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문제 정의
- 따라서 본 연구에서는 다양한 생리활성을 가지고 있는 헛개나무과병추출물의 산업적 이용성을 확대하고자 부형제로 당량이 다른 dextrin (DE = 8-10) 및 β-cyclodextrin의 첨가에 따른 헛개나무과병추출물의 지표성분의 안정성을 검토하고 각각의 부형제와 함께 제조된 헛개나무과병추출 분말의 생체 내 효능에서 차이가 있는지를 조사하고자 한다.
- 특히, 포집능력이 있는 β-cyclodextrin의 첨가가 인체 내에서 추출물의 효능에 영향을 미치는 지에 대해 확인함으로써 기능성 소재의 산업적 이용성을 확대하고자 한다.
제안 방법
- 5주령 C57BL6 수컷생쥐(Daehan Bio Link, Korea)를 구입하여 1주일간 순화시킨 후 체중을 측정하고 사용하였으며, 평균체중을 균등하도록 군당 10마리씩 negative control 군, 5 mg alcohol 투여군, 500 mg 헛개나무 추출분말/dextrin 투여군, 500 mg 헛개나무 추출분말/β-cyclodextrin 투여군 등 총 4군으로 나누었다.
- Alcohol dehydrogenase (Sigma, MAK053)와 Aldehyde dehydrogenase (Sigma, MAK082)의 활성도는 채취한 간 조직을 이용하여 제조사에서 제공한 방법대로 수행하였다.
- 투여용량은 5 mL 알코올 또는 5 mL 알코올/500 mg/kg 헛개나무 추출분말을 각각 투여하였고, 헛개나무 추출분말은 주사용수 (1차 증류수)에 현탁하고, 투여액량은 10 mL/kg으로 산출하여 투여하였다. Negative control군은 부형제인 주사용수를 투여하였다.
- Quercetin 표준물질을 사용하여 20, 10, 5, 2.5, 1 μg/mL의 농도로 표준용액을 제조하였다.
- 각 군별로 마지막 투여 후, isoflurane으로 마취하여 개복하고, 복대동맥에서 혈액을 채취하여 serum-separating tube 및 heparinized tube에 보관하였으며, 간 조직을 적출하고, 중량을 측정하였다. 중량을 측정한 간 조직은 액체질소를 이용하여 급속동결 시키고 초저온고(−80 ~ −60℃)에서 보관하였다.
- 농축이 완료된 잔류물은 메탄올로 용해시켜 최종 5 mL로 정량하였으며, 정량된 이 용액 2 mL을 취한 후 0.2 μm 실린지 필터를 사용하여 여과하고 HPLC로 분석하였다.
- 분리된 혈청은 혈액생화학분석기(7080, Hitachi, Japan)를 이용하여 alanine aminotransferase (ALT), aspartate aminotransferase (AST), γ-glutamyl transpeptidase (γ-GPT) lactate dehydrogenase (LDH) 및 triglyceride (TG), low density lipid (LDL), high density lipid (HDL) 및 total cholesterol (TC)를 측정하였다.
- 액상시제품(350 mL)을 헛개나무과병추출분말 하루 복용량 2,460 mg이 들어가도록 부형제인 dextrin 혹은 βcyclodextrin을 4:6의 비율로 제조하였다. 제조된 액상시제품을 120℃에서 15분간 살균한 뒤 가혹조건(40℃)에서 0주, 4주, 8주 동안 보관하였다가 시제품 중의 quercetin 량을 측정하였다.
- 실험동물의 식이는 실험동물용 고형사료(Rodent diet 2918C; Harlan Teklad, Indianapolis, IN, USA)를 음수와 함께 자유 급여하였다. 체중측정은 투여시작일부터 조직 적출일까지 매일 1회 측정하였다.
- 추출물은 1일 1회씩 7일 동안 총 7회 반복하여 경구투여 하였다. 투여용량은 5 mL 알코올 또는 5 mL 알코올/500 mg/kg 헛개나무 추출분말을 각각 투여하였고, 헛개나무 추출분말은 주사용수 (1차 증류수)에 현탁하고, 투여액량은 10 mL/kg으로 산출하여 투여하였다.
- 추출물은 1일 1회씩 7일 동안 총 7회 반복하여 경구투여 하였다. 투여용량은 5 mL 알코올 또는 5 mL 알코올/500 mg/kg 헛개나무 추출분말을 각각 투여하였고, 헛개나무 추출분말은 주사용수 (1차 증류수)에 현탁하고, 투여액량은 10 mL/kg으로 산출하여 투여하였다. Negative control군은 부형제인 주사용수를 투여하였다.
