indicates the number of differences in nucleotide substitutions per sequences.
PCR 산물은 1×TAE(Tris-acetate-EDTA) buffer를 이용하여 1% agarose gel에서 30분간 전기영동 후 ethidium bromide로 염색하여 UV-transilluminator에서 밴드를 확인하였다.
Proteolytic 활성을 알아보기 위해 3% skim milk powder가 첨가된 LB 배지를 만들어 위와 같은 방법으로 세균을 접종하고 3일간 배양한 뒤, clear zone 형성을 관찰하여 protease 활성을 검정하였다.
고압 멸균된 두 용액을 50ºC로 식힌 후 천천히 거품이 나지 않도록 섞어주고 petridish에 분주하여 CAS 평판배지를 만들었다.
준비된 포자현탁액과 길항미생물을 각각 20 ml씩 잘라낸 줄기 한쪽부분에 피펫을 이용하여 주입하였으며 발병을 유도하였다. 그리고 10일 후에 발병도를 측정하였다. 발병도는 줄기에 전반된 병징의 크기에 따라 0에서 4까지 disease index로 분류하여 0은 0%, 1은 1-25%, 2는 26-50%, 3은 51-75%, 4는 76-100% 나타내며, 각각에 대해서 3반복으로 3차례 시험하였다.
0으로 맞춘 20 ml의 길항미생물 배양액을 접종하여 25ºC에서 3일간 배양하였다. 그리고 petridish에서 배지를 꺼내어 0.1% congo red 용액에 15-20분 동안 배지를 담가 염색하고, 1M NaCl 용액에 15-20분 동안 배지를 담가두고 탈색시켜 clear zone 형성을 관찰하여 cellulase 활성을 검정하였다.
배양 10일 후에 포자 현탁액을 얻어 혈구계산판(hemocytometer)을 이용하여 1×104 conidia/ml의 농도로 맞추었다. 그리고 길항미생물을 배양하여 O.D 값 1.0으로 조정한후, 포자 현탁액에 각각 10배, 100배, 1000배로 희석한 길항미생물을 넣어 주었다. 그리고 포자발아를 유도하기 위하여 소수성 표면의 slide glass 위에 올려놓고 25ºC에서 습실 처리하여 배양하였고 8시간 후에 포자의 발아율을 측정하였다.
1)와 일치하는 결과를 나타내었다. 그리고 불용성 인산의 분해능력을 갖는지 알아보기 위하여 인산이 함유된 배지를 이용하여 검정하였다. 그 결과 siderophore 활성과 같은 3개 균주에서 모두 clear zone을 보였지만 B.
그리고 포자발아를 유도하기 위하여 소수성 표면의 slide glass 위에 올려놓고 25ºC에서 습실 처리하여 배양하였고 8시간 후에 포자의 발아율을 측정하였다.
옥수수를 이용한 방제효과검정. 길항미생물을 이용하여 옥수수 밑둥썩음병원균에 대한 방제효과를 알아보기 위하여 3-4주 정도 키운 옥수수(미백) 줄기의 아래 부분을 잘라내어 사용하였다. 병원균은 PDA 배지에 접종하여 포자 형성을 유도하였다.
길항미생물이 난용성 인산염을 분해할 수 있는지 알아보기 위하여 불용성 인산이 포함된 Pikovskaya’s agar 배지를 이용하여 활성 검정을 하였다.
길항미생물의 배양은 LB-broth(Duchefa, Netherlands) 배지에 28ºC, 200 rpm으로 24시간 진탕 배양하였다. 대치배양을 위하여 LPA(LB 50%+PDA 50%) 배지를 만들어 4 mm 직경의 병원균 agar plug를 한 가운데 접종하였다. 그리고 주변 3곳에 cork borer를 이용하여 4 mm 직경의 구멍을 내었다.
그리고 10일 후에 발병도를 측정하였다. 발병도는 줄기에 전반된 병징의 크기에 따라 0에서 4까지 disease index로 분류하여 0은 0%, 1은 1-25%, 2는 26-50%, 3은 51-75%, 4는 76-100% 나타내며, 각각에 대해서 3반복으로 3차례 시험하였다. 방제가는 (무처리구발병도-처리구발병도)/무처리구발병도×100의 계산식에 의해 계산하였다.
배양 10일 후에 포자 현탁액을 얻어 혈구계산판(hemocytometer)을 이용하여 1×104 conidia/ml의 농도로 맞추었다.
발아율 억제 검정. 병원균 포자에서 발아가 억제되는지 알아보기 위하여 병원균을 PDA 배지에 접종하여 포자 형성을 유도하였다. 배양 10일 후에 포자 현탁액을 얻어 혈구계산판(hemocytometer)을 이용하여 1×104 conidia/ml의 농도로 맞추었다.
