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문제 정의
- 따라서, 본 연구에서는 한국, 중국 남부, 인도 지역에 분포하는 멀구슬나무 종집단과 천련 및 근연속, 근연과내일부 분류군들을 대상으로 핵 DNA(nrDNA) ITS 지역과 엽록체 DNA(cpDNA)의 matK, rbcL, atpF-H, psbK-I 및 psbA-trnH 지역의 염기서열 분석을 수행하여 한약 재료인 천련자의 기원식물인 천련과 널리 재식하는 멀구슬나무의 동종성을 검토하고자 하였다.
제안 방법
- 그 외 채집된 개체들은 석엽표본을 제작하여 고려대학교 식물표본관(KUS)에 증거표본으로 보관하였다(Table 1). DNA 분석은 nrDNA의 ITS 지역, cpDNA의 matK, rbcL, atpF-H, psbK-I, psbA-trnH 지역 등 총 6개 지역의 염기서열을 분석하였다(Table 2).
- DNA 증폭을 위한 PCR은 94oC에서 5분 동안 initial denaturation시킨 후 94oC에서 denaturation 1분, 48−60oC에서 annealing 1분, 72oC에서 extension 1분을 주기로 하여 35회 반복한 후 72oC에서 7분간 extention의 조건으로 수행하였다.
- 62263이었다. ITS 지역의 ML 계통수에서 참죽나무는 100% bootstrap(BP) 값으로 가장 먼저 분기하였고, 이후 76% BP값으로 지지되는 님나무와 멀구슬나무속 집단으로 구성된 분계조로 분기하였다. 멀구슬나무속 집단은 단계통군을 형성하였으며 95% BP값에 의해 이들의 단계통성이 지지되었다.
- MP 분석은 gap을 제5의 형질상태(new state)로 취급하여 heuristic searches 방법으로 분석하였으며 ‘TBR’ branch swapping, ‘collapse of zero branch lengths’, ‘MULPARS’ 및 ‘ACCTRAN’ option 등을 적용하였다.
- PCR 산물은 MEGA quick-spin™ Total Fragment DNA Purification Kit (Intron)을 이용하여 정제하였으며, 정제된 PCR 산물은 ABI PRISM 3730xl DNA sequencer로 염기서열을 결정하였다.
- nrDNA와 cpDNA 계통수 (Fig. 1 vs. Fig. 2) 간에 CHIYUN3 개체를 포함 몇몇 개체의위치가 달라서 두 염기서열 자료 간의 유사도를 평가하기 위하여 IM 지수를 계산하였다. IM 지수를 백분율로 환산한 결과 두 자료간에는 4.
- , 2011)내의 MUSCLE (Edgar, 2004)을 이용하여 정렬하였다. 계통수 제작은 PAUP* ver 4.0b10을 이용하여 Maximum parsimony (MP) 분석과 Neighbor joining (NJ) 분석, Maximum likelihood (ML) 분석을 수행하였다. MP 분석은 gap을 제5의 형질상태(new state)로 취급하여 heuristic searches 방법으로 분석하였으며 ‘TBR’ branch swapping, ‘collapse of zero branch lengths’, ‘MULPARS’ 및 ‘ACCTRAN’ option 등을 적용하였다.
- 멀구슬나무속 16개체를 포함하여 멀구슬나무과 3종 18개체와 이들의 외군으로 무환자나무과 2종 2개체를 대상으로 nrDNA ITS 지역의 염기서열 자료와 cpDNA matK, rbcL, atpF-H, psbK-I, psbA-trnH 지역의 염기서열 유합자료를 기초로 하여 각각 ML, MP, NJ 계통수를 제작하였다. ITS 지역과 cpDNA 5개 마커를 유합한 지역들의 ML 분석결과 log likelihood (LN) 값은각각 -2390.
