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문제 정의
- 본 연구에서는 우리나라의 해양환경에서 색소를 생성하는 호염세균을 분리하여, 16S rDNA-RFLP 및 16S rDNA 염기서열 분석을 통하여 색소생성 세균의 계통적 다양성을 검토하였다.
제안 방법
- 16S rDNA PCR-RFLP 방법에 의해 얻은 덴드로그램을 바탕으로 9(A~I)개의 RFLP type에서 대표되는 균주를 선별한 뒤 이들의 계통학적 유연관계를 알아보기 위해 16S rDNA의 전염기서 열을 분석하였다. 그 결과 Pseudoaltemmonas sp.
- I6S rDNA PCR-RFLP pattern을 근거로 형성된 각 cluster의 대표되는 균주의 16S rDNA의 전염기서열을 PCR을 이용하여 증폭하였다. 증폭된 단편은 1% agarose gel에 전기영동하여 확인한 뒤 회수하였다.
- 증폭된 단편은 1% agarose gel에 전기영동하여 확인한 뒤 회수하였다. PCR prep DNA purification kit (Nucleogene, Korea)를 사용하여 정제한 후 pGEM-T Easy vector (Promega, USA)에 클로닝하였다. 플라스미드의 추출 및 정제는 Plasmid DNA purification kit (Genotein, Korea)를 사용하였다.
- 주출한 genomic DNA를 primer(lF: S'-AGAGTTTGATCMT GGGTCAG-3', 1492R: 5'-TACGGHTA CCTTGTTACGACTT-3'X 사용하여 94ºC에서 5분간 initial denaturation한 후, 94^에서 30조간 denaturation, 5이에서 30초간 annealing, 7*C 2*에서 5분의 extension 과정을 30회 반복하여 thermal cycler (Appled Biosystems, USA)로 증폭하였다. PCR 반응액은 PCR prep DNA purification kit (Nucleogene, Korea)를 사용하여 정제한 후 RFLP (restriction fragment length polymorphism) 분석과 염기서열 분석에 사용하였다.
- 16S rDNA의 RFLP 분석을 위해 사용된 제한효소는 Cfol (Takara, Japan), Rsal (Takara, Japan), Mspl (Takara, Japan)과 Haem (Takara, Japan)를 사용하였다. PCR 산물 10u1를 각각의 제한 효소를 사용하여 3TC에서 16시간 반응시킨 다음 2.5% agarose gel (Promega, USA)에 loading하여 0.5X TBE buffer에서 100V로 1시간 전기영동 한 뒤 확인하였다.
- 1)를 이용하여 분석하였다. Unweighted pair- groups method using arithmetic averages (UPGMA) linkage와 percent similarity matrix를 이용하여 각균주들 간의 제한 효소 절단 양상에 의한 덴드로그램을 작성하였다. 유사도 값이 68% 이상에서 구분되는 monophyletic group을 중심으로 9개의 cluster로 나누었고, 각 cluster에서 1개 이상의 균주를 선별하여, 16S rDNA RFLP 유사도와 16S rDNA 염기서 열간의 상관관계를 조사하기 위하여 총 12균주의 염기서열을 분석하였다.
- 8% a* gai 첨가한 MB배 지에 탐침법을 이용하여 관찰하였다. 각 균주의 생장 가능한 염농도는 NaCl이 각각 2, 3, 5, 7, 8, 10, 15, 20, 25%가 첨가된 배지를 사용하여 조사하였으며, 생장 가능한 온도는 4, 10, 15, 20, 25, 30, 37, 40, 41, 45, 50°C 에서 배양하여 결정하였다.
- 재조합 플라스미드에 삽입된 단편의 염기서열은 ABI 3100 DNA analyzer system으로 분석하였다. 또한 염기 서열의 상동성 검사는 GenBank database에 등록된 정보를 대상으로 Blast 프로그램(http://www.ncbi.nlm.nih.gov)으로 수행하였다.
- 분리된 균주들은 MA를 기본 배지로 이용하여 30ºC에서 24시간 배양한 후 그람 염색을 실시하여 관찰하였으며, 대조균주로 그람 양성인 B. subtilis IAM 1218T와 그람 음성인 E. coli KCTC1116을 이용하였다. 운동성은 0.
- 세균세포들의 염색체 DNA의 분리는 Saito와 Miura(8)의 방법을 변형하여 사용하였다. 주출한 genomic DNA를 primer(lF: S'-AGAGTTTGATCMT GGGTCAG-3', 1492R: 5'-TACGGHTA CCTTGTTACGACTT-3'X 사용하여 94ºC에서 5분간 initial denaturation한 후, 94^에서 30조간 denaturation, 5이에서 30초간 annealing, 7*C 2*에서 5분의 extension 과정을 30회 반복하여 thermal cycler (Appled Biosystems, USA)로 증폭하였다.