병원균과 길항미생물이 접종된 LPA 배지는 25ºC 배양기에서 7일 동안 빛을 차단하여 배양하였으며, 길항미생물이 균사생장을 억제한 거리를 3반복으로 3차례 시험하여 측정하였다.
길항미생물을 이용하여 옥수수 밑둥썩음병원균에 대한 방제효과를 알아보기 위하여 3-4주 정도 키운 옥수수(미백) 줄기의 아래 부분을 잘라내어 사용하였다. 병원균은 PDA 배지에 접종하여 포자 형성을 유도하였다. 배양 10일 후에 포자 현탁액을 얻어 혈구계산판을 이용하여 4×104 conidia/ml의 농도로 맞추었다.
병원균의 보관을 위하여 PDA(MB cell, South Korea) 배지에 각각 접종하여 25ºC 배양기에서 10일간 배양하였다.
옥수수를 이용한 방제효과검정. 선발된 길항미생물 3종과 옥수수 밑둥썩음병원균 2종을 옥수수에 동시 접종하여 방제효과를 검정하였다(Fig. 5). 옥수수 밑둥썩음병균의 병징은 줄기부분이 썩어 연한 갈색이 되고 세로로 갈색 줄무늬(brown streak)가 나타난다(Reid와 Zhu, 2004).
시료에서 길항 미생물의 분리를 위하여 토양 1 g과 생리식염수(NaCl 0.85%) 9 ml을 섞고 1.5 ml tube에 10-3-10-5의 농도로 희석하여 LB agar(Duchefa, 네덜란드) 배지에 도말하고 28ºC에서 1일 동안 배양하였다.
식물병원균에 대한 억제효과와 더불어 식물생장촉진에 도움을 주는 PGPR(Plant growth promoting rhizobacteria)의 역할을 할 수 있는지 알아보기 위하여 siderophore의 생성을 CAS 평판배지를 이용하여 검정하였다. 그 결과 B.
gov)에서 BLASTN 프로그램을 이용하여 분석하였다. 염기서열 비교를 위해, MEGA 6의 ClusterW를 이용하여 염기서열을 정렬하였으며, 1,000 bootstrap으로 neighbor-joining 방법을 이용하여 phylogenetic tree를 완성하였다.
PCR 산물은 1×TAE(Tris-acetate-EDTA) buffer를 이용하여 1% agarose gel에서 30분간 전기영동 후 ethidium bromide로 염색하여 UV-transilluminator에서 밴드를 확인하였다. 확인된 밴드는 MEGA-spinTM Agarose Gel Extraction Kit(Intron, Korea)의 방법에 따라 정제한 후 염기서열 분석을 위해 시퀀싱 분석서비스(Macrogen, South Korea)를 이용하였다. 분석된 염기서열은 NCBI(http://www.
대상 데이터
길항미생물의 chromosomal DNA 추출은 3 ml의 LB 배지에서 16시간 동안 배양시킨 배양액으로 Wizard genomic DNA purification kit(Promega, USA)의 방법에 따라 추출하였다. 16s rRNA 부분의 증폭을 위하여 universal primer인 27F와 1492R primer를 이용하였다. PCR은 2720 Thermal Cycler(Applied Biosystems, UK)를 사용하여 98ºC에서 10초의 denaturation 후 98ºC에서 10초, 55ºC에서 30초, 72ºC에서 1분 과정을 35회 반복한 후 마지막으로 72ºC에서 7분간 반응시켰다.
시험에 사용된 식물병원성 진균들은 Sordariomycetes, Ascomycetes, Leotiomycetes로 서로 다른 강(Class) 으로 선발하였다. Sordariomycetes에 시들음병을 발생시키는 F. oxysporum, 키다리병의 원인균인 F. fujikuroi, 도열병을 일으키는 Magnaporthe oryzae, 탄저병을 일으키는 Colletotrichum acutaum을 사용하였고, Ascomycetes에는 깨씨무늬병을 일으키는 Cochliobolus heterostrophus, 그리고 Leotiomycetes에는 잿빛곰팡이병을 일으키는 Botrytis cinerea를 사용하였다. 그 결과 B.
길항미생물의 선발 및 동정. 강원도 홍천에 위치한 옥수수 밑둥썩음병이 발생하지 않은 건전한 옥수수 포장에서 토양시료를 채취하여 미생물들을 분리하였다. 분리된 미생물들은 밑둥썩음병원균 2종(F.