- 멀구슬나무속 집단과 근연속, 근연과내 분류군을 대상으로 ITS 지역 염기서열을 기초로 한 NJ, MP, ML 계통수와 cpDNA의 5개 지역을 유합한 염기서열을 기초로 한 NJ, MP, ML 계통수에서 멀구슬나무속 집단은 단계통군을 형성하였으며, 님나무가 각각 100% 값으로 자매군을 형성하였다(Figs. 1, 2). 이러한 결과는 멀구슬나무족내 멀구슬나무와 님나무가 자매군을 형성하는 Muellner et al.
- 모든 형질은 ‘equal weight’로 처리하였으며 Consistency index (CI), Retention index(RI), Rescaled consistency index (RC)을 산출하였다.
대상 데이터
- 추출한 DNA는 모두 한국의 식물 DNA은행 (PDBK TC2008-2036, TC2011-1222, TC2013-1829-1836, TI2009-0012, TI2009-0014, 2005-1245, 2006-0828, 2007-0412, 2008-0437, 2008-1092, 2009-0707, 2010-0375, 2010-1846)에 보관하였다. PCR 증폭 마커로는 바코드 콘소시움에서 검증한 마커 중 cpDNA 5개 지역의 프라이머들을 사용하였고 (CBOL Plant Working Group, 2009), nrDNA의 ITS 지역의 경우에는 White et al. (1990)의 프라이머를 사용하였다. DNA 증폭을 위한 PCR은 94oC에서 5분 동안 initial denaturation시킨 후 94oC에서 denaturation 1분, 48−60oC에서 annealing 1분, 72oC에서 extension 1분을 주기로 하여 35회 반복한 후 72oC에서 7분간 extention의 조건으로 수행하였다.
- 본 연구는 환경부 “차세대에코이노베이션기술개발사업(과제번호 416-111-007)”의 지원을 받아 수행되었습니다. 본 연구에 이용된 DNA는 한국의 식물 DNA은행 (PDBK TC2008-2036, TC2011-1222, TC2013-1829--1836, TI2009-0012, TI2009-0014, 2005-1245, 2006-0828, 2007-0412, 2008-0437, 2008-1092, 2009-0707, 2010-0375, 2010-1846) 에 보존되고 있으며 이용 가능하다.
- 본 연구에서는 중국 운남성 지역에서 채집한 천련(M. toosendan) 8개체와 중국 남동부, 인도, 국내에서 채집한 멀구슬나무(M. azadarach) 8개체, 님나무(Neem, A. indica) 1개체, 참죽나무(Toona sinensis) 1개체, 외군으로서 멀구슬나무과와 유연관계가 깊은 것으로 알려진 무환자나무과의 무환자나무(Sapindus mukorossi) 1개체, 모감주나무(Koelreuteria paniculata) 1개체 등을 생체 재료로 사용하였다. 중국 운남성 지역에서 채집한 천련 8개체는 현지에서 천련자의 재료로 채취되는 자생하는 개체들로서, DNA분석을 위한 시료만 채집되었다.
데이터처리
- NJ 계통수와 ML 계통수의 작성된 각 분계도의 지지도를 평가하기 위한 bootstrap 값은 1,000번 반복을 통하여 산출하였다(Felsenstein, 1985). nrDNA와 cpDNA 염기서열 자료 간의 유사도를 평가하기 위하여 PAUP* ver 4.0b10을 이용하여 위상의존 제한분석(topology dependent constraint analysis)을 수행한 후 IM (Miyamoto index) 지수를 산출하였다(Kim and Jansen, 1994; Kim, 1996).
- 양 방향으로 결정한 염기서열들은 Sequencher (v. 4.8; Gene Code Corporation, Ann Arbor, MI, USA) 프로그램을 사용하여 조합하였다. 완성된 염기서열정보는 유전자 또는 지역별로 NCBI GenbBank에 등록하였으며 각각 20개의 등록번호는 Table 2에 표시하였다.
