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문제 정의
- 대부분의 호염성 고세균은 고염환경으로 알려진 천일염전(solar saltern), 염호수(salt lake)를 비롯한 다양한 환경에서 서식하고 있다고 알려져 있다. 본 연구에서는, 한국의 대표적인고염환경으로부터 분리배양을 통하여 호염성 고세균의 특성 분석을 실시하였다. 호염성 미생물들을 분리하기 위하여, 고염배지를 제작하고, 총 7개의 순수 배양체를 확보하였다.
- 국내의 경우, 극한미생물의 배양, 순수분리에 대한 연구가 비교적 활발한 상황이다. 이에 따라, 본 연구진은 국내의 대표적 극한환경 중 하나인, 염전 및 주변 퇴적물에 서식하고 있는 다양한 호염성 고세균의 분리, 동정을 시도하고, 특성을 규명하고자 하였다. 호염성 고세균들은 비교적 높은 염분을 성장에 필요로 하고 있으며(최소 NaCl 1.
제안 방법
- MSG 액체배지를 사용하여, 채취한 염전시료를 연속희석법을 이용하여 희석한 후, 10-2–10-4 희석액을 100 µl씩 고형배지에 도말한 후 37℃ 배양기에서 2주간 배양하였다.
- 5, 1, 2, 5, 50, 100, 그리고 500 mM에서 미생물이 magnesium 이온의 필요여부를 확인하는 실험을 진행하였다. Nitrate를 이용한 탈질화 수행 여부는 MSG 혹은 MH2 배지에 nitrate를 넣고, 혐기적으로 배양하여 관찰하였다. 분리된 미생물의 기질 사용특성 분석 실험은 yeast extract,acid hydrolyzed casein, casamino acid, L-glutamic acid,trisodium citrate 등이 제외된 MSG 또는 MH2 고형 배지를 이용하였으며, 필요할 경우 액체배지를 사용하였다.
- PCR 수행방법으로, 94°C에서 5분 동안 변성(denaturation)과정을 거친 후 94℃에서 30초, 55°C에서 30초, 72°C에서 60초를 1회로 하여, 총 30회 반복 수행을 한 후 마지막으로 72°C에서 5분간 최종 신장(extension) 과정을 수행하였다.
- pH는 MGS 배지의 경우 1 N NaOH, MH2 배지의 경우 1 N KOH를 각각 사용하여, 7.0–7.5로 조절하였으며, 고형화를 위하여, 아가(Bacto agar, Difco)를 최종 1.5% (w/v)로 넣어주었다.
- 5% (w/v) agarose gel 전기영동법을 이용하여 PCR산물의 크기를 확인하였다. 그 후에 증폭된 PCR 생성물은 PCR purification kit (Cosmo Genetech)를 이용하여 정제하였으며, 정제된 산물은 Cosmo Genetech에서 염기서열 분석을 진행하였다. 염기서열 정보는 SeqMan software (DNA Star)를 이용하여 편집하였다.
- 다양한 NaCl 농도를 가진 MSG, MH2 액체배지를 이용하여 NaCl 생장 농도 실험을 진행하였다(NaCl 5–30%, 5% 간격).
- 또한 MgSO4·7H2O를 제외한 MSG, MH2 액체배지를 이용하여 0, 0.01, 0.05, 0.5, 1, 2, 5, 50, 100, 그리고 500 mM에서 미생물이 magnesium 이온의 필요여부를 확인하는 실험을 진행하였다.
- MSG 액체배지를 사용하여, 채취한 염전시료를 연속희석법을 이용하여 희석한 후, 10-2–10-4 희석액을 100 µl씩 고형배지에 도말한 후 37℃ 배양기에서 2주간 배양하였다. 배양후, 빨강색의 균집락(red-pigment)(Grant et al., 2001)들만을 선별하여 동일한 배지와 조건에서 획선 평판법을 이용하여 순수분리를 시도하였다. 순수분리된 미생물들을 아래에 기술한 분자생물학적 방법으로 계통 분류학적 분석을 실시하고, 생리·생화학적 실험을 통하여 분리된 미생물의 동정을 실시하였다.