본 연구에서 사용한 옥수수 밑둥썩음병은 이전 연구(Shin 등, 2014b)에서 분리 및 동정된 F. subglutinans(KWF-17)와 F. temperatum(KWF-14)을 사용하였다. 병원균의 보관을 위하여 PDA(MB cell, South Korea) 배지에 각각 접종하여 25ºC 배양기에서 10일간 배양하였다.
강원도 홍천에 위치한 옥수수 밑둥썩음병이 발생하지 않은 건전한 옥수수 포장에서 토양시료를 채취하여 미생물들을 분리하였다. 분리된 미생물들은 밑둥썩음병원균 2종(F. subglutinas, F. temperatum)과 대치배양을 통해 항균활성을 보이는 길항미생물을 선발하였다(Fig. 1A). 분리된 식물근권미생물 1,357개 중 서로 다른 모양의 콜로니 20개를 선발하고 대치배양한 결과 3개의 균주가 항균활성을 나타내었으며, 그 중 가장 효과가 좋은 GC02는 F.
따라서 옥수수 밑둥썩음병원균에 항균활성을 보인 세 균주의 적용범위를 알아보기 위하여 다른 식물병원성 진균들과 대치배양을 수행 하였다(Table 1). 시험에 사용된 식물병원성 진균들은 Sordariomycetes, Ascomycetes, Leotiomycetes로 서로 다른 강(Class) 으로 선발하였다. Sordariomycetes에 시들음병을 발생시키는 F.
미생물 분리 및 병원균 준비. 항균활성을 보이는 토양미생물을 분리하기 위하여 병이 발생하지 않은 강원도 홍천 지역의 옥수수 재배지에서 토양시료를 채취하였다. 시료에서 길항 미생물의 분리를 위하여 토양 1 g과 생리식염수(NaCl 0.
데이터처리
길항미생물 처리를 통한 병원균의 균사생장과 발아율 억제 그리고 옥수수 줄기를 이용한 방제효과검정의 각 처리구 평균간의 차이에 의한 유의성 검정은 SAS 9.3(SAS Institute Inc, USA)을 이용한 Duncan의 다중검정방법(Duncan’s multiple range test)으로 5% 수준에서 통계 분석하였다.
확인된 밴드는 MEGA-spinTM Agarose Gel Extraction Kit(Intron, Korea)의 방법에 따라 정제한 후 염기서열 분석을 위해 시퀀싱 분석서비스(Macrogen, South Korea)를 이용하였다. 분석된 염기서열은 NCBI(http://www.ncbi.nlm.nih.gov)에서 BLASTN 프로그램을 이용하여 분석하였다. 염기서열 비교를 위해, MEGA 6의 ClusterW를 이용하여 염기서열을 정렬하였으며, 1,000 bootstrap으로 neighbor-joining 방법을 이용하여 phylogenetic tree를 완성하였다.
이론/모형
Cellulase 활성을 알아보기 위해 CMC agar 배지를 Sazci 등(1986)에서 사용한 방법을 사용하였으며, 만든 배지에 cork borer를 이용하여 직경 4 mm의 구멍을 뚫어, O.D 값 1.0으로 맞춘 20 ml의 길항미생물 배양액을 접종하여 25ºC에서 3일간 배양하였다.
Siderophore 활성을 알아보기 위해 간단하게 변형된 CAS(Chrome Azurol Sulfonate) assay를 사용하였다. CAS(sigma, USA) 염료용액은 증류수 50 ml에 CAS 60.
길항미생물의 동정. 길항미생물의 chromosomal DNA 추출은 3 ml의 LB 배지에서 16시간 동안 배양시킨 배양액으로 Wizard genomic DNA purification kit(Promega, USA)의 방법에 따라 추출하였다. 16s rRNA 부분의 증폭을 위하여 universal primer인 27F와 1492R primer를 이용하였다.
방제가는 (무처리구발병도-처리구발병도)/무처리구발병도×100의 계산식에 의해 계산하였다.
길항미생물이 난용성 인산염을 분해할 수 있는지 알아보기 위하여 불용성 인산이 포함된 Pikovskaya’s agar 배지를 이용하여 활성 검정을 하였다. 본 배지는 Gaind와 Gaur(1991)의 방법으로 만들었으며, 위와 같은 방법으로 세균 배양액을 접종하였다. 25ºC에서 15일간 배양한 후 clear zone 형성 유무로 인산가용 활성을 검정하였다.
