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문제 정의
- 체외 수정을 하고 embryo가 투명하여 형광 염색을 하여 췌장섬을 포함하여 각종 장기를 구성하는 특정세포들의 형성 및 분화 과정을 일반 해부현미경 하에서 쉽게 관찰 할 수 있다(Kim과 Kim, 2003). 따라서 본 연구에서는 zebrafish의 embryo에 alloxan을 처리하여 체내 췌장섬의 손상을 확인하여 당뇨 유발을 평가하고자 하였으며, 손상된 췌장섬에 뽕나무과실에서 분리한 플라보노이드를 투여하여 손상된 췌장섬의 회복효과를 평가하고자 하였다. 췌장섬의 손상 정도는 2-NBDG (2-(N-7-nitrobenz-2-oxa1,3-diazol-4-yl)amino)-2-deoxyglucose로 염색하여 확인하였다.
제안 방법
- (Φ 9.0×14 cm, CHCl3-MeOH-water =16:3:1→12:3:1, 각 3 L 씩)를 실시하여 30개의 분획물(MAE-13-1−MAE-13-30)으로 나누었고, 화합물 1 [MAE-13-15, 24 mg, Ve/Vt 0.186−0.202, TLC (RP-18 F254s) Rf 0.68, MeOH-water (3:1)]을 분리하였다.
- 1차 현미경 촬영 후에 오디에서 분리한 4종의 flavonoid 와 양성대조 약물인 glimepiride를 각각 10 µM로 제조하여 1시간 동안 노출시켰다.
- 28, MeOH-water (3:2)]를 분리하였다. EtOAc와 n-BuOH 분획에 대하여 silica gel 및 ODS column chromatography를 반복 수행하여 4종의 flavonoid를 분리, 정제 하였으며, NMR, MS, IR 등의 spectroscopic data를 해석하여 qurcetin (1), astragalin (2), isoquercetin (3) 및 rutin(4)으로 각각 구조 동정하였다.
- MAE-13-22 (42 mg, Ve/Vt 0.380−0.411)에 대하여 ODS c.c.(Φ 2×5 cm, MeOH-water=1:1, 0.3 L)를 실시하여 8개의 분획물(MAE-13-22-1−MAE-13-22-8)으로 나누었고, 화합물 2 [MAE13-22-5, 2.7 mg, Ve/Vt 0.486-0.502, TLC (RP-18 F254s) Rf0.52, MeOH-water (1:1)]를 분리하였다.
- Zebrafish 췌장섬의 크기 변화를 통한 항당뇨 효능을 측정하기 위하여 5 dpf (day post fertilization)의 zebrafish larvae를 96 well에 위치시킨 후 25µM 2-NBDG로 12시간 동안 염색하였다.
- [Φ 9.0×14 cm, n-hexane-EtOAc =10:1→8:1→6:1→3:1→1:1 (각 12 L 씩) CHCl3-MeOH =8:1→6:1→4:1→1:1(각 10 L 씩)]를 실시하여 14개의 분획물(MAE-1−MAE-14)을 얻었다.
- 이를 이용하면 glucose의 축적이나 대사 메커니즘을 관찰 할 수 있다(Zou, 2005). 또한 2-NBDG는 살아있는 세포에만 흡수 가능 하기 때문에, 본 연구에서는 fluorescence intensity 측정을 통하여 췌장섬의 변화를 관찰 하였다.
- 001). 먼저 손상된 췌장섬을 항당뇨 물질로 이미 알려진 glimepiride에 노출시켜 변화를 관찰하였다. Glimepiride는 감소된 췌장섬의 크기를 무처리군 보다 38.
- 분리, 동정된 4종의 flavonoid의 췌장세포 회복효과를 검토하기 위하여 zebrafish에 alloxan을 처리한 후 췌장섬의 손상을 유발하였다. 항당뇨 화합물로 잘 알려진 glimepiride 및 4종의 flavonoid를 처리하여 손상된 췌장섬의 크기를 측정하여 회복 정도를 확인하였다(Fig.
- 알과 성어를 분리하기 위한 망을 설치한 수조에 암컷과 수컷을 1:1 비율로 넣고 12시간 후에 zebrafish embryo를 수집하였다. 채취 후에 0.
- 4 kg)에 100% EtOH (35 L×1) 및 70% EtOH (35 L×2)을 가하여 실온에서 24시간 추출한 후 여과지로 여과하였다. 얻어진 여액을 감압 농축한 EtOH 추출물(2219 g)에 대하여 용매의 극성에 따라 EtOAc, n-BuOH 및 물로 순차 분획하고 각 분획을 감압 농축하여 3개의 분획, MAE (41 g), MAB(247 g), MAW (1949 g)을 얻었다. EtOAc 분획 (40 g)에 대하여 SiO2c.
- 오디(15.4 kg)에 100% EtOH (35 L×1) 및 70% EtOH (35 L×2)을 가하여 실온에서 24시간 추출한 후 여과지로 여과하였다.
- 직접적인 췌장섬의 관찰을 위해 형광현미경을 사용하였으며, 관찰 전에 25 µM 2-NBDG로 1시간 동안 다시 염색 하였다.
- 따라서 본 연구에서는 zebrafish의 embryo에 alloxan을 처리하여 체내 췌장섬의 손상을 확인하여 당뇨 유발을 평가하고자 하였으며, 손상된 췌장섬에 뽕나무과실에서 분리한 플라보노이드를 투여하여 손상된 췌장섬의 회복효과를 평가하고자 하였다. 췌장섬의 손상 정도는 2-NBDG (2-(N-7-nitrobenz-2-oxa1,3-diazol-4-yl)amino)-2-deoxyglucose로 염색하여 확인하였다. 2-NBDG는 췌장섬의 형태학적 관찰을 가능하게 한다.