- 본 연구를 통해 분리한 호염성 고세균의 16S rRNA 유전자 염기서열은 NCBI GenBank에 등록하였으며(KP030742, KP030743, KP030744, KP030745, KP030746, KT426885, KT426886), 분리한 균주들은 국립생물자원관에 기탁하였다.
- , 2011), 이들 호염성 고세균의 다양한 생리·생태학적 기능을 지니고 있을 것으로 판단된다. 본 연구에서는 국내에서는 보고 되지 않은 총 7종의 호염성 고세균을 염분이 높은 환경인 천일염전으로부터 분리하여 동정하고 미생물의 특성분석을 진행하였다. 본 연구를 통하여 국내의 다양한 호염성 고세균의 자원을 확보하였으며, 본 연구를 통하여 확보한 호염성 미생물의 분리 기술 및 균주 특징들은 앞으로 국내의 극한환경에서 다양한 생물자원을 확보하는데 기여할 것이다.
- Nitrate를 이용한 탈질화 수행 여부는 MSG 혹은 MH2 배지에 nitrate를 넣고, 혐기적으로 배양하여 관찰하였다. 분리된 미생물의 기질 사용특성 분석 실험은 yeast extract,acid hydrolyzed casein, casamino acid, L-glutamic acid,trisodium citrate 등이 제외된 MSG 또는 MH2 고형 배지를 이용하였으며, 필요할 경우 액체배지를 사용하였다. 다양한 21개의 기질을 사용하였으며, 각 기질은 1 L당 5 g의 농도를 사용하였다: glucose, maltose, mannose, mannitol, L-arabinose,L-lysine, L-arginine, acetate, fumarate, sucrose, starch, malate, lactate, glycine, glycerol, lactose, succinate, pyruvate, sorbitol, malic acid과 trisodium citrate.
- 분리된 호염성 고세균의 생리학적 실험은 일반적으로 MSG 혹은 MH2 배지에서 이루어졌다. 분리된 호염성 고세균은 Gram stain kit (BD)를 사용하여 그람염색을 실시하였다. 그람 염색 후 광학현미경(Nikon)을 통하여 결과를 관찰하였으며, 분리된 모든 미생물은 그람 음성으로 염색되는 것을 확인할 수 있었다.
- 분리한 고세균의 분자계통학적 분석을 위해 genomic DNA extraction kit (GeneAll)를 사용하여, 분리된 미생물의 genomic DNA를 추출하였으며, 16S rRNA 유전자는 고세균 16S rRNA 유전자 primer 세트인 20F (5'-TTCCGGTTGATCCYGCCRG-3')와 1492R (5'-GGTTACCTTGTTACGACTT-3')를 사용하여 PCR 증폭하였다(Weisburg et al., 1991; DeLong, 1992).
- 생장 온도 실험은 MSG 혹은 MH2 고형배지를 이용하여 10, 15, 20, 25, 30, 37, 40, 45, 50 그리고 60℃에서 진행하였고 (Nacl 농도 20–25%, w/v), 생장 pH 실험은 MSG 혹은 MH2 액체배지 10 ml에서 pH 5.0-10.0 (pH 0.5 간격)으로 진행하였다.
- 순수분리된 미생물들을 아래에 기술한 분자생물학적 방법으로 계통 분류학적 분석을 실시하고, 생리·생화학적 실험을 통하여 분리된 미생물의 동정을 실시하였다.
- 실험은 MSG 혹은 MH2 고형배지에서 이루어졌으며, 항생제 디스크(streptomycin 10 µg, penicillin 10 IU, clindamycin 2 µg, tetracycline 30 µg, gentamicin 10 µg, ampicillin 10 µg)를 사용하여 1주일간 최적 온도에서 배양되었다.
- 이를 위하여, Dyne ready-2X-Go (DYNEBIO) 10 µl 와 3차 증류수 7 µl, forward primer와 reverse primer를 각각 10 pmol씩 넣고, genomic DNA를 1 µl 넣어, 총 20 µl의 PCR 반응액을 만들었다.
