선택한 단어 수는 입니다.
최소 단어 이상 선택하여야 합니다.
최소 단어 이상 선택하여야 합니다.
선택한 단어 수는 30입니다.
최대 10 단어까지만 선택 가능합니다.
최대 10 단어까지만 선택 가능합니다.
문제 정의
- 따라서 본 연구에서는 항비만 효능에 대한 IK의 생리활성을 알아보기 위해 지방세포 분화에 관련한 유전자들의 감소 및 고지방 식이를 통해 비만을 유도한 마우스 동물모델을 이용하여 체중변화 여부를 검증하고자 하였다.
제안 방법
- IK를 15, 25, 35, 45, 50 μM 농도별로 처리하여 이후 24시간을 배양하였다.
- IK를 15, 25, 35, 45, 50 μM 농도별로 처리하여 이후 24시간을 배양하였다. 세포 독성은 cell viability kit를 이용하여 측정하였다.
- 지방세포 분화 − 3T3-L1 지방전구세포를 6 well plate에 3×105 cells/mL로 계대 후 48시간 동안 배양하였다. 지방세포 분화를 위해 DMEM(10% FBS, P/S/G와 Sodium Pyruvate), 0.5 mM IBMX, 1 M Dex, 1 mg/mL insulin을 포함하는 MDI(methylxanthine, dexamethasone과 insulin을 포함하는 배지) 로 바꿔서 72시간 동안 배양하였다. 이 후 48시간 동안 1 mg/mL insulin을 포함하는 DMEM(10% FBS, P/S/G, Sodium Pyruvate)배지에 세포를 배양한 후 같은 배지에 48시간 동안 한번 더 배양하여 9일 동안 지방전구세포를 지방세포로 분화시켰다.
- Real-time PCR − 지방전구세포를 지방세포로 분화시키는 과정 중 분화배지에 IK 50 μM을 처리하였고, 9일의 분화 과정이 끝난 후 QIAGEN 제품을 이용하여 RNA를 추출 후 대조군과 비교하였다(Table І).
- 24시간 계대배양 후 IK를 15, 25, 35, 45, 50 μM 농도별 처리 후 24시간이 지난 다음 cell viability assay kit를 이용하여 독성을 측정한 결과 독성은 나타나지 않았다(Fig. 1B).
- 3T3-L1 지방전구세포에서 IK의 독성 영향 − IK가 3T3- L1 지방전구세포에서 독성에 미치는 영향을 실험하였다.
- 처음 4주 동안은 고지방식이사료 섭취를 통해 비만 동물 모델로 유도하였고, 이후 4주간 HFDIK는 고지방식이 사료와 함께 PBS용액(1×PBS with 0.5% Tween20)에 녹인 IK 10 mg/kg을 1일 1회 경구투여하였다.
- Oil Red O 염색 − 세포 계대에서 지방세포 분화까지 9일동안의 실험이 끝난 후 10% formalin으로 세포를 고정하였다. Oil Red O 염색시약으로 1시간 동안 지방방울들을 염색하여 세척 후 현미경으로 확인하였다.
- 5% Tween20)에 녹인 IK 10 mg/kg을 1일 1회 경구투여하였다. 마우스의 체중과 식이섭취량은 1일 1회 측정하였으며 8주 간의 사육기간이 끝이 난 후에 혈액과 지방을 추출하여 실험에 사용하였다.
- IK를 15, 25, 35, 45, 50 μM로 처리한 후 농도 의존적으로 지방방울들이 감소되는지 현미경을 통해 관찰하였다(Fig. 2).
- 3T3-L1 지방전구세포 분화에 IK가 미치는 영향 − 3T3- L1 지방전구세포가 지방세포로의 분화에 IK가 미치는 영향을 관찰하기 위해 adipogenesis 관련 유전자들의 발현 감소를 확인하였다.