성능/효과
8%로 발아억제율이 급격히 감소하는 것을 알 수 있었다. B. methylotrophicus GC02는 B. amyloliquefaciens GC07과 유사하지만 비교적 낮은 억제율을 보였다. B.
amyloliquefaciens GC07과 유사하지만 비교적 낮은 억제율을 보였다. B. thuringiensis GC08은 두 균주와 비교하여 낮은 발아억제율을 보였으며, 1,000배 희석하여 처리한 경우에는 대부분의 포자에서 발아하여 억제효과가 없는 것으로 보였다(Fig. 3).
aDisease severity was measured based on lesion size and assessed on a 0-4 scale, where 0, 0%; 1, 1-25%; 2, 26-50%; 3, 51-75%; and 4, 76-100% lesions.
따라서 항균활성을 보이는 3개의 균주에 대하여 세균이 내는 가수분해효소 중 cellulase와 protease의 활성을 갖는지 확인해 보았다. 그 결과 B. amyloliquefaciens GC07과 B. thuringiensis GC08은 cellulose를 분해하여 clear zone이 확인이 되었고, B. methylotrophicus GC02는 분해 능력이 없었다. 그리고 단백질이 포함된 배지를 이용하여 protease의 활성을 검정한 결과 3개 균주에서 모두 단백질을 분해하였다(Fig.
fujikuroi, 도열병을 일으키는 Magnaporthe oryzae, 탄저병을 일으키는 Colletotrichum acutaum을 사용하였고, Ascomycetes에는 깨씨무늬병을 일으키는 Cochliobolus heterostrophus, 그리고 Leotiomycetes에는 잿빛곰팡이병을 일으키는 Botrytis cinerea를 사용하였다. 그 결과 B. amyloliquefaciens GC07이 6가지 식물병원균에 대해 우수한 항균활성을 보였는데, 특이적으로 Sodariomycetes에 속하는 종들에 더 강한 활성을 보였다(Table 1). 다음으로 B.
3). 그 결과 B. amyloliquefaciensGC07배양액(O.D1.0 10배희석)을 F. subglutinans 와 F. temperatum에 처리하였을 때 각각 98.1%와 96.8%로 대부분 포자가 발아하지 못하였다. 그리고 100배 희석하여 처리할 경우 각각 86.
식물병원균에 대한 억제효과와 더불어 식물생장촉진에 도움을 주는 PGPR(Plant growth promoting rhizobacteria)의 역할을 할 수 있는지 알아보기 위하여 siderophore의 생성을 CAS 평판배지를 이용하여 검정하였다. 그 결과 B. methylotrophicus GC02와 B. amyloliquefaciens GC07에서 siderophore의 강한 활성을 나타내었다(Fig. 4). B.
그리고 불용성 인산의 분해능력을 갖는지 알아보기 위하여 인산이 함유된 배지를 이용하여 검정하였다. 그 결과 siderophore 활성과 같은 3개 균주에서 모두 clear zone을 보였지만 B. methylotrophicus GC02와 B. amyloliquefaciens GC07에서 강한 활성을 나타내었다(Fig. 4). 식물근권에 존재하는 길항미생물은 식물병원균의 생육을 저해하는 경쟁적 길항작용의 일환으로 철(Fe3+) 성분 결합물질인 siderophore를 생산하여 토양 전염병을 감소시키고 기주식물의 근권 정착능력을 촉진함으로써 식물의 성장을 촉진하여 수확량을 증대 할 수 있다(Bagg와 Neilands, 1987; Kloepper 등, 1980).
5%의 낮은 방제효과를 나타내었다. 그리고 F. temperatum에 대해서는 B. amyloliquefaciens GC07이 72.7%의 높은 방제효과를 보였으며, B. methylotrophicus GC02는 69.1%, B. thuringiensis GC08은 가장 낮은 36.1%로 나타났다. 이러한 결과는 대치배양을 통한 균사생장억제효과 검정(Fig.
7 mm의 균사생장을 억제하였다. 그리고 GC07은 각각 11.3 mm와 10.3 mm의 균사생장을 억제하였으며, GC08은 4.7 mm와 2.0 mm로 GC02와 GC07에 비해 약한 억제효과를 보이는 것으로 나타났다(Fig. 1B). 항균활성을 보인 3개의 길항미생물들에 대해서 16s rRNA 염기서열 분석을 통한 분류 및 동정을 진행한 결과 GC02는 Bacillus methylotrophicus, GC07은 B.
methylotrophicus GC02는 분해 능력이 없었다. 그리고 단백질이 포함된 배지를 이용하여 protease의 활성을 검정한 결과 3개 균주에서 모두 단백질을 분해하였다(Fig. 4). Bacillus spp.
amyloliquefaciens GC07이 6가지 식물병원균에 대해 우수한 항균활성을 보였는데, 특이적으로 Sodariomycetes에 속하는 종들에 더 강한 활성을 보였다(Table 1). 다음으로 B. methylotrophicus GC02도 폭넓은 항균활성 스펙트럼을 갖는 것을 확인하였다. 이와 같은 결과로 B.