- PCR 수행방법으로, 94°C에서 5분 동안 변성(denaturation)과정을 거친 후 94℃에서 30초, 55°C에서 30초, 72°C에서 60초를 1회로 하여, 총 30회 반복 수행을 한 후 마지막으로 72°C에서 5분간 최종 신장(extension) 과정을 수행하였다. 증폭된 PCR 생성물은 1.5% (w/v) agarose gel 전기영동법을 이용하여 PCR산물의 크기를 확인하였다. 그 후에 증폭된 PCR 생성물은 PCR purification kit (Cosmo Genetech)를 이용하여 정제하였으며, 정제된 산물은 Cosmo Genetech에서 염기서열 분석을 진행하였다.
- 시료는 채취 후 실험 전까지 4℃에서 냉장 보관하였다. 채취한 염전시료로부터 호염성 고세균을 배양하기 위해서 변형된 S-G (modified S-G, MSG) 배지와 MH2 배지를 이용하였다. MSG 배지의 조성은 다음과 같다.
- 염기서열 정보는 SeqMan software (DNA Star)를 이용하여 편집하였다. 편집된 염기서열은 Ez-biocloud(http://www.ezbiocloud.net/eztaxon)와 NCBI (National Center for Biotechnology Information)의 blast (Basic Local Alignment Search Tool)을 이용하여 연관성이 높은 유전자 서열을 획득, 비교 및 분석하였다. BioEdit program (Hall, 1999)을 이용하여 염기서열을 정렬(alignment)하고, 계통수는 MEGA6 program(Tamura et al.
- 1B–D에서 제시하였다. 학계에서 제시하는 16S rRNA 유전자의 유사성이 97%를 새로운 종의 기준으로 정하기 때문에, 분리한 미생물들을 가장 가까운 해당종의 새로운 균주(strain)로 분류하였다. 본 미생물들은 국외에서는 배양되어 보고되었지만, 국내에서는 배양된 적이 없는 ‘국내 미기록종’ 으로써, 최근 나고야의정서가 발효되면서, 국내외적으로 자생생물 조사발굴이 가속화 되고 있기 때문에, 국내 환경에 적응한 고유한 생리학적 특징을 지닌 생물자원으로서 주요하게 이용될 수 있다고 사료된다.
- 본 연구에서는, 한국의 대표적인고염환경으로부터 분리배양을 통하여 호염성 고세균의 특성 분석을 실시하였다. 호염성 미생물들을 분리하기 위하여, 고염배지를 제작하고, 총 7개의 순수 배양체를 확보하였다. 분리된 호염성 미생물들의 16S rRNA 유전자 서열에 대한 계통학 및 상동성 분석을 실시하여 Halorubrum 속의 미생물 4종, Halogeometricum 속의 미생물 1종, Halobacterium 속의 미생물 1종, Haloarcula 속의 미생물 1종을 각각 확보 할 수 있었다.
대상 데이터
- 곰소염전은 전라북도 부안군 진서면 곰소리(35°35'44.6"N 126°37'02.5"E)에 위치하고 있으며, 시료는 염전물과 주변의 퇴적층으로 부터 멸균된 50 ml conical tube에 채취하였다.
- 분리된 미생물의 기질 사용특성 분석 실험은 yeast extract,acid hydrolyzed casein, casamino acid, L-glutamic acid,trisodium citrate 등이 제외된 MSG 또는 MH2 고형 배지를 이용하였으며, 필요할 경우 액체배지를 사용하였다. 다양한 21개의 기질을 사용하였으며, 각 기질은 1 L당 5 g의 농도를 사용하였다: glucose, maltose, mannose, mannitol, L-arabinose,L-lysine, L-arginine, acetate, fumarate, sucrose, starch, malate, lactate, glycine, glycerol, lactose, succinate, pyruvate, sorbitol, malic acid과 trisodium citrate. 미생물 배양체는 1–2주일간 각 균주의 최적 온도에서 배양되었다.