- IK를 50 μM 농도로 분화배지에 처리하여 실험을 진행하였다. 지방분화 실험이 끝난 다음 세포에서 mRNA를 분리하고 real-time PCR을 통해서 지방합성 및 지방축적과 관련이 있는 유전자들의 mRNA 발현량을 확인하였다. 그 결과 지방전구세포가 지방세포로의 분화와 지방 합성을 과속화 시킬 수 있는 중요한 활성 유전자들15-18) CCAAT/enhancer binding protein alpha(C/EBPα), Peroxisome proliferator-activated receptor gamma(PPARγ), adipocyte-specific lipid binding protein(aP2), sterol regulatory element-binding protein 1(SREBP1), glucose transporter 4(GLUT4), Lipoprotein lipase(LPL)와 acyl CoA synthetase long chain family member(ACSL1)의 발현이 감소됨이 관찰되었다(Fig.
- 체중 및 조직 무게에 미치는 영향 − 고지방식이로 비만이 유도된 C57BL/6J 수컷 마우스를 통해 IK가 체중에 미치는 영향을 조사하고자 10 mg/kg씩 실험동물군에 경구투여하고 그 변화를 확인하였다.
- 체중 및 조직 무게에 미치는 영향 − 고지방식이로 비만이 유도된 C57BL/6J 수컷 마우스를 통해 IK가 체중에 미치는 영향을 조사하고자 10 mg/kg씩 실험동물군에 경구투여하고 그 변화를 확인하였다. 1주 순화기간을 제외한 총 8주 동안 실험동물군들의 체중 변화 및 사료섭취량을 1일 1회 측정하였다. 4주간의 45% 고지방식이사료 섭취를 통해 ND를 제외한 실험군들을 비만동물모델로 유도하였다.
- 1주 순화기간을 제외한 총 8주 동안 실험동물군들의 체중 변화 및 사료섭취량을 1일 1회 측정하였다. 4주간의 45% 고지방식이사료 섭취를 통해 ND를 제외한 실험군들을 비만동물모델로 유도하였다. 그 결과 ND에 비하여 HFD과 HFD-IK의 체중은 2배 가까운 증가를 보여주었다.
- 그 결과 ND에 비하여 HFD과 HFD-IK의 체중은 2배 가까운 증가를 보여주었다. 이후 진행된 4주 동안, 이전 4주 동안 진행했던 식이사료를 계속 섭취하면서 ND와 HFD에게는 PBS용액을 경구투여하고 HFD-IK는 IK를 녹인 PBS용액을 경구투여하였다. 실험 결과 HFD는 ND와 비교하여 체중이 2.
- 이는 HFD-IK에서 비만동물모델의 체중 감소가 열량섭취 차이에 영향을 받아 유도된 결과가 아닌 것으로 사료되며, IK로 인한 식욕억제가 나타나지 않음을 보여준다. 이후 해부를 통해서 간장 주변의 내장지방 감소를 관찰하여 보았다. HFD를 ND와 비교하여 보았을 때 24배 정도 증가한 것에 비해 HFD-IK는 13배 정도의 증가함이 관찰되었다(Fig.
- 3T3-L1 지방전구세포 분화과정 중 중성지방 억제 − 분화 과정 중의 IK 처리가 지방세포 내의 지방방울들의 감소에 영향을 미치는 지를 확인하기 위해 Oil Red O 염색시약을 통해서 지방방울들을 염색하여 확인하였다.
- 5 mM IBMX, 1 M Dex, 1 mg/mL insulin을 포함하는 MDI(methylxanthine, dexamethasone과 insulin을 포함하는 배지) 로 바꿔서 72시간 동안 배양하였다. 이 후 48시간 동안 1 mg/mL insulin을 포함하는 DMEM(10% FBS, P/S/G, Sodium Pyruvate)배지에 세포를 배양한 후 같은 배지에 48시간 동안 한번 더 배양하여 9일 동안 지방전구세포를 지방세포로 분화시켰다.