- coli KCTC1116을 이용하였다. 운동성은 0.8% a* gai 첨가한 MB배 지에 탐침법을 이용하여 관찰하였다. 각 균주의 생장 가능한 염농도는 NaCl이 각각 2, 3, 5, 7, 8, 10, 15, 20, 25%가 첨가된 배지를 사용하여 조사하였으며, 생장 가능한 온도는 4, 10, 15, 20, 25, 30, 37, 40, 41, 45, 50°C 에서 배양하여 결정하였다.
- Unweighted pair- groups method using arithmetic averages (UPGMA) linkage와 percent similarity matrix를 이용하여 각균주들 간의 제한 효소 절단 양상에 의한 덴드로그램을 작성하였다. 유사도 값이 68% 이상에서 구분되는 monophyletic group을 중심으로 9개의 cluster로 나누었고, 각 cluster에서 1개 이상의 균주를 선별하여, 16S rDNA RFLP 유사도와 16S rDNA 염기서 열간의 상관관계를 조사하기 위하여 총 12균주의 염기서열을 분석하였다.
- 재조합 플라스미드에 삽입된 단편의 염기서열은 ABI 3100 DNA analyzer system으로 분석하였다. 또한 염기 서열의 상동성 검사는 GenBank database에 등록된 정보를 대상으로 Blast 프로그램(http://www.
- 세균세포들의 염색체 DNA의 분리는 Saito와 Miura(8)의 방법을 변형하여 사용하였다. 주출한 genomic DNA를 primer(lF: S'-AGAGTTTGATCMT GGGTCAG-3', 1492R: 5'-TACGGHTA CCTTGTTACGACTT-3'X 사용하여 94ºC에서 5분간 initial denaturation한 후, 94^에서 30조간 denaturation, 5이에서 30초간 annealing, 7*C 2*에서 5분의 extension 과정을 30회 반복하여 thermal cycler (Appled Biosystems, USA)로 증폭하였다. PCR 반응액은 PCR prep DNA purification kit (Nucleogene, Korea)를 사용하여 정제한 후 RFLP (restriction fragment length polymorphism) 분석과 염기서열 분석에 사용하였다.
대상 데이터
- 16S rDNA의 RFLP 분석을 위해 사용된 제한효소는 Cfol (Takara, Japan), Rsal (Takara, Japan), Mspl (Takara, Japan)과 Haem (Takara, Japan)를 사용하였다. PCR 산물 10u1를 각각의 제한 효소를 사용하여 3TC에서 16시간 반응시킨 다음 2.
- 본 연구에서 사용된 균주는 2001년 7월부터 2002년 8월까지 가거도, 거제도, 제주도의 해수와 무녀도의 염전으로부터 분리하였다. 근해에서 채취한 해수는 Marine agar 2216 (MA, Difco, USA)배지에 도말하고, 염전에서 얻은 해수는 7%의 NaCl을 포함하는 MA배지에 도말한 뒤 30ºC에서 1~3일간 배양 후 형태적으로 다르게 구분되는 집락 200균주 중 색소를 생성하는 40 균주를 선별하여 사용하였다.
- 본 연구에서 사용된 균주는 2001년 7월부터 2002년 8월까지 가거도, 거제도, 제주도의 해수와 무녀도의 염전으로부터 분리하였다. 근해에서 채취한 해수는 Marine agar 2216 (MA, Difco, USA)배지에 도말하고, 염전에서 얻은 해수는 7%의 NaCl을 포함하는 MA배지에 도말한 뒤 30ºC에서 1~3일간 배양 후 형태적으로 다르게 구분되는 집락 200균주 중 색소를 생성하는 40 균주를 선별하여 사용하였다.
- PCR prep DNA purification kit (Nucleogene, Korea)를 사용하여 정제한 후 pGEM-T Easy vector (Promega, USA)에 클로닝하였다. 플라스미드의 추출 및 정제는 Plasmid DNA purification kit (Genotein, Korea)를 사용하였다.
데이터처리
- 염기서열의 분석은 CLUSTAL X multi-alignment program을 이용하였으며 GenBank database에 등록된 정보와 MEGA program을 이용하여 계통수를 얻었다. 또한 bootstrap 값은 100회의 re-sampled data로부터 추출하였다
- 제한효소 처리에 의해 생성된 band pattern을 fragment의 유무에 따라 통계처리 프로그램인 multi-variate statistical package (MVSP, Version 3.1)를 이용하여 분석하였다. Unweighted pair- groups method using arithmetic averages (UPGMA) linkage와 percent similarity matrix를 이용하여 각균주들 간의 제한 효소 절단 양상에 의한 덴드로그램을 작성하였다.