- 본 실험을 위하여, 국내의 대표적 염전인, 곰소염전으로부터 시료를 채취하였다. 곰소염전은 전라북도 부안군 진서면 곰소리(35°35'44.
- 그 후에 증폭된 PCR 생성물은 PCR purification kit (Cosmo Genetech)를 이용하여 정제하였으며, 정제된 산물은 Cosmo Genetech에서 염기서열 분석을 진행하였다. 염기서열 정보는 SeqMan software (DNA Star)를 이용하여 편집하였다. 편집된 염기서열은 Ez-biocloud(http://www.
이론/모형
- net/eztaxon)와 NCBI (National Center for Biotechnology Information)의 blast (Basic Local Alignment Search Tool)을 이용하여 연관성이 높은 유전자 서열을 획득, 비교 및 분석하였다. BioEdit program (Hall, 1999)을 이용하여 염기서열을 정렬(alignment)하고, 계통수는 MEGA6 program(Tamura et al., 2013)에서 제공하는 neighbor-joining 방법(Saitou and Nei, 1987), maximum-likelihood 방법(Felsenstein, 1981), 그리고 maximum-parsimony 방법(Fitch, 1971)을 이용하여 그렸다. 분리된 호염성 미생물의 16S rRNA 유전자의 상동성은 Ez-biocloud를 통해 계산하였다.
- 미생물 배양체는 1–2주일간 각 균주의 최적 온도에서 배양되었다. Gelatin 가수분해실험은 Smibert와 Krieg의 방법(1994)에 의해 수행되었다. 분리된 모든 미생물은 멸균된 증류수 및 NaCl 10% (w/v) 이하에서 세포 용해(cell lysis)를 관찰할 수 있었다(Oren et al.
- , 2013)에서 제공하는 neighbor-joining 방법(Saitou and Nei, 1987), maximum-likelihood 방법(Felsenstein, 1981), 그리고 maximum-parsimony 방법(Fitch, 1971)을 이용하여 그렸다. 분리된 호염성 미생물의 16S rRNA 유전자의 상동성은 Ez-biocloud를 통해 계산하였다.
- , 1997). 항생제 내성 실험은 Oren 등(1997)의 방법에 의해 수행되었다. 실험은 MSG 혹은 MH2 고형배지에서 이루어졌으며, 항생제 디스크(streptomycin 10 µg, penicillin 10 IU, clindamycin 2 µg, tetracycline 30 µg, gentamicin 10 µg, ampicillin 10 µg)를 사용하여 1주일간 최적 온도에서 배양되었다.
성능/효과
- 1A에서 제시하였다. Halogeometricum, Halobacterium, Haloarcula 속 미생물은 16S rRNA 분석 결과를 통해 기존에 국외에서 배양되어 알려진 균주들과 각각 99.8%, 99.1%, 99.3%의 상동성을 보여주었다. 계통학적 분석을 통한 각 미생물의 유연관계는 Fig.
- 본 연구진은 염전으로부터 채취한 염전시료로부터 30–40개의 red-pigment를 지니는 균집락을 획득 할 수 있었으며, 계통학적 분석을 통하여 중복되는 종을 최대한 배제하여 총 7종의 서로 다른 호염성 미생물을 분리하였다: Halorubrum 속 4종, Halogeometricum속 1종, Halobacterium속 1종, Haloarcula속 1종(Table 1). Halorubrum, Halogeometricum, Halobacterium, Haloarcula 속의 미생물 들은 대부분 염호수와 천일염전, 염전토양 등과 같이 높은 염분의 환경에서 발견되었으며, 이는 본 연구에서 채취한 염전시료의 환경과 유사함을 알 수 있다. 본 연구를 통하여 발견한 각각의 Halorubrum 속의 미생물들은 16S rRNA 유전자 분석 결과를 통하여 국외에서 분리되어 보고된 미생물들과 98.
