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문제 정의
- 따라서 본 연구는 농경지에 발생하는 벼과 잡초를 대상으로 엽록체 DNA의 rbcL과 matK, 핵 DNA의 ITS 부위를 바코드하고 그 결과를 미국 국립생물공학정보센터 (National Center for Biotechnology Information, NCBI)에 등록하여 일반인들이 쉽게 이용할 수 있는 기초 자료를 축적하고자 수행하였다.
- 고등 식물에서는 단일마커로 바코드 조건을 충족할 수 없어 엽록체 DNA의 rbcL과 matK 유전자를 표준마커로 이용하고 있다. 본 연구는 식물 표준 바코드마커와 핵 DNA의 ITS 부위를 이용하여 국내 벼과 식물 252 분류군 중 주로 농경지에서 발생하는 잡초 총 84분류군 403생태형을 바코드하여 데이터베이스를 구축하기 위하여 수행하였다. 바코드 결과 PCR 증폭과 염기서열 분석 성공률은 rbcL에서 가장 높았으며 matK에서 가장 낮았다.
제안 방법
- , 2012). Neighbor-joining dendrogram (Saitou and Nei, 1987)을 작성하여 각 분류군의 단계통 형성여부와 각 마커별 종식별 해상력을 확인하였다.
- 경기도, 강원도, 충청도, 전라도, 경상도, 제주도와 울릉도 등 전국에서 84분류군 341 생태형을 채집하고 국립생물자원관에서 28종 62생태형의 표본을 대출하여 총 84분류군 403생태형을 엽록체 DNA의 rbcL과 matK, 핵 DNA의 ITS 부위를 이용하여 바코드하였다(Supplementary table 1). 본 연구에 이용한 식물재료는 Chen and Peterson (2006)과 Park et al.
- 벼과의 바코드데이터는 미국의 국립생물공학정보센터에 기탁하여 genbank 번호를 부여받아 공개하였다. 그러므로 형태적으로 동정이 어려운 벼과 잡초를 matK와 ITS 부위의 염기서열을 분석하여 미국의 국립생물공학정보센터에 기탁한 데이터와 비교함으로써 쉽고 간편 하게 동정할 수 있게 되었다.
- 분석된 염기서열은 Lasergen 8.1.5 (CodonCode Corp, Dedham, MA, USA)를 이용하여 contig를 작성하고 Clustal W를 이용하여 정렬한 후 육안 편집을 거쳤다. 각 마커별 그리고 엽록체 DNA의 rbcL과 matK, 핵 DNA의 ITS 조합의 분류군간, 분류군내 염기서열 변이는 MEGA 6.
- , 2013). 최소 종간 변이와 최대 종내 변이를 SigmaPlot 13 (Systat Software Inc., USA)으로 도식화하여 바코드 갭을 조사하였다(Theodoridis et al., 2012). Neighbor-joining dendrogram (Saitou and Nei, 1987)을 작성하여 각 분류군의 단계통 형성여부와 각 마커별 종식별 해상력을 확인하였다.
대상 데이터
- 각 마커별 바코드 염기서열은 미국 NCBI에 제출하여 GenBank 번호를 부여받았다(Table 1). 각 마커별 염기서열 분석 성공률은 rbcL에서 88.
- 전국에서 채집한 341점은 확증표본을 제작하여 국립농업과학원 표본관(HCCN)에 보관하였다. 바코드 염기서열은 미국의 국립생물공학정보센터(NCBI)에 제출하여 GenBank 번호를 부여받아 공개하였다.
- 9% 까지종 식별 해상력을 높일 수 있어 벼과 바코드에 매우 유용한 조합이었다. 벼과의 바코드데이터는 미국의 국립생물공학정보센터에 기탁하여 genbank 번호를 부여받아 공개하였다. 그러므로 형태적으로 동정이 어려운 벼과 잡초를 matK와 ITS 부위의 염기서열을 분석하여 미국의 국립생물공학정보센터에 기탁한 데이터와 비교함으로써 쉽고 간편 하게 동정할 수 있게 되었다.
데이터처리
- 5 (CodonCode Corp, Dedham, MA, USA)를 이용하여 contig를 작성하고 Clustal W를 이용하여 정렬한 후 육안 편집을 거쳤다. 각 마커별 그리고 엽록체 DNA의 rbcL과 matK, 핵 DNA의 ITS 조합의 분류군간, 분류군내 염기서열 변이는 MEGA 6.06 프로그램을 이용하여 Kimura 2-Parameter (K2P) distance model로 산출하였다(Tamura et al., 2013). 최소 종간 변이와 최대 종내 변이를 SigmaPlot 13 (Systat Software Inc.