특히, amylases, proteases, lipases 등의 효소들은 이미 산업적으로도 이용하고 있다(Barros 등, 2013). 본 연구에서 B. amyloliquefaciens GC07과 B. thuringiensis GC08은 cellulase와 protease의 활성은 비슷하였지만 대치배양을 통한 항균활성(Fig. 1)에서 차이를 보였다. 이것은 cellulase와 protease의 효소 이외의 다른 효소들과 생성되는 항생물질 차이에 의한 결과로 보이며, 추가연구를 통해 분비하는 항생물질에 대한 분석도 필요한 것으로 사료된다.
길항미생물의 항생물질에 의한 병원성 미생물 생장 억제와 더불어, 길항미생물은 시데로포어(Siderophore)의 생산, 불용성인산의 분해(Phophate solubilization), 질소고정능력(Nitrogen fixation), ACC(1-Aminocyclopropane-1-carboxylate deaminase)의 생산, 쿼럼센싱(quorum sensing) 신호교란이나 생물막(biofilm) 합성 저해, 휘발성 유기물질생산 그리고 병원균 독소생성 억제 등을 통하여 병원성 미생물을 억제하거나 식물의 생장을 촉진하는 것으로 알려져 있다(Bhattacharyya와 Jha, 2012). 본 연구에서 다양한 식물병원균에 우수한 항균활성을 보인 B. methylotrophicus GC02와 B. amyloliquefaciens GC07는 높은 시데로포어의 활성을 나타났다(Fig. 4). 시데로포어는 salicylic acid 또는 jasmonic acid와 ethylene 등 식물호르몬 생산을 유도하여 식물의 유도전신저항성(Induced systemic resistance)을 일으키는 역할을 하는 것으로도 알려져 있다(Annapurna 등, 2013; Beneduzi 등, 2012).
따라서 선발된 길항미생물의 처리를 통해 난용성 인산염을 분해하여 식물이 직접적으로 사용가능한 영양원으로 가용화시켜 공급해줌으로써 생장촉진효과를 볼 수 있다(Rodrıguez와 Fraga, 1999). 본 연구에서 분리된 B. methylotrophicus GC02와 B. amyloliquefaciens GC07은 siderophore에 강한 활성을 보이며 불용성 인산을 분해하여 항균작용뿐만 아니라 식물의 생장에도 도움을 줄 수 있을 것으로 보여 진다.
에 대한 개발이 증가하고 있다(Borriss, 2011; Qiao 등, 2014). 본 연구에서 옥수수 밑둥썩음병 2 종(F. subglutinans and F. temperatum)에 우수한 항균활성을 보이는 균주는 B. methylotrophicus GC02와 B. amyloliquefaciens GC07으로 나타났다(Fig. 1). B.
1A). 분리된 식물근권미생물 1,357개 중 서로 다른 모양의 콜로니 20개를 선발하고 대치배양한 결과 3개의 균주가 항균활성을 나타내었으며, 그 중 가장 효과가 좋은 GC02는 F. subglutinans와 F. temperatum에 대하여 각각 11.7 mm와 10.7 mm의 균사생장을 억제하였다. 그리고 GC07은 각각 11.
Fusarium spp.에 대한 길항미생물의 방제가를 알아보기 위해 동시 접종한 결과, B. amyloliquefaciens GC02와 B. methylotrophicus GC07은 F. subglutinans에 대하여 각각 87.2%와 79.7%의 우수한 방제효과를 나타냈으며, B. thuringiensis GC08은 61.5%의 낮은 방제효과를 나타내었다. 그리고 F.
옥수수 밑둥썩음병균의 병징은 줄기부분이 썩어 연한 갈색이 되고 세로로 갈색 줄무늬(brown streak)가 나타난다(Reid와 Zhu, 2004). 이러한 병징의 전반정도를 관찰한 결과 F. temperatum의 무처리구 disease index가 3.0으로 2.92의 F. subglutinans보다 강한 병원성을 갖는 것을 확인하였다(Table 2). 이러한 결과는 F.
1B). 항균활성을 보인 3개의 길항미생물들에 대해서 16s rRNA 염기서열 분석을 통한 분류 및 동정을 진행한 결과 GC02는 Bacillus methylotrophicus, GC07은 B. amyloliquefaciens, 그리고 GC08은 B. thuringiensis로 분류되었다(Fig. 2).