- 분리된 호염성 고세균은 Gram stain kit (BD)를 사용하여 그람염색을 실시하였다. 그람 염색 후 광학현미경(Nikon)을 통하여 결과를 관찰하였으며, 분리된 모든 미생물은 그람 음성으로 염색되는 것을 확인할 수 있었다. 생장 온도 실험은 MSG 혹은 MH2 고형배지를 이용하여 10, 15, 20, 25, 30, 37, 40, 45, 50 그리고 60℃에서 진행하였고 (Nacl 농도 20–25%, w/v), 생장 pH 실험은 MSG 혹은 MH2 액체배지 10 ml에서 pH 5.
- Halorubrum, Halogeometricum, Halobacterium, Haloarcula 속의 미생물 들은 대부분 염호수와 천일염전, 염전토양 등과 같이 높은 염분의 환경에서 발견되었으며, 이는 본 연구에서 채취한 염전시료의 환경과 유사함을 알 수 있다. 본 연구를 통하여 발견한 각각의 Halorubrum 속의 미생물들은 16S rRNA 유전자 분석 결과를 통하여 국외에서 분리되어 보고된 미생물들과 98.2-99.5%의 상동성이 관찰되었다. 계통학적 분석을 통한 미생물들의 유연관계는 Fig.
- 호염성 미생물들을 분리하기 위하여, 고염배지를 제작하고, 총 7개의 순수 배양체를 확보하였다. 분리된 호염성 미생물들의 16S rRNA 유전자 서열에 대한 계통학 및 상동성 분석을 실시하여 Halorubrum 속의 미생물 4종, Halogeometricum 속의 미생물 1종, Halobacterium 속의 미생물 1종, Haloarcula 속의 미생물 1종을 각각 확보 할 수 있었다. 이들 호염성 고세균들은 모두 그람 음성균이며, nitrate를 전자수용체로 사용한 혐기적 조건에서 성장이 관찰되지 않았다.
- 분리된 호염성 미생물들의 16S rRNA 유전자 서열에 대한 계통학 및 상동성 분석을 실시하여 Halorubrum 속의 미생물 4종, Halogeometricum 속의 미생물 1종, Halobacterium 속의 미생물 1종, Haloarcula 속의 미생물 1종을 각각 확보 할 수 있었다. 이들 호염성 고세균들은 모두 그람 음성균이며, nitrate를 전자수용체로 사용한 혐기적 조건에서 성장이 관찰되지 않았다. 또한, 분리된 모든 미생물들은 12–30% (w/v, NaCl) 염분을 필요로 하였다.
- 채취한 염전물 시료의 염도를 측정한 결과 20–25%인 것을 확인하였다.
후속연구
- 또한, 호염성 고세균에 의한 방향족 탄화수소의 생분해에 대한 연구도 진행되어 보고되고 있어(Bonfa et al., 2011), 이들 호염성 고세균의 다양한 생리·생태학적 기능을 지니고 있을 것으로 판단된다.
- 본 미생물들은 국외에서는 배양되어 보고되었지만, 국내에서는 배양된 적이 없는 ‘국내 미기록종’ 으로써, 최근 나고야의정서가 발효되면서, 국내외적으로 자생생물 조사발굴이 가속화 되고 있기 때문에, 국내 환경에 적응한 고유한 생리학적 특징을 지닌 생물자원으로서 주요하게 이용될 수 있다고 사료된다.
- 또한, 분리된 모든 미생물들은 12–30% (w/v, NaCl) 염분을 필요로 하였다. 본 연구는 국내의 호염환경으로 부터 호염성미생물의 분리기술 및 관련 연구에 대한 기초적 정보를 제공하며, 국내의 다양한 극한환경에서 서식하는 미생물 배양체 확보를 통하여 국내 생물자원 확보에 기여할 것으로 기대한다.
- 본 연구에서는 국내에서는 보고 되지 않은 총 7종의 호염성 고세균을 염분이 높은 환경인 천일염전으로부터 분리하여 동정하고 미생물의 특성분석을 진행하였다. 본 연구를 통하여 국내의 다양한 호염성 고세균의 자원을 확보하였으며, 본 연구를 통하여 확보한 호염성 미생물의 분리 기술 및 균주 특징들은 앞으로 국내의 극한환경에서 다양한 생물자원을 확보하는데 기여할 것이다.
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