이론/모형
- 게놈 DNA 추출과 PCR 증폭반응과 증폭반응에 이용한 primer는 Lee et al. (2015)에 따랐으며 염기서열분석은 GenoTech (Dajeon, Korea)에서 수행하였다.
- 경기도, 강원도, 충청도, 전라도, 경상도, 제주도와 울릉도 등 전국에서 84분류군 341 생태형을 채집하고 국립생물자원관에서 28종 62생태형의 표본을 대출하여 총 84분류군 403생태형을 엽록체 DNA의 rbcL과 matK, 핵 DNA의 ITS 부위를 이용하여 바코드하였다(Supplementary table 1). 본 연구에 이용한 식물재료는 Chen and Peterson (2006)과 Park et al. (2011)에 근거하여 동정하였다. 전국에서 채집한 341점은 확증표본을 제작하여 국립농업과학원 표본관(HCCN)에 보관하였다.
성능/효과
- 그러나 바코드 갭과 종식별 해상력은 matK에서 가장 높았다. 80.9%의 염기서열 분석 성공률을 보인 ITS는 matK와의 조합에서 92.9% 까지종 식별 해상력을 높일 수 있어 벼과 바코드에 매우 유용한 조합이었다. 벼과의 바코드데이터는 미국의 국립생물공학정보센터에 기탁하여 genbank 번호를 부여받아 공개하였다.
- 그러므로 벼과의 경우 matK 부위를 바코딩하기 위하여 중간 프라이머가 필요했던 점과 중간 프라이머의 사용에도 불구하고 포아풀아과와 같은 분류군에 따라 극히 낮은 염기서열 분석 성공률을 나타냈다는 점은 특히 고려할 만하다. ITS에서 낮은 염기 서열 분석 성공률을 보인 대나무아과(53.5%)와 물대아과(66.7%)는 rbcL과 matK에서는 높은 성공률을 보여서 표준마커만으로 바코딩이 가능하였다.
- Neighbor-joinging (NJ) 계통수(not shown, provided upon request)의 단계원 형성여부에 근거한 바코드 종식별 해상력을 살펴보면 rbcL이 75.0%, matK가 78.6%, ITS가 76.2%로 단일 마커에서는 matK가 가장 높았고 rbcL에서 가장 낮았다. 단일 마커들을 조합하여 살펴보면 rbcL + matK에서 82.
- 7) 벼과 전체에서 비교적 높은 염기서열 분석 성공률을 보였다. matK 의 경우는 물대아과(Arundinoideae)에서 가장 높은(91.7%) 염기서열 분석 성공률을 보인 반면 포아풀아과(Pooideae) 에서는 현저히 낮은(58.3%) 성공률을 나타냈고, ITS의 염기서열 분석 성공률은 기장아과(Panicoideae)에서 가장 높고(90.2%) 대나무아과에서 가장 낮았다(53.5%). 벼과의 어느 분류군에서나 좋은 염기서열 분석 성공률을 나타낸 rbcL과 달리 matK와 ITS는 분류군별로 다른 염기서열 분석 성공률을 보여 분석하고자 하는 분류군에 따라 적절한 마커의 선택이 벼과를 바코딩하는데 중요한 요인 중의 하나로 생각된다.
- 각 마커별 바코드 염기서열은 미국 NCBI에 제출하여 GenBank 번호를 부여받았다(Table 1). 각 마커별 염기서열 분석 성공률은 rbcL에서 88.7%로 가장 높았고, matK에서 73.7%로 가장 낮았으며 ITS는 80.9%의 성공률을 보였다(Table 2). 각 마커별 염기서열 분석률을 살펴보면, rbcL은 대나무아과(Bambusoideae)에서 가장 높고(93.
- 9%의 성공률을 보였다(Table 2). 각 마커별 염기서열 분석률을 살펴보면, rbcL은 대나무아과(Bambusoideae)에서 가장 높고(93.3%) 나도바랭이아과(Chloridoideae)에서 가장 낮았으나(86.7) 벼과 전체에서 비교적 높은 염기서열 분석 성공률을 보였다. matK 의 경우는 물대아과(Arundinoideae)에서 가장 높은(91.
- 각 마커에 의해 생성된 NJ 계통수들은 분류군의 단계원 형성에 차이를 보였는데 단일마커와 각 조합에서 생성된 일곱 개의 NJ 계통수에서 공통적으로 단계원이 형성되지 않은 뚝새풀(Alopecurus aequalis Sobol.)과 털뚝새풀(A. japonicus Steud.)은 분자분류학적으로 동종으로 생각되며 형태적 특징을 검토한 후 동종으로 처리할 수 있을 것으로 생각된다. 나도바랭이새(Microstegium minimeum (Trin.
