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문제 정의
- 따라서 본 연구에서는 들깻잎을 대상으로 주요 생산지인 밀양에서 들깻잎의 미생물에 대한 오염도를 조사하였고 분리된 S. aureus의 독소유전자 검색과 항생제 내성 조사를 통하여 toxicity를 평가하였다.
제안 방법
- 또한 PCR thermal cycler의 반응 조건은 94ºC에서 5분간 pre-denaturation을 실시한 후, 94ºC에서 1분간 denaturation, sea 56ºC, seb 55ºC, sec 52ºC, sed 51ºC, see 50ºC에서 40초간 각각 primer annealing, 72ºC에서 1분간 extension의 조건으로 30cycle을 수행하고, final extension을 72ºC에서7분간 실시하였다. PCR에 의한 증폭생성물은 1.8% agarose gel 전기영동에 의해 확인하였다.
- cereus KCCM 11714를 사용하였다. Primer는 Tsen18) 등 (sea)과 Karsten19) 등 (seb, sec, see) 그리고 Monday20) 등 (sed)에 의해 밝혀진 염기서열을 참고로 하여 제작하였다. 여섯 종류의 독소에 대한 primers의 특이적 염기서열은 Table 2에 나타난 바와 같으며, 각각의 primer는 Bioneer사 (Chengwon, Chungbuk, Korea)에서 합성하였다.
- 계수한 평판에서 5개 이상의 전형적인 집락을 선발하여 NA배지에 접종하고 37ºC에서 24시간 배양한 후 PCR kit (Power check PCR kit, Kogen, Korea)와 VITEK (VITEK-2 compact, Biomerieux, France)으로 확인동정하였다.
- 독소유전자 분석을 위한 DNA는 Intron사의 DNA추출 kit (G-spinTM Genomic DNA Extraction Kit, Intron, Korea)를 사용하여 추출하였다. S.
- 항생제 내성은 집단 식중독이 발생되었을 때 초기 진료에 결정적 영향을 주게되므로 분리균주에 대한 항생제 내성 조사가 반드시 필요하다. 따라서 각 시료에서 분리된 병원성 미생물에 대한 항생제 민감성 실험을 수행하였다. 그 결과 Table 5에서 보는 바와 같이 31종의 균주는 8개의 내성 패턴으로 grouping 되었다.
- 또한 PCR thermal cycler의 반응 조건은 94ºC에서 5분간 pre-denaturation을 실시한 후, 94ºC에서 1분간 denaturation, sea 56ºC, seb 55ºC, sec 52ºC, sed 51ºC, see 50ºC에서 40초간 각각 primer annealing, 72ºC에서 1분간 extension의 조건으로 30cycle을 수행하고, final extension을 72ºC에서7분간 실시하였다.
- 또한 정성 검사는 들깻잎 25 g을 225 mL의 10% NaCl이 첨가된 tryptic soy broth (Difco Lab., Detroit, MI, USA)에 넣고 2분간 stomacher에서 균질한 후 37oC에서 16시간 전배양하고 배양액을 Baird-Parker agar (Difco Lab., Detroit, MI, USA)에 37oC에서 24~48시간 획선 배양한 후 검은색, 집락주위에 투명 환(clear zone)이 나타나는 단일 집락을 취하여 확인실험에 사용하였다. 확인실험은 정량검사와 동일하게 PCR kit (Kogen, Korea)와 VITEK (Biomerieux, France)을 사용하였고 대조군으로 S.
- 본 연구는 들깻잎과 들깻잎 생산환경을 대상으로 31개의 시료를 채취하여 S. aureus 를 분리 하였다. 분리된 S.
- aureus 를 분리 하였다. 분리된 S. aureus 31주의 toxicity를 평가하고자 독소유전자와 항생제내성을 검색하였다. 그 결과 분리된 균주에서 4개의 서로 다른 독소유전자 패턴은 확인하였으며 sea와 sed유전자를 동시에 보유하는 균주는 4균주 (12.
- aureus를 분리 하였다. 분리된 S. aureus에 대하여 독소유전자와 항생제 감수성조사를 실시하였다.
- 수집된 시료에서 S. aureus를 31균주 (재배환경: 관개용수 1주, 수확 후 환경: 포장대 3주, 포장용기 1주, 작업자: 작업자 복장 1주, 작업자 손 3주, 들깻잎 22주)를 분리하였으며 분리, 동정법은 다음과 같다. S.
- aureus를 분리하였다. 이후 S. aureus 가 검출된 5농장을 선정하여 들깻잎이 접촉 가능한 토양, 관개용수, 작업자, 수확 후 환경에서 S. aureus를 분리 하였다. 분리된 S.