이론/모형
- 6개 지역 자료의 염기변이(nucleotide divergence)는 Kimura’s two-parameter method 을 이용하여 계산하였고(Kimura, 1980), 이 값을 기초로 NJ tree를 산출하였다(Farris et al., 1996).
- , 1996). ML 분석은 Modeltest 3.7 (Posada and Crandall, 1998)을 이용하여 nrDNA ITS 지역의 염기서열은 TrN+G 모델로, cpDNA 5개 지역의 유합한 염기서열은 K81uf+G 모델을 선정한 후 각각 염기들의 염기전이(transition)와 염기전환(transversion) 값을 적용하여 수행하였다. NJ 계통수와 ML 계통수의 작성된 각 분계도의 지지도를 평가하기 위한 bootstrap 값은 1,000번 반복을 통하여 산출하였다(Felsenstein, 1985).
- 모든 형질은 ‘equal weight’로 처리하였으며 Consistency index (CI), Retention index(RI), Rescaled consistency index (RC)을 산출하였다. MP 계통수의 지지도를 평가하기 위한 bootstrap 값은 위에 제시된 MP 분석 방법으로 1,000번 반복하여 산출하였다(Felsenstein, 1985). 6개 지역 자료의 염기변이(nucleotide divergence)는 Kimura’s two-parameter method 을 이용하여 계산하였고(Kimura, 1980), 이 값을 기초로 NJ tree를 산출하였다(Farris et al.
- 냉동 보관된 재료는 액체질소와 막자사발을 이용하여 분쇄한 후 CTAB 방법(Doyle and Doyle, 1987)과 G-spin™ IIp Genomic DNA Extraction Kit(Intron)을 사용하여 DNA를 추출하였다.
- 완성된 염기서열정보는 유전자 또는 지역별로 NCBI GenbBank에 등록하였으며 각각 20개의 등록번호는 Table 2에 표시하였다. 염기서열 정보들은 지역별로 유합한 후, Geneious pro 5.5 (Drummond et al., 2011)내의 MUSCLE (Edgar, 2004)을 이용하여 정렬하였다. 계통수 제작은 PAUP* ver 4.
성능/효과
- psbA-trnH 지역의 경우 6개 지역 중 가장 많은 20개의 indel이 있었다. 6개 지역의 염기서열을 유합한 결과, 이들 염기서열의 총 3,893 bp로 정렬되었다. 정렬된 6개 지역의 유합 자료에서 indel의 수는 38개였으며, 29개 사이트에서 염기치환 변이가 일어났고 이 중 계통학적으로 정보를 갖는 형질 수는 20개로 나타났다.
- CpDNA 지역들을 유합한 ML 계통수에서는 ITS 계통수와 동일하게 참죽나무와 님나무는 뚜렷이 구별되었으며, 멀구속나무속은 100%의 지지도로 단계통군을 형성하였다. 천련 2개체(CHI-YUN2, CHI-YUN4)는 ITS 계통수에서 멀구슬나무 집단과 분계조를 형성하였으나, ML 계통수에서는 운남성에서 채집한 천련 3개체(CHI-YUN6, CHIYUN7, CHI-YUN8)와 53%의 낮은 BP값으로 분계조를 형성하였다.
- 2) 간에 CHIYUN3 개체를 포함 몇몇 개체의위치가 달라서 두 염기서열 자료 간의 유사도를 평가하기 위하여 IM 지수를 계산하였다. IM 지수를 백분율로 환산한 결과 두 자료간에는 4.5% (32/704)로 불일치도(즉 95.5%의 일치도)를 나타냈다. 따라서 두 개의 자료를 독립분석하거나 유합분석하거나 큰 차이는 없는 것으로 평가되었다.