- 각 분류군별 염기서열의 변이는 rbcL에서 18.4%, matK에서 41.2%, ITS에서 68.4%로 핵DNA의 ITS 부위에서 가장 높았다. 종내 변이를 보이는 분류군은 rbcL에서 24분류군, matK에서 30분류군, ITS에서 49분류군이었으며 이들의 종내 변이율은 평균 0.
- 1%로 단일마커 뿐만 아니라 모든 마커조합이 매우 높은 바코드 갭을 갖는 것으로 분석되었다(Table 3). 단일 마커(A)와 마커들의 조합(B)에 의한 바코드 갭을 나타낸 플랏에서도 두 플랏간에 큰 차이가 없는 것으로 나타나서 본 연구에 이용된 세 마커는 단일마커 또는 조합으로 벼과 바코드에 유용한 것으로 판단된다.
- 2%로 단일 마커에서는 matK가 가장 높았고 rbcL에서 가장 낮았다. 단일 마커들을 조합하여 살펴보면 rbcL + matK에서 82.1%, rbcL + ITS에서 83.3%, matK + ITS에서 92.9%, rbcL + matK + ITS에서 86.9%로 종식별 해상력이 현저히 높아지는 결과를 얻었으며 특히, matK + ITS 조합은 매우 높은 해상력을 보여(Table 3) 벼과식물의 바코딩에 매우 유용하게 이용될 수 있을 것으로 사료된다.
- 두 개체이상의 생태형을 갖는 분류군의 최대 종내변이와 최소 종간변이의 차이가 0보다 클 때 바코드 갭이 있는 것으로 정의하는 바코드 갭(Theodoridis et al., 2012)은 rbcL 이 91.8%, matK가 96.4%, ITS가 91.6%, rbcL + matK가 96.3%, rbcL + ITS가 94.9%, matK + ITS가 96.1%, rbcL + matK + ITS가 96.1%로 단일마커 뿐만 아니라 모든 마커조합이 매우 높은 바코드 갭을 갖는 것으로 분석되었다(Table 3). 단일 마커(A)와 마커들의 조합(B)에 의한 바코드 갭을 나타낸 플랏에서도 두 플랏간에 큰 차이가 없는 것으로 나타나서 본 연구에 이용된 세 마커는 단일마커 또는 조합으로 벼과 바코드에 유용한 것으로 판단된다.
- 23% 이었다. 마커들의 조합으로 분석한 평균 종간변이율은 표준마커 조합인 rbcL + matK에서 0.07%, rbcL + ITS에서 0.15%, matK + ITS에서 0.25, rbcL + matK + ITS 0.12%로 matK와 ITS의 조합에서 가장 높은 종간변이율을 보였다(Table 3). 쥐꼬리새풀(Sporobolus fertilis (Steud.
- 34%로 핵 DNA의 ITS구간에서 가장 높은 종내 변이율을 보였다. 마커들의 조합으로 분석한 평균 종내 변이율은 표준마커 조합인 rbcL + matK에서 0.07%, rbcL + ITS에서 0.15%, matK + ITS에서 0.25%, rbcL + matK + ITS에서 0.12%로 matK와 ITS의 조합에서 가장 높은 종내 변이율을 보였다(Table 3). 나도바랭이(Chloris virgata Sw.
- 본 연구는 식물 표준 바코드마커와 핵 DNA의 ITS 부위를 이용하여 국내 벼과 식물 252 분류군 중 주로 농경지에서 발생하는 잡초 총 84분류군 403생태형을 바코드하여 데이터베이스를 구축하기 위하여 수행하였다. 바코드 결과 PCR 증폭과 염기서열 분석 성공률은 rbcL에서 가장 높았으며 matK에서 가장 낮았다. 그러나 바코드 갭과 종식별 해상력은 matK에서 가장 높았다.
- , 2015). 벼과 전체에서도 포아풀아과와 마찬가지로 엽록체 DNA rbcL과 matK의 계통수에서 차이를 보였던 유연관계는 ITS를 이용하였을 때 matK 계통수와 유사성이 더 높은 것으로 분석되었다. 그러므로 바코드뿐만 아니라 분자계통학적 연구에서도 다양한 마커 들의 조합을 이용하면 더 해상력이 높은 유연관계를 밝힐수 있을 것으로 사료된다.
- 본 연구에서 ITS부위는 80.9%의 PCR 증폭 및 염기서열 분석 성공률과 76.2%의 종식별 해상력을 나타냈으나 rbcL 과의 조합으로 83.3%, matK와의 조합으로 92.9%까지 종식별 해상력을 높일 수 있었다. 이는 표준마커 rbcL과 matK 조합의 종식별 해상력(82.
