본 연구에서는 새로운 국내 생태독성평가 시험 생물종으로서 유글레나의 적용가능성을 평가하기 위하여 국내 서식종인 E. agilis를 이용하여 5종의 휘발성 유기용 매(Acetone, Dimethyl sulfoxide (DMSO), Ethanol, Methanol)에 의한 독성영향을 평가하였다. E. agilis의 식물적 특성을 이용한 급성독성영향 평가 결과, D. magna에 비해 DMSO에 대한 독성민감도가 상대적으로 낮았으나 전반적으로 비교생물 종과 유사하거나 민감하였다. E. agilis의 동물적 특성을 이용한 세포반응 시험 결과, Chloroform의 경우 반수영향을 야기하는 시험물질농도(96시간 $EC_{50}$)에 상당히 신속하고 민감한 독성반응을 나타내었다. 환경시료에 대한 모니터링 목적으로 다양한 생물 종을 이용한 생물검정 기법 적용이 증가하고 있는 추세이다. 수 생태 환경관리를 목적으로 새로운 생태독성시험 개발에 적용할 생물 종은 국내 수질환경에 적합하고 배양이 용이하며 다양한 유해화학물질에 대한 독성이 민감해야 한다. 또한 반응시간이 짧아 실시간으로 모니터링이 가능할 뿐만 아니라 경제성도 고려되어야한다. 본 연구의 결과 E. agilis는 배양이 용이하고 다루기 쉬우며 생장율(growth rate), 이동속도(velocity), 활동도(motility), 세포형태(com-pactness) 등 식물적 특성과 더불어 동물적 특성과 연계된 인자들을 종말점으로 독성시험을 수행할 수 있다. 따라서 E. agilis는 다양한 유해화학 물질 및 환경시료에 대하여 신속하고 민감한 독성반응 도출이 가능할 것으로 예상되며 향후 국내 수질관리를 위한 새로운 생태독성 영향평가 생물 종으로 적용될 수 있을 것으로 판단된다.
본 연구에서는 새로운 국내 생태독성평가 시험 생물종으로서 유글레나의 적용가능성을 평가하기 위하여 국내 서식종인 E. agilis를 이용하여 5종의 휘발성 유기용 매(Acetone, Dimethyl sulfoxide (DMSO), Ethanol, Methanol)에 의한 독성영향을 평가하였다. E. agilis의 식물적 특성을 이용한 급성독성영향 평가 결과, D. magna에 비해 DMSO에 대한 독성민감도가 상대적으로 낮았으나 전반적으로 비교생물 종과 유사하거나 민감하였다. E. agilis의 동물적 특성을 이용한 세포반응 시험 결과, Chloroform의 경우 반수영향을 야기하는 시험물질농도(96시간 $EC_{50}$)에 상당히 신속하고 민감한 독성반응을 나타내었다. 환경시료에 대한 모니터링 목적으로 다양한 생물 종을 이용한 생물검정 기법 적용이 증가하고 있는 추세이다. 수 생태 환경관리를 목적으로 새로운 생태독성시험 개발에 적용할 생물 종은 국내 수질환경에 적합하고 배양이 용이하며 다양한 유해화학물질에 대한 독성이 민감해야 한다. 또한 반응시간이 짧아 실시간으로 모니터링이 가능할 뿐만 아니라 경제성도 고려되어야한다. 본 연구의 결과 E. agilis는 배양이 용이하고 다루기 쉬우며 생장율(growth rate), 이동속도(velocity), 활동도(motility), 세포형태(com-pactness) 등 식물적 특성과 더불어 동물적 특성과 연계된 인자들을 종말점으로 독성시험을 수행할 수 있다. 따라서 E. agilis는 다양한 유해화학 물질 및 환경시료에 대하여 신속하고 민감한 독성반응 도출이 가능할 것으로 예상되며 향후 국내 수질관리를 위한 새로운 생태독성 영향평가 생물 종으로 적용될 수 있을 것으로 판단된다.