이론/모형
- 3. Phylogenetic relationship between KK7 and genus Salinicoccus, and other closely related bacteria, which was constructed by using the neighbour-joining method.
성능/효과
- 16S rDNA 증폭산물의 Haelll를 이용한 제한효소 절단 양상의 분석 결과, Pseudoatleromonas에 속하는 균주(A type)들은 주로 4개의 band(500, 410, 350, 300 bp)를 형성하여 Haelll는 이group에 속한 균주들을 구분하기에 유용하였다.
- 4종의 제한 효소 Haeffl, Cfoi, Mspk, Rsdl을 이용하여 band pattern을 관찰하고 band의 유무에 따라 MVSP 프로그램을 사용하여 덴드로그램을 작성한 결과(Fig. 1) 유사도 68%에서 9개(A- D의 type을 형성하였다.
- KK5와 KK6 역시 오렌지색을 띠는 균주들로 carotenoid 계열의 색소를 함유하고 있는 것으로 나타났다(미 발표 자료). E type의 KK7 균주는 염기서열 분석 결과 신종 가능성이 있는 균주로, Salinicoccus roseus와 96%의 유사도를 나타내었으며, 같은 속인 S. alkaliphilus, S. hispanicus과 93%의 낮은 유사도를 보였다. Salinicoccus는 주로 염이 존재하는 환경에서 서식하는 세균으로 Ventosa(13)에 의해 최초로 분리되었으며, 현재까지 S.
- roseus가 알려져 있다(7). F type에 속한 균주는 Photobacterium 속, G type에 속한 균주는 Vibrio 속과 99%의 유사도를 보였다. H type 에 속한 JU6 균주는 alpha 에 속한 Paracoccus 세균종이었다.
- Paracoccus carotinifacien의 경우 astaxanthin을 생산하는 세균으로 해양에서 많이 발견되는 세균종의 하나로 알려져 있다 (11). I type에 속하는 균주는 Flavobacteria^r 99%의 유사도를 보였으며, 역시 FBC complex에 속하였다.
- PCR-RFLP의 D와 I type에 속하는 3균주는 Flexihacter- Bacteroides-Cytophaga phylum (FBC phylum)에 속하였는데 D type에 속하는 KK6균주는 Tenacibaculum mesophilus과 97%의 유사도를 보였다. 최근 밝혀진 kncicibciciduin 속은 일본의 해안에서 수집한 해면과 녹조류로부터 최초로 분리되었다.
- 2, Table 2). 또한 16S rDNA 염기서열을 이용하여 계통수를 작성한 결과, alpha Proteobacteria, gamma Proteobacteria, Gram positive bacteria, Flexibacter-Bacteroides-Cytophaga phylum (FBC phylum)의 4개의 주요 lineage^- 나뉘어졌다 (Fig. 2).
- 본 연구에서 염전에서 분리한 색소를 생성하는 그람 양성 세균의 경우, Halobacillus^- Bacillus 두 속이 발견되었는데, 이는 Ventosa(12) 등의 중호염성 그람 양성 세균의 우점종에 대한 보고와 일치하는 결과이다. 또한 색소생성 세균의 대부분이 이미 알려진 세균종과 높은 16S rDNA 염기서열 유사성을 나타내었는데, 이는 흔히 일반적으로 알려진 해양세균종이 색소 생성능을 갖기 때문인 것으로 판단되며, 색소생성 40균주에 대한 본 연구의 결과, 세균의 색소 생성능은 계통에 상응하는 분류지표는 아닌 것으로 판단된다.
- 무녀도 염전에서 분리된 8 균주 중 6 균주가 그람 양성 세균이었으며, 10%의 NaCl 농도에서 최적생 장을 하였다. 또한 염전에서 분리된 균주는 20%의 염농도와 45P의 온도에서도 생장이 가능하였다. 염전으로부터는 8균주만이 분리되어 해수에 비해 세균의 분포가 적음을 알 수 있었으며, 염전에서 분리된 대부분의 균주가 그람 양성 세균으로, 해양세균의 우점종이 그람 음성 세균인 것과 대조적인 결과였다.