- 분리, 동정된 4종의 flavonoid의 췌장세포 회복효과를 검토하기 위하여 zebrafish에 alloxan을 처리한 후 췌장섬의 손상을 유발하였다. 항당뇨 화합물로 잘 알려진 glimepiride 및 4종의 flavonoid를 처리하여 손상된 췌장섬의 크기를 측정하여 회복 정도를 확인하였다(Fig. 1). Alloxan은 췌장섬 내 β-cell만을 선택적으로 파괴시키는 당뇨 유발물질로서 alloxan에 노출된 zebrafish는 alloxan을 처리하지 않은 zebrafish에 비해 41.
- 화합물로 인한 췌장섬의 변화를 관찰하기 위해 2차 현미경 촬영을 하였으며, 1차 현미경 촬영과 동일하게 형광현미경 관찰 전에 25 µM 2-NBDG로 1시간동안 다시 염색 하였다. 형광현미경을 통해 획득한 이미지는 Focus Lite 및 Image J 소프트웨어를 사용하여 zebrafish의 췌장섬의 크기와 췌장섬의 형광 염색 intensity를 분석하였다. 실험결과는 GraphPad Prism version 5.
- 화합물로 인한 췌장섬의 변화를 관찰하기 위해 2차 현미경 촬영을 하였으며, 1차 현미경 촬영과 동일하게 형광현미경 관찰 전에 25 µM 2-NBDG로 1시간동안 다시 염색 하였다.
대상 데이터
- (USA)로부터 구입하였다. 2-NBDG는 Invitrogen(USA) 제품을 사용하였다. 형광현미경은 Olympus 1X70(Olympus, Japan) 를 사용하였다.
- 실험에 사용한 alloxan monohydrate 및 sea salt는 Sigma Chemical Co. (USA)로부터 구입하였다. 2-NBDG는 Invitrogen(USA) 제품을 사용하였다.
- 2-NBDG는 Invitrogen(USA) 제품을 사용하였다. 형광현미경은 Olympus 1X70(Olympus, Japan) 를 사용하였다. 이미지 분석을 위한 소프트웨어는 Focus Lite (Focus Co, Korea)와 Image J (National Institutes of Health, USA)를 사용하였다.
데이터처리
- 실험결과는 3반복 실시하여 평균±표준편차로 나타내었다.
- 실험결과는 GraphPad Prism version 5.0 (GraphPad software, USA)를 이용하여 one-way ANOVA로 분석하였고, 집단 간 비교를 위한 사후 분석은 Tukey로 검증하였으며, p <0.05 이상일때만 통계적 유의성이 있는 것으로 판단하였다.
이론/모형
- 형광현미경은 Olympus 1X70(Olympus, Japan) 를 사용하였다. 이미지 분석을 위한 소프트웨어는 Focus Lite (Focus Co, Korea)와 Image J (National Institutes of Health, USA)를 사용하였다.
성능/효과
- Alloxan은 췌장섬 내 β-cell만을 선택적으로 파괴시키는 당뇨 유발물질로서 alloxan에 노출된 zebrafish는 alloxan을 처리하지 않은 zebrafish에 비해 41.2±1.8% 췌장섬의 크기가 감소한 것을 확인하였다(p <0.001).
- Astragalin, rutin,isoquercetin, quercetinc 처리 후 zebrafish의 췌장섬의 크기는 무처리군에 비해서 rutin 처리 그룹에서는 32.3±1.7%, isoquercetin처리 그룹에서는 63.9±20.3%, quercetin 처리 그룹에서는 46.6±15.4% 유의적(p <0.001)으로 췌장섬의 크기를 증가시켰다.
- 4% 더 회복된 것으로 나타났다. Astragalin은 무처리시의 췌장섬의 크기만큼 회복되지는 않았지만, alloxan 처리로 손상 받은 췌장섬을 상당히 회복시킨 것으로 나타났다.
- Flavonoid 화합물의 구조 활성과의 관계를 보면, B환의 C-3' 위치에 수산기의 유무로 효능 차이가 나는 것을 알 수 있었으며, 육탄당이 2분자 결합한 rutin에 비해 육탄당이 1분자 결합한 isoquercetin이 1.45배 효능이 높게 나타났으며, 비 배당체인 quercetin은 1.49배 높게 나타났다.
- Rutin 처리 그룹도 alloxan만 처리한 그룹보다 22.4±1.8% fluorescence intensity가 증가하는 것으로 나타났다.
- 001)으로 췌장섬의 크기를 증가시켰다. Rutin은 양성대조약물인 glimepiride보다 회복이 약하게 나타났으나 isoquercetin은 양성대조약물에 비해 25.3%, quercetin은 5.4% 더 회복된 것으로 나타났다. Astragalin은 무처리시의 췌장섬의 크기만큼 회복되지는 않았지만, alloxan 처리로 손상 받은 췌장섬을 상당히 회복시킨 것으로 나타났다.
- 따라서 결합한 당의 개수와 B환의 C-3' 위치에 수산기의 유무가 이번 실험의 효능에 매우 중요한 영향을 주는 것을 알 수 있었다.
- 종합하면, 분리한 4종의 flavonoid, rutin, isoquercetin, quercetin은 췌장섬의 크기와 fluorescence intensity에서 유의적인 증가율을 보여 항당뇨 효능을 확인하였다(p <0.001) (Fig. 2).
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