Acute toxicity tests for 5 organic solvents were conducted using Euglena agilis carter (E. agilis), a Korean domestic organism. Organic solvents decreased the growth rate of E. agilis in a dose dependent manner. The toxicity to E. agilis was increased in the order of chloroform>acetone${\geq}$<...
Acute toxicity tests for 5 organic solvents were conducted using Euglena agilis carter (E. agilis), a Korean domestic organism. Organic solvents decreased the growth rate of E. agilis in a dose dependent manner. The toxicity to E. agilis was increased in the order of chloroform>acetone${\geq}$ethanol${\geq}$methanol>DMSO based on $EC_{50}$ values from growth test. Organic solvents also induced cell motility and morphological changes of E. agilis. Especially significant effects on the cell swimming velocity, motility, and compactness were observed for chloroform at the concentration of $EC_{50}$ calculated from 96 hr growth test. Overall, toxic responses of E. agilis to test substances are comparable to or more sensitive than D. magna, M. macrocopa and V. fischeri. Our study demonstrates that E. agilis can be a putative ecotoxicity test model organism to assess domestic water quality. Results obtained from this study can be applied to establish the standard test guidelines for ecotoxicity test using E. agilis.
Acute toxicity tests for 5 organic solvents were conducted using Euglena agilis carter (E. agilis), a Korean domestic organism. Organic solvents decreased the growth rate of E. agilis in a dose dependent manner. The toxicity to E. agilis was increased in the order of chloroform>acetone${\geq}$ethanol${\geq}$methanol>DMSO based on $EC_{50}$ values from growth test. Organic solvents also induced cell motility and morphological changes of E. agilis. Especially significant effects on the cell swimming velocity, motility, and compactness were observed for chloroform at the concentration of $EC_{50}$ calculated from 96 hr growth test. Overall, toxic responses of E. agilis to test substances are comparable to or more sensitive than D. magna, M. macrocopa and V. fischeri. Our study demonstrates that E. agilis can be a putative ecotoxicity test model organism to assess domestic water quality. Results obtained from this study can be applied to establish the standard test guidelines for ecotoxicity test using E. agilis.
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문제 정의
따라서 본 연구에서는 E. agilis가 국내 수 생태계의 독성 및 위해성을 평가하기 위한 시험 생물 종으로서의 적용가능성을 평가하기 위하여 총 5종의 시험물질(acetone, chloroform, dimethyl sulfoxide (DMSO), ethanol, methanol)에 대한 독성영향을 측정하여 현재 생태독성 시험 생물 종인 물벼룩(D. magna)과 생태독성평가 후보 생물 종인 국내 서식 물벼룩(Moina macrocopa, M. macrocopa)과 해양 발광박테리아(Vibrio fischeri, V. fischeri)의 독성민감도와 비교하였다.
생물을 이용하여 환경유해 화학물질에 대한 영향을 평가할 경우, 시험물질의 노출시기, 노출기간 및 노출방법 등 적용된 시험방법에 따라 생물에게 발현되는 양상이 다양하게 나타날 수 있다. 따라서 본 연구에서는 표준화된 독성 시험법 개발을 위한 기초연구로 배양액 pH, 배양용량, 초기접종 세포밀도, 그리고 노출환경조건(open 혹은 close)에 의한 E. agilis의 생장 영향을 측정하였다.
본 연구에서는 새로운 국내 생태독성평가 시험 생물 종으로서 유글레나의 적용가능성을 평가하기 위하여 국내 서식종인 E. agilis를 이용하여 5종의 휘발성 유기용매(Acetone, Dimethyl sulfoxide (DMSO), Ethanol, Methanol)에 의한 독성영향을 평가하였다. E.
가설 설정
4) 용량-반응 곡선과 반수영향농도(EC50)를 비교한 결과 DMSO가 가장 독성이 낮았고 methanol, ethanol, acetone순으로 독성이 높아졌으며 chloroform의 독성이 가장 높게 측정되었다(Table 3). Acetone과 ethanol의 최저영향농도(LOEC)는 각각 5.0과 10 mL L-1이고 E. agilis에 해를 나타내지 않는 최고 농도를 무영향농도(NOEC)로 가정할 때 DMSO와 methanol의 NOEC는 각각 12.5와 10.0 mL L-1로 측정되었다(Table 3).