- 해수에서 분리한 균주들은 그람음성의 호기성 간균이 우점종이었으며, 2〜3%의 NaCl 농도에서 최적생장을 하였고, KK7을 제외한 모든 균주가 운동성을 나타내었다(Table 1). 무녀도 염전에서 분리된 8 균주 중 6 균주가 그람 양성 세균이었으며, 10%의 NaCl 농도에서 최적생 장을 하였다. 또한 염전에서 분리된 균주는 20%의 염농도와 45P의 온도에서도 생장이 가능하였다.
- 또한 Ventosa(12) 등은 중호염성 세균의 우점종은 그람 음성 세균이며, 그람 음성 세균의 경우 vibrio속과 Pseudo- monas속이, 그람 양성 세균인 경우, Halobacillus속과 Bacillus 속의 세균이 우점하는 것으로 보고하였다. 본 연구에서 염전에서 분리한 색소를 생성하는 그람 양성 세균의 경우, Halobacillus^- Bacillus 두 속이 발견되었는데, 이는 Ventosa(12) 등의 중호염성 그람 양성 세균의 우점종에 대한 보고와 일치하는 결과이다. 또한 색소생성 세균의 대부분이 이미 알려진 세균종과 높은 16S rDNA 염기서열 유사성을 나타내었는데, 이는 흔히 일반적으로 알려진 해양세균종이 색소 생성능을 갖기 때문인 것으로 판단되며, 색소생성 40균주에 대한 본 연구의 결과, 세균의 색소 생성능은 계통에 상응하는 분류지표는 아닌 것으로 판단된다.
- 분리된 40 균주 중 28 균주가 gamma Proleobacteria에 속하는 세균이며, 그 중 26 균주(PCR-RFLP A type)가 Pseudoalteromona^-과 99%의 유사도를 나타내어, Pseudoalteromonas 종은 색소생성 호염세균의 우점종임을 알 수 있었다.
- 염전에서 분리한 8 균주 중 6 균주가 Gram positive bacteria에 포함되었고, Halobacillus(B type)와 Bacillus(C type)에 대하여 각각 99%의 유사도를 나타내었다. Halobacillus 속은 Sporosarcina 속에서 재분류된 속으로, 이 속의 세균들은 0.
- 또한 염전에서 분리된 균주는 20%의 염농도와 45P의 온도에서도 생장이 가능하였다. 염전으로부터는 8균주만이 분리되어 해수에 비해 세균의 분포가 적음을 알 수 있었으며, 염전에서 분리된 대부분의 균주가 그람 양성 세균으로, 해양세균의 우점종이 그람 음성 세균인 것과 대조적인 결과였다.
- , Paracoccus sp.의 염기서열과 96~99%의 유사도를 보여 분리된 세균들이 계통적으로 다양하게 분포함을 알 수 있었다(Fig. 2, Table 2). 또한 16S rDNA 염기서열을 이용하여 계통수를 작성한 결과, alpha Proteobacteria, gamma Proteobacteria, Gram positive bacteria, Flexibacter-Bacteroides-Cytophaga phylum (FBC phylum)의 4개의 주요 lineage^- 나뉘어졌다 (Fig.
- 제주도의 해수로부터 분리한 세균의 다양성 연구의 결과(5)에 의하면, 분리된 균주 중 high G+C Gram positive가 59%로 가장 많이 존재하며, alpha Pmteobacteria (33%), gamma Proteobacteria (5%), low G+C Gram positive (3%) 세균의 순으로 분포하는 것으로 나타났으나, 본 논문의 국내 해양으로부터 분리한 색소생성 호염성 세균의 경우, 분리된 균주의 80%가 gamma Pmteobacteria 중 Pseudoalteromonas 속 세균종인 것으로 나타나, Lee 등(5)의 연구에서 보고된 해양세균의 우점종 및 다양성과는 다른 분포를 나타내었다. 또한 Ventosa(12) 등은 중호염성 세균의 우점종은 그람 음성 세균이며, 그람 음성 세균의 경우 vibrio속과 Pseudo- monas속이, 그람 양성 세균인 경우, Halobacillus속과 Bacillus 속의 세균이 우점하는 것으로 보고하였다.
- 분리한 색소생성 호염성균주들은 MA배지 상에서 빨강, 노랑, 갈색, 분홍, 연두색의 집락을 형성하였다. 해수에서 분리한 균주들은 그람음성의 호기성 간균이 우점종이었으며, 2〜3%의 NaCl 농도에서 최적생장을 하였고, KK7을 제외한 모든 균주가 운동성을 나타내었다(Table 1). 무녀도 염전에서 분리된 8 균주 중 6 균주가 그람 양성 세균이었으며, 10%의 NaCl 농도에서 최적생 장을 하였다.
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