후속연구
일지라도 strain에 따라 각각 분비하는 항생물질이 다르고 항균활성의 효과가 다를 수 있다는 것을 의미한다. 따라서 식물병원성 진균에 효과가 우수한 길항미생물의 탐색과 신규 항균물질에 대한 지속적인 연구가 필요할 것으로 사료된다.
시데로포어는 salicylic acid 또는 jasmonic acid와 ethylene 등 식물호르몬 생산을 유도하여 식물의 유도전신저항성(Induced systemic resistance)을 일으키는 역할을 하는 것으로도 알려져 있다(Annapurna 등, 2013; Beneduzi 등, 2012). 따라서 옥수수에 발생하는 밑둥썩음병 방제를 위해 등록된 살균제가 없는 가운데 건전한 옥수수 근권에서 분리한 B. methylotrophicus GC02와 B. amyloliquefaciens GC07을 이용하여 옥수수 밑둥썩음병 방제 및 친환경농업에 적용할 수 있을 것으로 보이며, 추후 포장시험을 통한 미생물제제로의 개발이 가능할 것으로 사료된다.
1)에서 차이를 보였다. 이것은 cellulase와 protease의 효소 이외의 다른 효소들과 생성되는 항생물질 차이에 의한 결과로 보이며, 추가연구를 통해 분비하는 항생물질에 대한 분석도 필요한 것으로 사료된다.
methylotrophicus GC02도 폭넓은 항균활성 스펙트럼을 갖는 것을 확인하였다. 이와 같은 결과로 B. methylotrophicus GC02와 B. amyloliquefaciens GC07을 이용하여 옥수수 밑둥썩음병을 포함한 다른 식물병원성 진균 방제에 적용 할 수 있을 것으로 판단되었다.
질의응답
핵심어
질문
논문에서 추출한 답변
옥수수란?
옥수수(Zea mays L.)는 세계 3대 식량작물에 속하며 재배 면적당 수량성이 뛰어나 전 세계적으로 중요한 식량자원이다 (Varshney 등, 2012). 최근에는 식량 및 사료 외에도 시약, 화장품, 도료, 인쇄, 제지업 등의 산업원료로 사용되며, 미국 등 선진국에서 친환경에너지 개발에 따른 바이오 에탄올 연료로의 사용이 매년 증가하여 옥수수의 가치가 높아지고 안정적인 생산이 중요해 지고 있다(Hertel 등, 2010; Kim 등, 2002).
국내 옥수수에서 발생하는 병해는?
옥수수에는 많은 종류의 병해가 발생하고 있으며, 한국식물병목록(2004)에 의하면 국내에 발생하는 진균병은 Exserohilum turcicum에 의한 매문병(Northern leaf blight), Cochliobolus heterostrophus에의한깨씨무늬병(Southern leaf blight),Ustilago zeae에 의한 깜부기병(Smut), Puccinia sorghi에 의한 녹병(Rust) 등 13종이 보고되었다. 이 중에서 Fusarium spp.
F. subglutinans와 F. temperatum이 야기하는 문제점은?
subglutianans와 유사하지만 또 다른 종으로서 유럽의 벨기에(Scauflaire 등, 2012), 스페인(Varela 등, 2013), 인근의 중국(Wang 등, 2014) 그리고 남미의 아르헨티나(Fumero 등, 2015) 등 최근 들어 전 세계적으로 보고되고 있다. 이 두 병원균은 옥수수 생육 전반에 걸쳐 뿌리, 줄기, 이삭 등에 썩음병을 일으키는 주요 병원성 진균으로 옥수수의 품질과 수량을 저하시켜 옥수수 생산량에 큰 피해를 주고 있다. 또한 fumonisin, moniliformin, beauvericin, fusaproliferin, fusaric acid 등의 진균독소를 생성하여 심각한 피해를 초래한다(Lew 등, 1996; Scauflaire 등, 2012).
참고문헌 (52)
Annapurna, K., Kumar, A., Kumar, L. V., Govindasamy, V., Bose, P. and Ramadoss, D. 2013. PGPR-Induced Systemic Resistance (ISR) in Plant Disease Management Bacteria in Agrobiology: Disease Management. pp. 405-425. Springer.
Arrebola, E., Jacobs, R. and Korsten, L. 2010. Iturin A is the principal inhibitor in the biocontrol activity of Bacillus amyloliquefaciens PPCB004 against postharvest fungal pathogens. J. Appl. Microbiol. 108: 386-395.