- 최종 elution buffer 100 μL를 넣고 13000 rpm 1분간 원심분리하여 이를 enterotoxin gene 검출을 위한 template DNA로 사용하였다.
- 최종균수는 S. aureus의 수치는 전형적인 집락을 보이는 균주 × 양성 균주 수/5주의 test균주 × 희석 배수로 계산하였다.
- 항균제 디스크를 20 mm 간격으로 배지 표면에 부착시킨 후 37ºC에서 24시간 배양하였으며 NCCLS의 기준에 따라 감수성 여부를 판단하였다.
대상 데이터
- 검출시료는 A 농가의 포장대, D 농가의 포장비닐과 작업자 손, E 농가의 관개용수와 복장이었고 검출 수준은 0.33 ± 0.58 ~ 1.31 ± 1.30 log10CFU/100 cm2 이었다(data not shown).
- 항균제 디스크를 20 mm 간격으로 배지 표면에 부착시킨 후 37ºC에서 24시간 배양하였으며 NCCLS의 기준에 따라 감수성 여부를 판단하였다. 대조군으로는 E. coli ATCC 25922과 S. aureus ATCC25923을 사용하였다. 항생제 선정은 NCCLS 가이드라인에서 추천하는 항생제를 선정하였고 항생제 감수성 기준을 적용하였다.
- 또한 들깻잎 포장 작업 시에는 들깻잎의 시들음 방지를 위해서 사용하는 물은 분무기에 담긴 물약 500 mL 정도를 1 L 채수병에 채취하였다. 들깻잎 농장의 수확용기와 작업도구는 사용 중인 것을 채취하였고 포장 비닐은 사용 전의 것을 대상으로 하였다. 작업자의 복장은 농장에서 일하는 작업자의 상의를 대상으로 하였으며 수확용기, 작업도구 및 작업자 복장은 10 cm × 10 cm 크기의 면적대를 사용하여 100 cm2의 면적을 면봉으로 문질러 채취하였다.
- 토양의 경우 하우스 내의 토양을 약 100 g 씩 시료채취용 팩에 채취하였다. 들깻잎에 사용되는 관개용수는 분수 호스 내에 있는 물을 채취하였고, 지하수나 지표수는 수원(水原)으로부터 퍼올린 물을 1 L 씩 채수병에 채취하였다. 또한 들깻잎 포장 작업 시에는 들깻잎의 시들음 방지를 위해서 사용하는 물은 분무기에 담긴 물약 500 mL 정도를 1 L 채수병에 채취하였다.
- 들깻잎은 수확 전 하우스에 심겨진 들깻잎과 수확·포장이 끝나 박스에 담긴 들깻잎을 대상으로 채취하였으며 채취량은 수확전의 것은 36장 수확후의 것은 3개 묶음 (1묶음 = 12장)을 멸균된 시료채취용 팩에 채취하였으며 이렇게 채취된 모든 시료는 얼음을 채운 아이스박스에 담고 실험실로 냉장 운반한 후 사용하였다(Table 1).
- 들깻잎의 S. aureus 오염도 조사를 위한 시료채취는 수확·포장과정을 거쳐 박스에 담긴 들깻잎을 시료채취용 팩에 담아와 본 연구에 사용하였다.
- aureus ATCC 27664 (see)이다. 또한 음성 대조군로는 L. monocytogenes ATCC 15313, S. Typhimurium ATCC 13311, B. cereus KCCM 11714를 사용하였다. Primer는 Tsen18) 등 (sea)과 Karsten19) 등 (seb, sec, see) 그리고 Monday20) 등 (sed)에 의해 밝혀진 염기서열을 참고로 하여 제작하였다.
- 본 연구는 들깻잎 주생산지인 밀양지역 38농가에서 들깻잎을 수집하여 S. aureus를 분리하였다. 이후 S.
- 작업자의 복장은 농장에서 일하는 작업자의 상의를 대상으로 하였으며 수확용기, 작업도구 및 작업자 복장은 10 cm × 10 cm 크기의 면적대를 사용하여 100 cm2의 면적을 면봉으로 문질러 채취하였다.
- aureus 분포를 조사하기 위한 시료 채취 과정은 다음과 같다. 토양의 경우 하우스 내의 토양을 약 100 g 씩 시료채취용 팩에 채취하였다. 들깻잎에 사용되는 관개용수는 분수 호스 내에 있는 물을 채취하였고, 지하수나 지표수는 수원(水原)으로부터 퍼올린 물을 1 L 씩 채수병에 채취하였다.