- 마우스 실험 − 5주령의 수컷 C57BL/6J 마우스를 중앙실험동물㈜로부터 구입하였다. 1주일 동안 사육실에서 순화를 시킨 후 마우스를 정상식이 대조군(ND, normal diet), 45% 고지방식이 대조군(HFD, high-fat diet)과 45% 고지방식이IK 실험군(HFD-IK, high-fat diet with IK)으로 나누어 총 8주간 사육을 진행하였다. 처음 4주 동안은 고지방식이사료 섭취를 통해 비만 동물 모델로 유도하였고, 이후 4주간 HFDIK는 고지방식이 사료와 함께 PBS용액(1×PBS with 0.
대상 데이터
- 시약 및 재료 − Dulbecco’s Modified Eagle’s Medium(DMEM), 100 units/mL Pen/Strep/Glutamine(P/S/G), 100 mM MEM Sodium Pyruvate and Bovine Serum Albumin(BSA)들은 Invitrogen Corporation's GIBCO(Carlsbad, CA, USA)에서 구입하였다.
- 세포 배양 − 3T3-L1 지방전구세포는 10% BSA, P/S/G와 Sodium Pyruvate 를 함유한 DMEM 배지에서 70~80% 배양 후 계대하여 사용하였다.
- β-tubulin은 Santa Cruz Biotechnology(Santa Cruz, CA)에서 구입하였고, goat anti-rabbit IgG HRP-conjugated antibodies는 Invitrogen(Carlsbad, CA)회사에서 구입하였다.
- Cell viability assay kit는 대일랩(Korea)에서 구입하였으며, Cdk2와 PPARγ-specific antibodies는 Cell signaling Tec(Beverly, MA)에서 구입하였다.
- 시약 및 재료 − Dulbecco’s Modified Eagle’s Medium(DMEM), 100 units/mL Pen/Strep/Glutamine(P/S/G), 100 mM MEM Sodium Pyruvate and Bovine Serum Albumin(BSA)들은 Invitrogen Corporation's GIBCO(Carlsbad, CA, USA)에서 구입하였다. Fetal Bovine Serum(FBS)는 Hyclone(Logan, UT)회사 제품을 사용하였다. 3-isobuty-1- methylxanthine(IBMX), dexamethasone(DEX), insulin와 Oil Red O 염색시약은 Sigma Chemical Co.
- 마우스 실험 − 5주령의 수컷 C57BL/6J 마우스를 중앙실험동물㈜로부터 구입하였다.
데이터처리
- 두 실험군 간의 유의성 검정은 Student’s t-test를 이용하여 p<0.05 수준의 경우 통계적 유의성이 있는 것으로 판정하였다.
- 통계 처리 − 실험결과는 평균±표준편차로 표현하였다.
성능/효과
- 8) 이전 연구들을 통해서 들깨 잎은 다양한 방법으로 추출되어 불포화지방산을 비롯한 필수지방산, 플라보노이드(flavonoids) 등과 지용성 비타민에 속하는 비타민 A, D, E들의 함량이 높게 함유되어 있다고보고되어있다. 이를 바탕으로 생리활성 연구를 통해 항암, 항염증, 항산화 및 항알레르기 등과 같은 다양한 효능이 검증되었다.9)
- 비만으로 인한 지방조직의 염증화는 지방조직 안으로 M2 대식세포의 침투가 증가하여 tumor necrosis factor-alpha(TNFα), nitric oxide synthase(iNOS), interleukin-6(IL-6) 등의 발현을 높이기 때문이다. 따라서 항염증에 효능을 보이는 물질이 지방 조직의 염증화를 개선하여 비만으로 질병이 발전함을 억제하는 효능을 보여준다.13) 하지만 아직까지 IK의 뛰어나 항염증 효능에도 불구하고 IK의 항비만 효능과 관련된 연구는 미비한 실정이다.
- 그 결과 지방전구세포가 지방세포로의 분화와 지방 합성을 과속화 시킬 수 있는 중요한 활성 유전자들15-18) CCAAT/enhancer binding protein alpha(C/EBPα), Peroxisome proliferator-activated receptor gamma(PPARγ), adipocyte-specific lipid binding protein(aP2), sterol regulatory element-binding protein 1(SREBP1), glucose transporter 4(GLUT4), Lipoprotein lipase(LPL)와 acyl CoA synthetase long chain family member(ACSL1)의 발현이 감소됨이 관찰되었다(Fig. 3).