- 각 지역의 염기서열을 정렬한 결과, ITS는 748−749bp, atpF-H는 635−637bp, psbA-trnH는 541−561 bp 이었고, matK, rbcL, psbK-I는 843 bp, 703 bp, 392 bp로 모든 개체들의 염기서열의 길이가 동일하였다. ITS지역은 6개의 지역 중에서 가장 많은 13개의 사이트에서 염기치환변이가 일어났으며 CHIYUN3, CHI-YUN6 2개체와 CHI-YUN7, CHI-YUN8 2개체는 각각 4개, 5개의 사이트가 계통학적으로 정보를 갖는 형질로 나타났다. psbA-trnH 지역의 경우 6개 지역 중 가장 많은 20개의 indel이 있었다.
- 2). MP 분석 결과, ITS 지역은 443 단계로 구성된 4개의 MP 계통수를 얻었으며, CI, RI, RC 값은 각각 0.923, 0.821, 0.758 이었다. ITS 지역의 MP BP 분석 결과 얻어진 50% 이상 지지되는 node를 나타낸 계통수는 NJ 계통수와 같은 topology를 가지고 있었다.
- 866 이었다. cpDNA 지역의 MP BP 분석 결과 얻어진 50% 이상 지지되는 node를 나타낸 계통수는 NJ 계통수와 동일하게 참죽나무와 님나무가 뚜렷이 구별되었으며 멀구슬나무속 집단은 100% 지지도로 2개의 분계조를 형성하였다(Fig. 2와 동일). ITS 지역의 MP, NJ 계통수와 cpDNA 지역들을 유합한 MP, NJ 계통수는 각 지역의 ML 계통수와 같은 topology을 보여 여기에 그림으로 제시하지는 않았다.
- ITS 지역의 MP BP 분석 결과 얻어진 50% 이상 지지되는 node를 나타낸 계통수는 NJ 계통수와 같은 topology를 가지고 있었다. cpDNA를 유합한 지역의 MP 분석 결과, 1,296 단계로 구성된 10개의 MP 계통수를 얻었으며 CI, RI, RC 값은 각각 0.945, 0.916, 0.866 이었다. cpDNA 지역의 MP BP 분석 결과 얻어진 50% 이상 지지되는 node를 나타낸 계통수는 NJ 계통수와 동일하게 참죽나무와 님나무가 뚜렷이 구별되었으며 멀구슬나무속 집단은 100% 지지도로 2개의 분계조를 형성하였다(Fig.
- 각 지역의 염기서열을 정렬한 결과, ITS는 748−749bp, atpF-H는 635−637bp, psbA-trnH는 541−561 bp 이었고, matK, rbcL, psbK-I는 843 bp, 703 bp, 392 bp로 모든 개체들의 염기서열의 길이가 동일하였다.
- 개체간의 염기변이를 Kimura’s two parameter method로 계산하여 백분율로 환산한 결과, 6개 지역을 유합한 멀구슬나무속 16개체의 염기변이는 0−0.7%이었으며(Table 3), 님나무, 참죽나무, 무환자나무 및 모감주나무를 포함한 20개체의 6개 지역을 유합한 멀구슬나무 16개체 염기변이는 0-0.45%이었다.
- 국내에서 채집한 멀구슬나무 5개체는 1개체(KOR3)가 matK 지역에서 1 bp 염기치환이 존재하고 나머지 지역에서는 동일한 염기서열을 갖는 것으로 나타나 본 연구에서 사용한 6개의 marker가 한국산과 중국산 멀구슬나무를 식별하는 데 유용한 marker가 될 수 있다는 것을 확인하였다. 이는 한국에 야생 또는 재배하는 멀구슬나무가 비교적 동일한 집단 또는 개체에서 기원하여 퍼져나갔을 가능성을 암시한다.
- 또한 운남성에서 채집한 3개체(CHIYUN1, CHI-YUN3, CHI-YUN5)와 동일한 지역에서 채집한 5개체간의 염기변이는 0.17−0.45% 로 한국 개체간의 염기변이 0.06−0.14% 보다 높게 나타나는 것으로 밝혀졌다 (Table 4).
- 멀구슬나무속 16개체군과 근연속 식물인님나무간의염기변이는 3.09−3.15% 로나타났다(Table 4).