- , Detroit, MI, USA)에 37oC에서 24~48시간 획선 배양한 후 검은색, 집락주위에 투명 환(clear zone)이 나타나는 단일 집락을 취하여 확인실험에 사용하였다. 확인실험은 정량검사와 동일하게 PCR kit (Kogen, Korea)와 VITEK (Biomerieux, France)을 사용하였고 대조군으로 S. aureus 표준 균주 ATCC 25923을 사용하였다17).
이론/모형
- 작업자의 복장은 농장에서 일하는 작업자의 상의를 대상으로 하였으며 수확용기, 작업도구 및 작업자 복장은 10 cm × 10 cm 크기의 면적대를 사용하여 100 cm2의 면적을 면봉으로 문질러 채취하였다. 또한 작업자의 손은 0.85% 생리식염수 50 mL을 멸균 팩에 붓고 손을 넣어 30초간 씻어서 손에 있는 미생물을 채취하는 glove juice법으로 하였다16). 들깻잎은 수확 전 하우스에 심겨진 들깻잎과 수확·포장이 끝나 박스에 담긴 들깻잎을 대상으로 채취하였으며 채취량은 수확전의 것은 36장 수확후의 것은 3개 묶음 (1묶음 = 12장)을 멸균된 시료채취용 팩에 채취하였으며 이렇게 채취된 모든 시료는 얼음을 채운 아이스박스에 담고 실험실로 냉장 운반한 후 사용하였다(Table 1).
- 항생제 감수성 시험은 National committee for clinical laboratory standards (NCCLS) 가이드라인을 참조하였고 또한 본 연구에 사용된 항생제 종류는 Table 3에서 보는 바와 같다21). 접종 균액은 Muller-Hinton broth (Oxoid, England)에서 24시간 배양한 균을 멸균 생리식염수로 희석하여 Mac-Farland scale No 0.
- aureus ATCC25923을 사용하였다. 항생제 선정은 NCCLS 가이드라인에서 추천하는 항생제를 선정하였고 항생제 감수성 기준을 적용하였다.
성능/효과
- 0%였으며 다양한 시료에 고르게 분포하고 있었다. 검출된 시료는 들깻잎 16.1%, 작업자의 복장, 포장대, 관개용수 등 생산 환경에서 분리된 균주의 29.0%였다. 또한 see 유전자를 보유하는 균주는 포장대에서 분리된 3.
- aureus 31주의 toxicity를 평가하고자 독소유전자와 항생제내성을 검색하였다. 그 결과 분리된 균주에서 4개의 서로 다른 독소유전자 패턴은 확인하였으며 sea와 sed유전자를 동시에 보유하는 균주는 4균주 (12.9%)였고, sed 유전자를 보유하는 균주는 9균주 (29.0%)였으며 see 유전자를 보유하는 균주는 1균주 (3.2%)였다. 한편 seb와 sec 유전자를 보유하는 균주는 없었다.
- aureus는 엽채류에서 빈번히 검출되고 있음을 알 수 있다. 들깻잎 생산 환경에서 S. aureus를 조사한 결과, 5 농가 중 3 농가의 생산환경에서 S. aureus가 검출되었다. 검출시료는 A 농가의 포장대, D 농가의 포장비닐과 작업자 손, E 농가의 관개용수와 복장이었고 검출 수준은 0.
- 들깻잎과 생산 환경에서 분리된 S. aureus 균주 31종에 대하여 enterotxin A, B, C, D, E 생성유전자를 PCR로 증폭하여 분석한 결과 4개의 서로 다른 그룹으로 분류되었다(Table 4). 1번 group은 sea와 sed유전자를 동시에 보유하는 균주 group, 2번 group은 sed 유전자만 보유하는 group, 3번 group은 see 유전자만 보유하는 group, 4번 group은 5가지 독소 생성유전자를 보유하지 않는 균주들의 group이다.
- 들깻잎에서 S. aureus를 조사한 결과, 0~2.92 log10CFU/ g 수준이었으며 검출빈도는 7.9%(9/114)였고 2곳의 농가에서 S. aureus가 2.00 log10CFU/g 이상으로 검출되었다 (data not shown). 이는 Kim22) 등이 수행한 즉석섭취 야채샐러드의 미생물 오염조사에서 총 120건 중 4건(3%)보다는 높은 빈도를 보였고 Jung23) 등이 수행한 비가열 섭취 채소류의 미생물 오염도 조사결과, 깻잎 10.