- 따라서 IK는 C/EBPα, PPARγ와 SREBP1 유전자들을 감소시킴으로써 이들 유전자들로 인해서 활성화 되는 aP2, GLUT, ACSL1, LPL 유전자들 또한 감소하게 만들어 지방세포분화를 비롯한 지방 합성과 축적을 억제함을 나타내었다.
- C/EBPα와 PPARγ는 지방전구세포가 지방세포로의 분화 단계에서 발현되어지며, 동시에 발현되었을 때 지방세포 특이 유전자들의 mRNA의 전사 활성화를 유도하고 SREBP1의 경우는 PPARγ의 활성을 증가시키는 역할로서 지방세포로의 분화에 영향을 미친다. 따라서 IK를 분화과정 중에 처리함에 따라 이들 유전자들의 감소를 유도하여 지방세포로의 분화를 억제시킴을 나타내었다. C/EBPα, PPARγ와 SREBP1의 발현으로 aP2, GLUT, ACSL1, LPL 등의 지방세포 특이 유전자들이 활성화된다.
- 이후 진행된 4주 동안, 이전 4주 동안 진행했던 식이사료를 계속 섭취하면서 ND와 HFD에게는 PBS용액을 경구투여하고 HFD-IK는 IK를 녹인 PBS용액을 경구투여하였다. 실험 결과 HFD는 ND와 비교하여 체중이 2.4배 증가한 반면 HFD-IK는 1.7배 정도가 증가됨을 보여주었다(Fig. 4A). 체중변화 결과는 weight change/Calorie intake(g/100 kcal)로 계산하였는데19) HFD-IK는 경구투여 전까지 HFD에 비해서 높은 체중변화를 보여주었지만 IK를 경구투여하고 나서는 다소 감소함을 확인하였다(Fig.
- 이후 해부를 통해서 간장 주변의 내장지방 감소를 관찰하여 보았다. HFD를 ND와 비교하여 보았을 때 24배 정도 증가한 것에 비해 HFD-IK는 13배 정도의 증가함이 관찰되었다(Fig. 5). 따라서 비만 동물 모델 실험을 통해 IK는 식욕 감퇴를 일으키지 않으며, 체중 및 내장지방 감소를 유도하고 이는 IK가 항비만 효능이 있음을 나타낸다.
- 5). 따라서 비만 동물 모델 실험을 통해 IK는 식욕 감퇴를 일으키지 않으며, 체중 및 내장지방 감소를 유도하고 이는 IK가 항비만 효능이 있음을 나타낸다. 하지만 추후 이에 관한 메커니즘과 항비만에 대하여 연구가 진행되어야 한다.
- 본 연구는 지방전구세포에 IK를 처리함으로써 지방세포의 분화, 합성 및 지방 축적에 관련한 유전자들이 감소하는 것을 확인할 수 있었으며, 고지방식이로 유도된 비만 동물 모델을 이용한 실험을 통해 HFD-IK에서 체중 및 내장 지방이 감소됨을 확인하였다. 이러한 IK의 항비만 효능은 확연하게 두드러지는 결과를 보여주지는 않았으나 차후 IK가 항비만 개선 및 예방을 위한 천연물 소재로 이용될 개발 가능성을 보여준다.
후속연구
- 본 연구는 지방전구세포에 IK를 처리함으로써 지방세포의 분화, 합성 및 지방 축적에 관련한 유전자들이 감소하는 것을 확인할 수 있었으며, 고지방식이로 유도된 비만 동물 모델을 이용한 실험을 통해 HFD-IK에서 체중 및 내장 지방이 감소됨을 확인하였다. 이러한 IK의 항비만 효능은 확연하게 두드러지는 결과를 보여주지는 않았으나 차후 IK가 항비만 개선 및 예방을 위한 천연물 소재로 이용될 개발 가능성을 보여준다.
※ AI-Helper는 부적절한 답변을 할 수 있습니다.