- 멀구슬나무속 집단의 염기서열을 비교 분석한 결과, 중국남동부 지역에서 채집한 멀구슬나무 2개체(CHI-FUJ, CHI-GUA)와 천련 1개체(CHI-YUN1)는 동일한 염기서열을 공유하였으며 ML 계통수에서도 멀구슬나무집단에 함께 유집되었다. 또한 운남성에서 채집한 3개체(CHIYUN1, CHI-YUN3, CHI-YUN5)와 동일한 지역에서 채집한 5개체간의 염기변이는 0.
- 이상의 연구 결과를 종합하면 본 연구에 이용된 천련과 멀구슬나무 개체들은 단계통군을 형성하고, 유전적 다양성이 낮은 동일종으로 판단된다. 멀구슬나무(Melia azadarch L.
- 6개 지역의 염기서열을 유합한 결과, 이들 염기서열의 총 3,893 bp로 정렬되었다. 정렬된 6개 지역의 유합 자료에서 indel의 수는 38개였으며, 29개 사이트에서 염기치환 변이가 일어났고 이 중 계통학적으로 정보를 갖는 형질 수는 20개로 나타났다.
- 나아가 멀구슬나무의 자매군은 님나무로 판명되었다. 중국 운남에서 채집한 천련 3개체(CHI-YUN1, CHI-YUN3, CHI-YUN5)는 동일한 지역에서 채집한 다른 천련 개체들보다 한국에서 채집한 멀구슬나무 개체들과 더 낮은 염기변이를 나타내었다. 따라서 중국에서 천련자로 유통되는 천련(Melia toosendan)은 Peng and Mabberley (2008)의 견해에 따라 멀구슬나무의 이명으로 처리하는 것이 타당한 것으로 판단된다.
후속연구
- 또한 멀구슬나무의 열매를 천련자로 이용하는데 합법적인 증거자료로 제시될 수 있다. 그러나 산지나 채취시기에 따라서 화학 성분의 양적 및 질적인 차이는 있을 수 있으므로 이에 대한 분석이 같이진행되는 것이 바람직할것이다.
- 본 연구 결과는 열매의 크기, 엽연의 형태 등에 있어서의 천련의 변이 폭과 멀구슬나무의 변이 폭이 중첩되므로 단일종으로 인식한 Peng and Mabberley (2008)의 견해를 지지한다. 나아가 본 연구 결과는 천련을 멀구슬나무의 이명으로 처리한 분류학적 견해를 지지한다.
- azadarach)의 이명으로 처리되었다. 따라서 천련자의 기원식물인 천련과 멀구슬나무의 동종성을 검증할 분자계통학적 연구가 요구된다. 한편, 멀구슬나무속이 포함되는 상위분류군에 대한 계통연구로는 Pennington and Styles(1975)이 멀구슬나무과 전반에 관하여 분류학적 유연관계를 정리한바있다.
- 본연구의결과는천련에서 기원한 천련자와 멀구슬나무의 열매가 동일한 종이라는 것을 분자계통학적으로 입증한 것으로 우리나라 약전과 중국 약전의 차이를 설명하는 근거자료가 될 것이다. 또한 멀구슬나무의 열매를 천련자로 이용하는데 합법적인 증거자료로 제시될 수 있다. 그러나 산지나 채취시기에 따라서 화학 성분의 양적 및 질적인 차이는 있을 수 있으므로 이에 대한 분석이 같이진행되는 것이 바람직할것이다.
- , 2014). 본연구의결과는천련에서 기원한 천련자와 멀구슬나무의 열매가 동일한 종이라는 것을 분자계통학적으로 입증한 것으로 우리나라 약전과 중국 약전의 차이를 설명하는 근거자료가 될 것이다. 또한 멀구슬나무의 열매를 천련자로 이용하는데 합법적인 증거자료로 제시될 수 있다.
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