제안 방법
5종 유기용매(acetone, chloroform, dimethyl sulfoxide(DMSO), ethanol, methanol)를 시험물질로 유글레나 생장 저해시험을 수행하였다. 시험은 지수생장기에 도달한 세포를 이용하여 수행하였으며 실험과정은 다음과 같다.
5종의 휘발성 유기용매(acetone, chloroform, DMSO, ethanol, 그리고 methanol)에 대한 E. agilis 생장 저해시험을 수행하였다. 시험 결과, 시험물질의 농도가 증가할수록 E.
5×105 cells mL-1)에 배양액(Table 1)으로 희석한 각 유기용매를 농도별로 처리한 후 공기와 접촉하지 않은 상태(closed with head space)로 배양하였다. 96시간 경과 후 세포밀도를 측정하여 다음과 같은 식에 의해 세포 생장 저해율(cell growth inhibition rate)을 산출하였다.
Open과 close 환경에 의한 세포 생장영향은 20 mL 시험용기에 초기 세포밀도를 약 0.2×105, 0.5×105, 그리고 1.5×105 cells mL-1로 접종한 후 멸균거즈와 솜을 이용하여 공기가 통하게 한 상태(open)와 공기가 통하지 않도록 마개로 입구를 밀봉한 상태(closed with head space)로 5일간 배양하며 측정하였다.
각 시험물질에 총량의 1/10 (v/v)에 해당하는 OAS(osmotic adjusting solution)를 첨가한 후 농도별로 희석한 시료를 준비하였다. 독성영향은 V. fischeri의 초기 발광도와 대조군 및 시료에 노출 5분, 15분, 그리고 30분 경과 후의 발광도를 측정한 후 EC50 (Half maximal effective concentration)을 산출하였다.
fischeri의 독성영향과 비교하여 Table 4에 나타내었다. 동일시험물질에 대하여 해양 발광박테리아(V. fischeri)를 이용한 독성시험을 수행하였고 독성민감도 비교에 이용된 D. magna와 M. macrocopa의 EC50 값은 문헌조사를 통해 얻은 값이다. V.
따라서 본 연구에서는 E. agilis를 이용하여 close 환경에서 시험물질에 대한 독성시험의 적용가능성을 평가하기 위해 20 mL 시험용기(총 부피: 10 mL)에 초기 세포밀도를 약 0.2×105, 0.5×105, 그리고 1.5×105 cells mL-1로 접종한 후 open과 close 환경으로 4일간 배양하며 세포 생장영향을 측정하였다.
또한 촬영된 세포반응 이미지(1초에 4번, 총 2분)를 이용하여 E. agilis의 운동성 파라미터(swimming velocity, motility)를 측정하였다(Tahedl and Häder, 2001).
5×105 cells mL-1로 접종한 후 멸균거즈와 솜을 이용하여 공기가 통하게 한 상태(open)와 공기가 통하지 않도록 마개로 입구를 밀봉한 상태(closed with head space)로 5일간 배양하며 측정하였다. 배양액 pH에 의한 영향은 위의 실험과 동일한 조건하에 배양액의 pH를 변화시켜(pH 5, pH 6, pH 7) 수행하였다. 세포 밀도는 혈구계수판(superior, Germany)을 이용하여 Inverted microscope (CKX41, Olympus, Japan)로 측정한 뒤 다음과 같은 식에 의해 세포 생장률(cell growth rate, μ)을 산출하였다.
세포 밀도는 혈구계수판(superior, Germany)을 이용하여 Inverted microscope (CKX41, Olympus, Japan)로 측정한 뒤 다음과 같은 식에 의해 세포 생장률(cell growth rate, μ)을 산출하였다.
agilis의 세포반응을 관찰 및 측정하였다. 세포반응 관찰 시험은 각 시험물질을 처리 후 E. agilis 세포를 현미경(Inverted microscope, CKX41, Olympus, Japan)으로 관찰하였다. 또한 촬영된 세포반응 이미지(1초에 4번, 총 2분)를 이용하여 E.