Barros, F. F. C., Simiqueli, A. P. R., de Andrade, C. J. and Pastore, G. M. 2013. Production of enzymes from agroindustrial wastes by biosurfactant-producing strains of Bacillus subtilis. Biotechnol. Res. Int. 2013: 9.
Beneduzi, A., Ambrosini, A. and Passaglia, L. M. 2012. Plant growthpromoting rhizobacteria (PGPR): Their potential as antagonists and biocontrol agents. Genet. Mol. Biol. 35: 1044-1051.
Bhaskar, N., Sudeepa, E., Rashmi, H. and Selvi, A. T. 2007. Partial purification and characterization of protease of Bacillus proteolyticus CFR3001 isolated from fish processing waste and its antibacterial activities. Bioresour. Technol. 98: 2758-2764.
Borriss, R. 2011. Use of plant-associated Bacillus strains as biofertilizers and biocontrol agents in agriculture. Bacteria in agrobiology: plant growth responses. pp. 41-76. Springer.
Cavaglieri, L., Orlando, J., Rodriguez, M., Chulze, S. and Etcheverry, M. 2005. Biocontrol of Bacillus subtilis against Fusarium verticillioides in vitro and at the maize root level. Res. Microbial. 156: 748-754.
Chen, L., Wang, N., Wang, X., Hu, J. and Wang, S. 2010. Characterization of two anti-fungal lipopeptides produced by Bacillus amyloliquefaciens SH-B10. Bioresour. Technol. 101: 8822-8827.
Chitarra, G., Breeuwer, P., Nout, M., Van Aelst, A., Rombouts, F. and Abee, T. 2003. An antifungal compound produced by Bacillus subtilis YM 10-20 inhibits germination of Penicillium roqueforti conidiospores. J. Appl. Microbiol. 94: 159-166.
Crane, J., Gibson, D., Vaughan, R. and Bergstrom, G. 2013. Iturin levels on wheat spikes linked to biological control of Fusarium head blight by Bacillus amyloliquefaciens. Phytopathology 103: 146-155.
Fumero, M. V., Reynoso, M. M. and Chulze, S. 2015. Fusarium temperatum and Fusarium subglutinans isolated from maize in Argentina. Int. J. Food Microbiol. 199: 86-92.
Hertel, T. W., Golub, A. A., Jones, A. D., O'Hare, M., Plevin, R. J. and Kammen, D. M. 2010. Effects of US maize ethanol on global land use and greenhouse gas emissions: estimating marketmediated responses. BioScience 60: 223-231.
Kim, B. Y., Ahn, J. H. Weon, H. Y., Song, J., Kim, S. I. and Kim, W. G. 2012. Isolation and characterization of Bacillus species possessing antifungal activity against ginseng root rot pathogens. Korean J. Pestic. Sci. 16: 357-363.
Kim, S. L., Moon, H. G. and Ryu, Y. H. 2002. Current status and prospect of quality evaluation in maize. Korean J. Crop Sci. 47: 107-123.
Kloepper, J. W., Leong, J., Teintze, M. and Schroth, M. N. 1980. Enhanced plant growth by siderophores produced by plant growth-promoting rhizobacteria. Nature 286: 885-886.
Kriek, N., Marasas, W., Steyn, P., Van Rensburg, S. and Steyn, M. 1977. Toxicity of a moniliformin-producing strain of Fusarium moniliforme var. subglutinans isolated from maize. Food Cosmet. Toxicol. 15: 579-587.
Kwak, Y. K., Kim, I. S., Cho, M. C., Lee, S. C. and Kim, S. 2012. Growth inhibition effect of environment-friendly farm materials in Colletotrichum acutatum in vitro J. Bio-Environ. Control 21: 127-133.
Lemanceau, P. and Alabouvette, C. 1991. Biological control of Fusarium diseases by fluorescent Pseudomonas and non-pathogenic Fusarium. Crop Prot. 10: 279-286.
Lew, H., Chelkowski, J., Pronczuk, P. and Edinger, W. 1996. Occurrence of the mycotoxin moniliformin in maize (Zea mays L.) ears infected by Fusarium subglutinans (Wollenw. & Reinking) Nelson et al. Food Addit. Contam. 13: 321-324.
Madhaiyan, M., Poonguzhali, S., Kwon, S.-W. and Sa, T.-M. 2010. Bacillus methylotrophicus sp. nov., a methanol-utilizing, plantgrowth-promoting bacterium isolated from rice rhizosphere soil. Int. J. Syst. Evol. Microbiol. 60: 2490-2495.
Nawani, N. and Kaur, J. 2000. Purification, characterization and thermostability of lipase from a thermophilic Bacillus sp. J33. Mol. Cell. Biochem. 206: 91-96.