- 속(genus)수준에서 살펴보면, rbcL의 계통수는 강아지풀속(Setaria P.Beauv.), 개기장속(Panicum L.), 드렁새속 (Leptochloa P.Beauv.), 포아풀속(Poa L.), 참새귀리속(Bromus L.), 갯보리속(Elymus L.), 수수속(Sorghum Moench)의 일곱속, matK 계통수는 포아풀속, 드렁새속, 강아지풀속, 개기 장속의 네 속, ITS 계통수는 강아지풀속, 개기장속, 드렁새속, 돌피속(Echinochloa P.Beauv.)의 네 속이 단계원을 형성 하지 않았다. 강아지풀속, 개기장속, 드렁새속은 단일 마커뿐만 아니라 마커조합에 의해 생성된 NJ 계통수에서 공통 적으로 단계원을 형성하지 않아 이 세 속의 단계원은 계통 분류학적으로 재검토가 이루어져야 할 것으로 생각된다.
- 4%로 핵DNA의 ITS 부위에서 가장 높았다. 종내 변이를 보이는 분류군은 rbcL에서 24분류군, matK에서 30분류군, ITS에서 49분류군이었으며 이들의 종내 변이율은 평균 0.03%, 0.09%, 0.34%로 핵 DNA의 ITS구간에서 가장 높은 종내 변이율을 보였다. 마커들의 조합으로 분석한 평균 종내 변이율은 표준마커 조합인 rbcL + matK에서 0.
- 12%로 matK와 ITS의 조합에서 가장 높은 종간변이율을 보였다(Table 3). 쥐꼬리새풀(Sporobolus fertilis (Steud.) W. Clayton)은 rbcL을 제외한 모든 단일마커와 마커의 조합에서 잠자리피(Trisetum bifidum (Thunb.) Ohwi), 쥐보리(Lolium multiflorum Lamarck), 호밀풀(Lolium perenne L.) 등과 가장 종간변이가 큰 분류군으로 파악되었다.
후속연구
- ), 솔새(Themeda triandra var. japonica (Willd.) Makino) 13 분류군은 모든 마커를 이용한 분석에서 종내변이를 보이지 않았고 특히, 개솔새, 오리새, 그령, 좀새그령, 쇠보리, 갯쇠보리, 나도바랭이새, 참새피, 새포아풀, 솔새 11 분류군은 모든 바코딩마커 조합(rbcL + matK, rbcL + ITS, matK + ITS, rbcL + matK + ITS)에서도 종내 변이를 보이지 않아 이 종들은 국내에서 단일 생태형을 갖을 가능성이 높은것으로 사료되므로 추후 더 많은 지역의 샘플을 포함하여 확인할 필요가 있다.
- )의 네 속이 단계원을 형성 하지 않았다. 강아지풀속, 개기장속, 드렁새속은 단일 마커뿐만 아니라 마커조합에 의해 생성된 NJ 계통수에서 공통 적으로 단계원을 형성하지 않아 이 세 속의 단계원은 계통 분류학적으로 재검토가 이루어져야 할 것으로 생각된다. 각 마커별로 다계원을 나타낸 포아풀속, 참새귀리속, 갯보리속, 수수속, 돌피속은 마커의 조합에 따라 단계원을 형성 하였다.
- 0%)보다 약 10% 가량의 샘플을 분석할 수 없었다는 단점이 있다. 그러므로 matK 마커를 이용한 PCR 증폭과 염기서열 분석 성공률을 높일수 있도록 중간 프라이머를 제작 하는 등 보완을 거쳐 ITS 와 조합하여 바코드에 이용하면 충분히 좋은 결과를 얻을 수 있을 것으로 기대된다.
- 벼과 전체에서도 포아풀아과와 마찬가지로 엽록체 DNA rbcL과 matK의 계통수에서 차이를 보였던 유연관계는 ITS를 이용하였을 때 matK 계통수와 유사성이 더 높은 것으로 분석되었다. 그러므로 바코드뿐만 아니라 분자계통학적 연구에서도 다양한 마커 들의 조합을 이용하면 더 해상력이 높은 유연관계를 밝힐수 있을 것으로 사료된다.
- )는 rbcL 과 ITS의 계통수에서 동종으로 유집되었으나 민바랭이새가 matK 염기서열 분석에 실패하여 동종 가능성 여부를 확인할 수 없었다. 민바랭이새의 생태형 보완과 형태적 형질을 고려하여 추후 확인하여야 할것으로 생각된다. rbcL 계통수에서 구주개밀(Elymus repens (L.
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