E. agilis의 세포 반응 시험
시험물질에 의한 E. agilis의 세포반응을 관찰 및 측정하였다
. 세포반응 관찰 시험은 각 시험물질을 처리 후 E.
시험물질의 물리화학적 특성에 따른 표준 독성시험방법을 수립하기 위하여 배양환경 조건에 의한 세포생장을 측정하였다. 초기 세포밀도 변화에 의한 유글레나 생장영향은 100 mL 삼각플라스크 또는 20 mL 시험용기에 약 0.
이에 본 연구에서는 5종의 시험물질에 대하여 E. agilis의 세포반응을 관찰하였고 가장 독성이 높은 chloroform에 대하여 E. agilis 세포의 운동성 변화에 기인된 movement parameters (swimming velocity, motility, compactness)를 측정하였다. 세포반응 관찰 결과 각 물질의 EC50 (E.
초기 세포밀도 변화에 의한 유글레나 생장영향은 100 mL 삼각플라스크 또는 20 mL 시험용기에 약 0.2×105, 0.5×105, 그리고 1.5×105 cells mL-1로 접종하여 5일간 배양하며 측정하였다.
대상 데이터
Acetone, chloroform, dimethyl sulfoxide (DMSO), ethanol, methanol은 시그마알드리치사(Sigma-Aldrich, USA)로부터 구입하여 사용하였다. 그 외 모든 시약은 고순도의 실험용 시약을 사용하였다.
본 실험에 이용된 E. agilis는 인천대학교 수서독성 생리생태학 실험실에서 분양받아 사용하였다. Sodium acetate가 포함된 mineral medium 배양액(Starr 1971) (Table 2)에 접종된 유글레나는 조도 2800 Lux, 온도 24±1°C, 광주기 16 : 8 (light : dark)의 비율로 유지하며 배양하였다.
5종 유기용매(acetone, chloroform, dimethyl sulfoxide(DMSO), ethanol, methanol)를 시험물질로 유글레나 생장 저해시험을 수행하였다. 시험은 지수생장기에 도달한 세포를 이용하여 수행하였으며 실험과정은 다음과 같다. E.
데이터처리
대조군과 실험군의 유의성 검정은 students t-test로 비교하였고 SAS 통계프로그램을 이용하여 95% 신뢰구간을 포함한 EC05, EC50을 분석하였으며 모든 통계 값에서 유의 수준은 0.05 이하(p<0.05)로 하였다.
성능/효과
5×105 cells mL-1로 접종한 후 open과 close 환경으로 4일간 배양하며 세포 생장영향을 측정하였다. 96시간 경과 후 배양액 pH 및 초기 세포밀도에 의한 생장율의 변화가 관찰되었으나 open과 close 환경에 의한 생장율 변화는 높지 않았다(Fig. 2). 특히 pH 5와 pH 6인 조건에서 초기 세포밀도가 1.
fischeri와 유사하였다. DMSO에 대한 E. agilis의 독성민감도는 M. macrocopa와 D.magna에 비해 약 1.5~9.2배 낮았다. Ethanol에 대한 E.
E. agilis의 독성민감도는 acetone에 대하여 D. magna보다 낮았으나 V. fischeri와 유사하였고 M. macrocopa보다 약 3배 정도 높았다. Chloroform에 대하여 E.
5배 정도 높았다(Table 4). E. agilis의 독성민감도는 시험물질별로 상이하나 전반적으로 D. magna보다 낮았다. 그러나 M.
magna에 비해 DMSO에 대한 독성민감도가 상대적으로 낮았으나 전반적으로 비교생물 종과 유사하거나 민감하였다. E. agilis의 동물적 특성을 이용한 세포반응 시험 결과, Chloroform의 경우 반수영향을 야기하는 시험물질농도(96시간 EC50)에 상당히 신속하고 민감한 독성반응을 나타내었다. 환경시료에 대한 모니터링 목적으로 다양한 생물 종을 이용한 생물검정 기법 적용이 증가하고 있는 추세이다.
agilis를 이용하여 5종의 휘발성 유기용매(Acetone, Dimethyl sulfoxide (DMSO), Ethanol, Methanol)에 의한 독성영향을 평가하였다. E. agilis의 식물적 특성을 이용한 급성독성영향 평가 결과, D. magna에 비해 DMSO에 대한 독성민감도가 상대적으로 낮았으나 전반적으로 비교생물 종과 유사하거나 민감하였다. E.