- 헛개나무과병추출분말의 지표성분인 quercetin의 량은 Tosoh ODS column (4.6 × 150 mm, 5 μm)을 이용하여 Agilent Technologies 1200 Series HPLC system (Model Agilent Technologies 1200 Series DAD SL G1315C. USA)를 이용하여 분석하였으며, 측정파장은 350 nm이며, 2% 초산45% 아세토나이트릴과 2%초산-증류수를 사용하였다.
대상 데이터
- 본 실험에 사용된 헛개나무과병추출분말의 quercetin의 함량은 11.1 μg/g으로 측정되었다.
- 실험동물의 식이는 실험동물용 고형사료(Rodent diet 2918C; Harlan Teklad, Indianapolis, IN, USA)를 음수와 함께 자유 급여하였다. 체중측정은 투여시작일부터 조직 적출일까지 매일 1회 측정하였다.
- 액상시제품(350 mL)을 헛개나무과병추출분말 하루 복용량 2,460 mg이 들어가도록 부형제인 dextrin 혹은 βcyclodextrin을 4:6의 비율로 제조하였다.
- 고형분 40%의 농축액은 부형제인 dextrin 또는 β-cyclodextrin을 6:4(부형제:헛개나무추출분말)의 비율로 혼합하고 분무건조(spray-dry)하여 헛개나무과병추출 분말을 얻었다. 헛개나무과병추출분말은 실온에서 보관하고 본 실험의 재료로 사용하였다.
데이터처리
- 20, USA)를 이용하여 통계 분석하였다. 대조군과 시험물질 투여군 간에 Folded-F 검정법을 실시하여 등분산성을 검정하였다(유의수준: 0.05). 등분산성인 경우 Student t-test 를 실시하였고(유의수준: 양측 0.
- 05). 등분산성인 경우 Student t-test 를 실시하였고(유의수준: 양측 0.05 및 0.01), 등분산성이 기각되면 Aspin-Welch t-test 를 실시하였다(유의수준: 양측 0.05 및 0.01).
- 실험결과는 SAS (Statistical Analysis System, Version 8.20, USA)를 이용하여 통계 분석하였다. 대조군과 시험물질 투여군 간에 Folded-F 검정법을 실시하여 등분산성을 검정하였다(유의수준: 0.
성능/효과
- 그럼에도 불구하고, TG의 혈중 농도가 알코올이나 HD를 투여한 군보다 HCD 투여군에서 더 감소하는 경향을 보였다.
- Total cholesterol의 경우, 음성대조군에 비해 알코올 투여군에서 증가하였으며(p = 0.006), 알코올 대조군에 비해 HD (p = 0.007) 및 HCD (p = 0.001) 투여군에서 감소하는 것으로 나타났다(Fig. 3A). 한편, TG는 음성대조군에 비해 알코올 투여군에서는 증가되지 않았으며, 알코올 투여군과 HD 또는 HCD 투여군 사이에서도 차이가 없었다(Fig.
- 가혹조건(40℃)에서 지표성분인 quercetin의 함량을 측정한 결과(Table 1), 일반 dextrin을 사용한 헛개나무과병추출분말의 초기농도는 0.078 μg/mL, 4주 후 농도는 0.045 μg/mL, 8주 후 농도는 0.017 μg/mL로 분석되어 초기에 비해 8주 후 지표성분 함량이 78.2% 감소하였다.
- 간손상의 지표인 alanine aminotransferase (ALT), aspartate aminotransferase (AST)의 혈중 농도를 측정한 결과 음성대조군에 비해 알코올 투여군에서 각각 증가하였으며(ALT: p = 0.016, AST: p = 0.048), 알코올만을 투여한 대조군에 비해 HD 투여군에서 낮게 나타났으며(ALT: p = 0.009, AST: p = 0.024), HCD의 투여군에서도 낮게 나타났다(ALT: p = 0.01, AST: p = 0.04) (Fig. 1).
- 음수량과 사료섭취량의 경우 알코올을 투여한 모든 군이 음성대조군에 비해 감소하였으나, 알코올 투여군에 비해 HD 또는 HCD 투여가 통계적으로 유의한 변화를 야기하지는 않았다(Table 3). 그러나, 간의 무게를 측정한 결과 7일간 투여 후 음성대조군에 비해 알코올 투여군에서 증가(p = 0.031) 하였고, 알코올 투여군에 비해 HD 투여군에서는 감소(p = 0.037)하였고, HCD 투여군 역시 알코올 투여군에 비해 감소(p = 0.043) 하였다(Table 2). 이러한 결과로부터 dextrin보다 β-cyclodextrin이 헛개나무과병추출물 내에 존재하는 알코올성 간손상을 개선하는 물질의 활성에 영향을 미치지 않는다는 것을 의미한다고 추측할 수 있다.