- Jung28) 등이 수행한 상추와 원유에서 분리한 균주들 중 sea 유전자를 소유한 균주가 43%로 가장 높게 나타났다. 또한 Kim29) 등이 딸기농장에서 분리한 S. aureus로 독소 생산 실험을 한 결과 sea, sea와 seb 동시 생성균, sec 유전자가 각각 92%, 38%, 0%로 각각 검출되어 sea와 seb 유전자의 검출 빈도가 높았다. 이 결과는 본 연구에서 sed 가 빈번하게 검출된 경향과는 조금 다름을 알 수 있다.
- 1). 또한 amoxicillin-clavulanic acid에 29.0%, cefazolin에 22.6%, cephalothin에 22.6%, imipenem 에 22.6%, gentamycin에 61.3%, tetracycline에 22.6%, ofloxacin에 22.6%, norfloxacin에 25.8%, erythromycin에 22.6%, terithromycin에 6.5%가 내성을 보였으며 vancomycin, trimethoprim-sulfamethoxazole, chloramphenicol, rifampin, quinupristin-dalfopristin에 대한 내성을 보이는 균주는 없었다. 한편, oxacillin에 내성을 보이는 MRSA (Methicillin Resistance Staphylococcus aureus)균주가 22.
- aureus enterotoxin 유전자, exfoliative toxin 유전자, toxic-shock syndrome toxin 유전자가 검출되었다. 또한 classical enterotoxin 유전자들(sea to see)보다 sei유전자가 보다 많이 검출된 경향을 미루어볼 때 본 연구에서 5가지 유전자가 모두 불검출된 균주들도 seg나 sei 유전자를 보유할 가능성이 있을 것으로 추정된다.
- 6%)였다. 또한 분리된 균주의 2균주 (2.6%)는 5제의 항생제(penicillin, ampicillin, amoxicillin-clavulanic acid, gentamycin, and telithromycin)에 내성을 보였고 MRSA (Methicilline Resistant Staphylococcus aureus)는 포장지, 장갑, 들깻잎에서 발견되었다. 따라서 본 연구결과는 들깻잎에 오염된 S.
- 1번 group은 sea와 sed유전자를 동시에 보유하는 균주 group, 2번 group은 sed 유전자만 보유하는 group, 3번 group은 see 유전자만 보유하는 group, 4번 group은 5가지 독소 생성유전자를 보유하지 않는 균주들의 group이다. 분리균주의 12.9%가 group 1에 속하며 들깻잎에서만 분리되었고 group 2로 분류되는 균주는 29.0%였으며 다양한 시료에 고르게 분포하고 있었다. 검출된 시료는 들깻잎 16.
- 한편 seb와 sec 유전자를 보유하는 균주는 없었다. 항생제 내성평가결과, 12제의 항생제(penicillin, ampicillin, oxacillin, amoxicillin-clavulanic acid, cefazolin, cephalothin, imipenem, gentamicin, tetracycline, ofloxacin, norfloxacin, and erythromycin)에 내성을 보인 균주는 7균주 (22.6%)였다. 또한 분리된 균주의 2균주 (2.
- 항생제별로는 들깻잎에서 분리된 균주 1주를 제외한 나머지 균주(96.8%)에서 모두 penicillin과 ampicillin에 저항성을 보였다(Fig. 1). 또한 amoxicillin-clavulanic acid에 29.
후속연구
- -이상의 결과들로 미루어 볼 때 분리하는 장소와 시료에 따라서 S. aureus가 갖는 독소유전자가 차이가 있는 것으로 판단되므로 시료와 장소에 따라 분리된 균주가 어떤 유형의 enterotoxin을 생성하는지에 대한 조사가 체계적으로 이루어져야 한다. 또한 enterotoxin 유전자가 검출이 된다고 하여도 그 활성의 정도는 알 수 없으므로 면역분석법을 병행하는 것이 필요하다고 보인다.
- 6%)는 5제의 항생제(penicillin, ampicillin, amoxicillin-clavulanic acid, gentamycin, and telithromycin)에 내성을 보였고 MRSA (Methicilline Resistant Staphylococcus aureus)는 포장지, 장갑, 들깻잎에서 발견되었다. 따라서 본 연구결과는 들깻잎에 오염된 S. aureus에 의하여 독소형 식중독이 발생할 가능성을 시사하며 들깻잎과 생산 환경에서 항생제 저항성 S. aureus가 검출되어 의약계뿐만 아니라 농업현장에서도 항생제내성균주 출현을 예방하는 대책이 요구된다.
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