2배 낮았다. Ethanol에 대한 E. agilis 독성민감도는 D. magna보다 낮으나 M. macrocopa와 V. fischeri보다 각각 약 1.5와 4.5배 정도 높았다. Methanol에 대한 E.
5배 정도 높았다. Methanol에 대한 E. agilis독성민감도는 M. macrocopa와 유사하였고 D. magna보다 낮으며 V. fischeri보다 약 2.5배 정도 높았다(Table 4). E.
V. fischeri에 대한 발광 저해시험 결과 EC50 (15 min)을 기준으로 Chloroform의 독성이 가장 높았으며 Acetone > Methanol > Ethanol > DMSO 순으로 독성이 높았다.
5×105 cell mL-1로 동일하게 유지한 후 배양액의 부피(100 mL 또는 10 mL)와 pH (pH 5, 6, 7) 조건을 변화하여 5일간 측정한 결과이다. 배양액 pH에 의한 세포 생장속도 변화는 초기접종 2일 후부터 나타나기 시작하였으며 배양액의 pH가 5인 조건에서 E. agilis는 가장 좋은 성장을 나타내었다(Fig. 1). 배양용량 차이에 의한 세포 생장율 변화는 없으며 이와 같은 결과는 적은 용량(10 mL, 총 부피)의 독성시험이 가능함을 보여준다.
또한 반응시간이 짧아 실시간으로 모니터링이 가능할 뿐만 아니라 경제성도 고려되어야 한다. 본 연구의 결과 E. agilis는 배양이 용이하고 다루기 쉬우며 생장율(growth rate), 이동속도(velocity), 활동도(motility), 세포형태(com-pactness) 등 식물적 특성과 더불어 동물적 특성과 연계된 인자들을 종말점으로 독성시험을 수행할 수 있다. 따라서 E.
agilis 세포의 운동성 변화에 기인된 movement parameters (swimming velocity, motility, compactness)를 측정하였다. 세포반응 관찰 결과 각 물질의 EC50 (E. agilis, 96 h) 또는 그 이상의 농도에 단 2분 노출되었음에도 E. agilis 세포의 형태 변화가 나타났다(Fig. 5). 특히 chloroform 노출 후 E.
agilis 생장 저해시험을 수행하였다. 시험 결과, 시험물질의 농도가 증가할수록 E. agilis의 세포밀도가 감소하였다(Fig. 3). 시험물질에 의한 세포독성 영향은 농도 의존성을 나타냈으며 농도-반응 관계는 Sigmoid 형태를 나타내었다(Fig.
4). 시험에 사용된 5종의 시료 중 E. agilis는 chloroform에 가장 민감한 반응을 보였으며(Fig. 3, Fig. 4) 용량-반응 곡선과 반수영향농도(EC50)를 비교한 결과 DMSO가 가장 독성이 낮았고 methanol, ethanol, acetone순으로 독성이 높아졌으며 chloroform의 독성이 가장 높게 측정되었다(Table 3). Acetone과 ethanol의 최저영향농도(LOEC)는 각각 5.
2). 이와 같은 결과는 E. agilis를 이용하여 open과 close 환경에서 독성시험 수행이 가능함을 나타내며 휘발성 유기용매에 의한 독성영향 평가 시 closed system 노출시험이 적합할 것으로 판단된다.
5). 특히 chloroform 노출 후 E. agilis 세포의 움직임을 측정한 결과 세포의 평균 이동속도(swimming velocity), 움직임(motility) 그리고 세포 밀집(compactness)은 대조군에 비해 각각 73.0, 94.0, 그리고 29.4% 감소하였다(Fig. 6).