- 본 연구에서 알코올성 간손상에 대한 헛개나무과병추출물의 보호 효능에 대해 dextrin과 β-cyclodextrin이 미치는 영향을 평가한 결과, 부형제로 사용한 β-cyclodextrin은 구조가 선상구조를 갖는 dextrin과 차이를 보이고 포집능력에 있어서 dextrin과 다름에도 불구하고 부형제로 사용되었을 때 주 성분의 생체 내 기능적 효과를 저해하거나 지연시키지 않고 dextrin과 유사한 정도의 영향을 미치는 것으로 확인하였다.
- 본 연구의 결과는 HD와 HCD가 간 조직에서 알코올 분해를 유도할 수 있다는 것을 제안하며, HCD가 HD와 동등하게 알코올에 의해 유도된 간 손상을 보호할 능력이 있다는 것을 증명하였다. 이러한 사실에 근거하여, 기능성 식품소재의 부형제로써 dextrin을 사용하는 대신 βcyclodextrin을 사용할 수 있으며, 특히 액상에서 안정성이 떨어지는 지표성분을 안정화시키고 천연추출물의 약리효능을 보존하기 위해서도 β-cyclodextrin의 사용은 유용하리라 사료된다.
- 05) 하였는데(Table 2), 이는 알코올을 투여함으로 인한 사료섭취량 및 음수량의 감소에 기인한 것으로 사료된다(Table 3). 음수량과 사료섭취량의 경우 알코올을 투여한 모든 군이 음성대조군에 비해 감소하였으나, 알코올 투여군에 비해 HD 또는 HCD 투여가 통계적으로 유의한 변화를 야기하지는 않았다(Table 3). 그러나, 간의 무게를 측정한 결과 7일간 투여 후 음성대조군에 비해 알코올 투여군에서 증가(p = 0.
- 이 결과는 부형제로써 dextrin이나 β-cyclodextrin을 사용하는 것에 무관하게 헛개나무과병추출물이 혈중 알코올의 분해에 관여하는 효소의 활성을 증가시킨다는 것을 의미한다.
- 이러한 결과로부터 dextrin보다 β-cyclodextrin이 헛개나무과병추출물 내에 존재하는 알코올성 간손상을 개선하는 물질의 활성에 영향을 미치지 않는다는 것을 의미한다고 추측할 수 있다.
- 이러한 능력에 기인하여, 가혹조건(40℃)에서, 지표성분인 quercetin 함량이 dextrin이 포함된 헛개나무과병추출물에서 0주에 비해 4주와 8주에서 현저하게 감소하였고 β-cyclodextrin이 포함된 헛개나무과병추출물에서는 거의 변화가 없었다.
- HD 투여군과 HCD 투여군에서 ALT, AST 농도의 차이는 나타내지 않았다. 한편 lactate dehydrogenase (LDH)의 활성을 비교한 결과, 음성대조군에 비해 알코올만을 투여한 군이 증가하였으며(p = 0.021), 알코올 대조군에 비해 HD (p = 0.004) 및 HCD (p = 0.002) 투여군에서 낮게 나타났다. HD와 HCD사이에서는 HCD 투여군이 상대적으로 낮은 농도를 나타냈으나 통계적으로 유의한 차이를 보이지는 않았다(Fig.
- 3A). 한편, TG는 음성대조군에 비해 알코올 투여군에서는 증가되지 않았으며, 알코올 투여군과 HD 또는 HCD 투여군 사이에서도 차이가 없었다(Fig. 3B). 그럼에도 불구하고, TG의 혈중 농도가 알코올이나 HD를 투여한 군보다 HCD 투여군에서 더 감소하는 경향을 보였다.
- 혈중 알코올탈수소효소 및 알데히드탈수소효소의 활성도를 측정한 결과, 알코올 투여군에 비해 HD 투여군(p = 0.024)과 HCD 투여군(p = 0.035)에서 알코올탈수소효소의 활성도가 증가하였고 알데히드탈수소효소의 활성도는 통계적으로 유의하지 않았다(Fig. 4). 이 결과는 부형제로써 dextrin이나 β-cyclodextrin을 사용하는 것에 무관하게 헛개나무과병추출물이 혈중 알코올의 분해에 관여하는 효소의 활성을 증가시킨다는 것을 의미한다.
후속연구
- 이러한 사실에 근거하여, 기능성 식품소재의 부형제로써 dextrin을 사용하는 대신 βcyclodextrin을 사용할 수 있으며, 특히 액상에서 안정성이 떨어지는 지표성분을 안정화시키고 천연추출물의 약리효능을 보존하기 위해서도 β-cyclodextrin의 사용은 유용하리라 사료된다.
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