Patrick, W. and Khalid, R. 1974. Phosphate release and sorption by soils and sediments: effect of aerobic and anaerobic conditions. Science 186: 53-55.
Qiao, J. Q., Wu, H. J., Huo, R., Gao, X. W. and Borriss, R. 2014. Stimulation of plant growth and biocontrol by Bacillus amyloliquefaciens subsp. plantarum FZB42 engineered for improved action. Chem. Biol. Technol. Agric. 1: 1-14.
Sazci, A., Erenler, K. and Radford, A. 1986. Detection of cellulolytic fungi by using congo red as an indicator: a comparative study with the dinitrosalicyclic acid reagent method. J. Appl. Bacteriol. 61: 559-562.
Scauflaire, J., Gourgue, M., Callebaut, A. and Munaut, F. 2012. Fusarium temperatum, a mycotoxin-producing pathogen of maize. Eur. J. Plant Pathol. 133: 911-922.
Scauflaire, J., Gourgue, M. and Munaut, F. 2011. Fusarium temperatum sp. nov. from maize, an emergent species closely related to Fusarium subglutinans. Mycologia 103: 586-597.
Shan, H., Zhao, M., Chen, D., Cheng, J., Li, J., Feng, Z., Ma, Z. and An, D. 2013. Biocontrol of rice blast by the phenaminomethylacetic acid producer of Bacillus methylotrophicus strain BC79. Crop Prot. 44: 29-37.
Shin, J. H., Han, J. H., Kim, M. J., Kim, J. O. and Kim, K. S. 2014a. Identification of Fusarium subglutinans, the casual pathogen of corn stalk rot in Korea and investigation of effectiveness of fungicides against the pathogen. J. Agric. Life Sci. 48: 43-51.
Shin, J. H., Han, J. H., Lee, J. K. and Kim, K. S. 2014b. Characterization of the maize stalk rot pathogens Fusarium subglutinans and F. temperatum and the effect of fungicides on their mycelial growth and colony formation. Plant Pathol. J. 30: 397-406.
Sivan, A., Ucko, O. and Chet, I. 1987. Biological control of Fusarium crown rot of tomato by Trichoderma harzianum under field conditions. Plant Dis. 71: 587-592.
Smith, T. J., Blackman, S. A. and Foster, S. J. 2000. Autolysins of Bacillus subtilis: multiple enzymes with multiple functions. Microbiology 146: 249-262.
Sun, L., Lu, Z., Bie, X., Lu, F. and Yang, S. 2006. Isolation and characterization of a co-producer of fengycins and surfactins, endophytic Bacillus amyloliquefaciens ES-2, from Scutellaria baicalensis Georgi. World J. Microb. Biot. 22: 1259-1266.
The Korean Society of Plant Pathology. 2004. List of plant disease in Korea, fourth edition. pp. 45-47.
Thippeswamy, S., Girigowda, K. and Mulimani, V. 2014, Isolation and identification of ${\alpha}$ -amylase producing Bacillus sp. from dhal industry waste. Indian J. Biochem. Biophys. 43: 295-298.
Varela, C. P., Casal, O. A., Padin, M. C., Martinez, V. F., Oses, M. S., Scauflaire, J., Munaut, F., Castro, M. B. and Vazquez, J. P. 2013. First report of fusarium temperatum causing seedling blight and stalk rot on maize in Spain. Plant Dis. 97: 1252-1252.
Varshney, R. K., Ribaut, J. M. Buckler, E. S., Tuberosa, R., Rafalski, J. A. and Langridge, P. 2012. Can genomics boost productivity of orphan crops? Nat. Biotechnol. 30: 1172-1176.
Wang, J. H., Zhang, J. B., Li, H. P., Gong, A. D., Xue, S., Agboola R. S. and Liao, Y. C. 2014. Molecular identification, mycotoxin production and comparative pathogenicity of Fusarium temperatum isolated from maize in China. J. Phytopathol. 162: 147-157.
Watanabe, M., Yonezawa, T., Lee, K. I., Kumagai, S., Sugita-Konishi, Y. Goto, K. and Hara-Kudo, Y. 2011. Molecular phylogeny of the higher and lower taxonomy of the Fusarium genus and differences in the evolutionary histories of multiple genes. BMC Evol. Biol. 11: 322.
Watanabe, T., Kobori, K., Miyashita, K., Fujii, T., Sakai, H., Uchida, M. and Tanaka, H. 1993. Identification of glutamic acid 204 and aspartic acid 200 in chitinase A1 of Bacillus circulans WL-12 as essential residues for chitinase activity. J. Biol. Chem. 268: 18567-18572.
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