후속연구
agilis는 배양이 용이하고 다루기 쉬우며 생장율(growth rate), 이동속도(velocity), 활동도(motility), 세포형태(com-pactness) 등 식물적 특성과 더불어 동물적 특성과 연계된 인자들을 종말점으로 독성시험을 수행할 수 있다. 따라서 E. agilis는 다양한 유해화학 물질 및 환경시료에 대하여 신속하고 민감한 독성반응 도출이 가능할 것으로 예상되며 향후 국내 수질관리를 위한 새로운 생태독성 영향평가 생물 종으로 적용될 수 있을 것으로 판단된다.
단일 종을 이용한 생태독성평가는 그 시험 종이 어떤 물질에 대해 민감도 특이성을 나타내는 경우 그 물질에 대한 전반적인 독성을 이해하는 데 어려움이 유발될 수 있다. 또한 국내 수계의 실정 및 먹이사슬을 통한 생물 종 간의 상호 관련성 등을 고려한 수질환경 위해성을 평가하기 위해서는 국내 서식 종을 이용한 독성평가기법의 적용이 바람직할 것이다. 이와 같은 단점들을 극복하기 위하여 식물성 플랑크톤(녹조류), 물벼룩류, 어류(알) 등 국내 생물 종을 이용한 생태독성평가 기반연구가 수행되었고 최근 생태독성 시험 생물 종의 다변화를 위한 연구도 진행되고 있다(Nam et al.
본 연구의 결과, E. agilis 세포의 운동성 변화에 기인된 movement parameters (velocity, motility, compactness)를 종말점으로 독성시험을 수행할 경우 시험물질에 대한 세포의 반응시간이 짧아 단시간 내에 독성영향을 측정할 수 있으므로 실시간 모니터링에 효과적으로 적용될 수 있을 것으로 판단된다.
질의응답
핵심어
질문
논문에서 추출한 답변
현재 국내 생태독성 관리제도하에 시행되는 급성독성시험에 사용되는 시험 생물종은 무엇인가?
현재 국내 생태독성 관리제도하에 시행되는 생물시험은 물벼룩 단일종을 이용한 급성독성시험으로 시험 생물종인 Daphnia magna (D. magna)는 국내 수계에 전혀 서식하지 않는 외래 생물 종이다. 단일 종을 이용한 생태독성평가는 그 시험 종이 어떤 물질에 대해 민감도 특이성을 나타내는 경우 그 물질에 대한 전반적인 독성을 이해하는 데 어려움이 유발될 수 있다.
국내 생태독성 관리제도에 사용되는 물벼룩 급성독성시험이 가진 문제점은 무엇인가?
magna)는 국내 수계에 전혀 서식하지 않는 외래 생물 종이다. 단일 종을 이용한 생태독성평가는 그 시험 종이 어떤 물질에 대해 민감도 특이성을 나타내는 경우 그 물질에 대한 전반적인 독성을 이해하는 데 어려움이 유발될 수 있다. 또한 국내 수계의 실정 및 먹이사슬을 통한 생물 종 간의 상호 관련성 등을 고려한 수질환경 위해성을 평가하기 위해서는 국내 서식 종을 이용한 독성 평가기법의 적용이 바람직할 것이다. 이와 같은 단점들을 극복하기 위하여 식물성 플랑크톤(녹조류), 물벼룩류, 어류(알) 등 국내 생물 종을 이용한 생태독성평가 기반연구가 수행되었고 최근 생태독성 시험 생물 종의 다변화를 위한 연구도 진행되고 있다(Nam et al.
식물성 플랑크톤이 수질상태를 파악하기 위해 자주 이용되는 대표적 생물종인 이유는 무엇인가?
식물성 플랑크톤은 1차 생산자로 수중의 넓은 생태적 적응 범위를 가지고 있기 때문에 수중의 물리화학적인 서식 환경의 변화에 따라 반응을 나타내어 하천이나 호수 등의 수질상태를 파악하기 위해 자주 이용되는 대표적인 지표 생물 종이다(Turbak et al. 1986).
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