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문제 정의
- 따라서 본 연구에서는 오디의 HMGR 활성억제 및 human LDL의 산화억제 효과를 예비실험에서 확인하고 오디 추출물의 직･간접적인 혈행개선 효과를 체계적으로 검증하기 위하여 in vitro에서 항산화 활성, human LDL의 산화억제 및 COX-2의 효소 활성 저해, 마우스의 대식세포주인 RAW 264.7 세포와 인간 간세포주인 HepG2에 대한 세포안전성 측정, 인간제대혈관내피세포(human umbilical vein endothelial cell, HUVEC)에서의 ICAM-1과 VCAM-1의 세포내 발현억제 및 RAW 264.7 세포에서의 COX-2 및 5-LO의 발현억제를 연구하였다. 또한 in vivo에서는 고지혈증 동물 모델을 이용하여 혈중 total cholesterol의 감소 효과 및 염증지표인자인 혈청 CRP의 농도를 측정하였다.
- 본 연구에서는 다양한 생리활성물질을 다량 함유하고 있는 국내산(전라북도 부안군) 오디의 혈액순환장애의 개선 효과를 확인하기 위하여 in vitro 및 고지혈증 동물모델을 이용한 실험을 진행하였다. MBE가 DPPH 라디칼을 50％ 소거하는 SC50값은 89.
- 또한 in vivo에서는 고지혈증 동물 모델을 이용하여 혈중 total cholesterol의 감소 효과 및 염증지표인자인 혈청 CRP의 농도를 측정하였다. 이에 본 연구의 결과들을 고찰하여 오디추출물의 혈행개선 효과를 확인하였다.
제안 방법
- 24시간 후 각 well 당 0.2% MTT용액을 20 μL씩 첨가하여 37°C, 5% CO2 배양기에서 3시간 동안 반응시켰다.
- 24시간 후 이전 배양에 사용된 배지를 제거하고 시료를 각 농도별로 용해한 배지를 분주하고 37°C, 5% CO2의 배양조건에서 24시간 동안 각각 반응시켰다.
- Table 1에 나타낸 바와 같이 정상 식이조성의 사료와 고지혈증을 유도하기 위한 고콜레스테롤 식이조성으로 조절한 사료를 제조하고 적응이 끝난 동물에게 2주간 sham군에는 정상 식이조성 사료를 공급하였고 음성대조군과 양성대조군 및 실험군에는 고콜레스테롤 식이조성 사료를 공급하였다. 2주 후 각 실험동물의 식이 섭취량 및 체중을 측정하고 Table 2에 나타낸 바와 같은 시료의 섭취량이 되도록 각 시료를 고콜레스테롤 식이조성 사료에 첨가하고 다시 2주간 식이 하였다. 마지막 식이의 공급 24시간 후 실험동물의 체중을 측정하여 사료에 첨가한 시료에 따른 체중의 증감이 없었음을 확인하였고 에테르로 마취한 후 하대정맥에서 채혈하고 20분간 상온에서 방치한 후 고속 원심분리기(MF80, ㈜한일에스엠이, 안양, 한국)를 이용하여 3,000 rpm으로 15분간 원심분리를 시행하여 혈청을 얻었다.
- MBE의 섭취량은 예비실험에서 탐색된 혈청 total cholesterol의 유의적인 감소가 가능한 최소 섭취량 범위를 참고하여 MBE 100, 200 및 400 mg/kg 체중으로 설정하였다.
- TBS-T 완충용액으로 3회 세척 후 TBS-T 완충용액으로 1/2,000로 희석한 이차 항체(Santa Cruz Biotechnology, Dallas, TX, USA)로 상온에서 1시간 교반한 후 화학발광키트 (Enhanced Chemiluminescence kit, Pierce, Rockford, IL, USA)를 이용하여 X-ray 필름에 현상하였고 총 단백질량의 동일성은 β-actin(Santa Cruz Biotechnology)의 양으로 검증하였다.
- 고지혈증 동물모델 제작을 위하여 실험에 사용한 동물은 260~300 g의 7주령 수컷 Sprague Dawley계 흰쥐(샘타코, 오산, 한국)를 구입한 후 체중을 기준으로 골고루 분산하여 대조군 및 실험군을 각각 6마리로 구분하고 1주 동안 고형 사료(샘타코) 및 정제수를 자유롭게 섭취시켰으며, 사육실 온도는 20±2°C, 상대습도는 55±5%를 유지하였고 광주기와 암주기를 12시간이 되도록 빛을 조절하여 새로운 사육 환경에 적응시켰다. Table 1에 나타낸 바와 같이 정상 식이조성의 사료와 고지혈증을 유도하기 위한 고콜레스테롤 식이조성으로 조절한 사료를 제조하고 적응이 끝난 동물에게 2주간 sham군에는 정상 식이조성 사료를 공급하였고 음성대조군과 양성대조군 및 실험군에는 고콜레스테롤 식이조성 사료를 공급하였다. 2주 후 각 실험동물의 식이 섭취량 및 체중을 측정하고 Table 2에 나타낸 바와 같은 시료의 섭취량이 되도록 각 시료를 고콜레스테롤 식이조성 사료에 첨가하고 다시 2주간 식이 하였다.
- TBS-T 완충용액으로 3회 세척 후 TBS-T 완충용액으로 1/2,000로 희석한 이차 항체(Santa Cruz Biotechnology, Dallas, TX, USA)로 상온에서 1시간 교반한 후 화학발광키트 (Enhanced Chemiluminescence kit, Pierce, Rockford, IL, USA)를 이용하여 X-ray 필름에 현상하였고 총 단백질량의 동일성은 β-actin(Santa Cruz Biotechnology)의 양으로 검증하였다. 각 단백질의 발현량은 ImageJ(National Institutes of Health, Bethesda, MD, USA) 프로그램을 이용하여 정량하였다.
- 각 세포는 37°C, 5% CO2 조건에서 배양(MCO-17AIC, SANYO, Osaka, Japan)하였다.
- 7 세포에서의 COX-2 및 5-LO의 발현억제를 연구하였다. 또한 in vivo에서는 고지혈증 동물 모델을 이용하여 혈중 total cholesterol의 감소 효과 및 염증지표인자인 혈청 CRP의 농도를 측정하였다. 이에 본 연구의 결과들을 고찰하여 오디추출물의 혈행개선 효과를 확인하였다.
- 마우스 대식세포주인 RAW 264.7 세포와 인간 간세포주인 HepG2에 대한 MBE의 세포독성을 알아보기 위하여 MTT assay를 실시하였다. MBE를 농도별(5,000, 2,500, 1,250, 625, 312.
- 생성된 PGF2α를 정량하기 위하여 경쟁적 효소면역반응(EIA, enzyme immunoassay)을 실시하기 위하여 상기 반응액을 EIA 완충액(0.1 M phosphate, 0.1% BSA, 0.4 M NaCl, 1 mM EDTA, 0.01% sodium azide)으로 2,000배 희석하고 이를 프로스타글란딘 항체가 코팅된 96 well plate에 50μL씩 분주 후 PGs screening AChE tracer를 50 μL와 antiserum을 50 μL씩 첨가한 후 18시간 동안 4°C에서 반응시켰다.
- 세포접착단백질(ICAM-1, VCAM-1)의 세포내 발현억제 효과를 확인하기 위하여 HUVEC 세포에 시료 및 TNF-α(10 ng/mL)를 처리하였고 염증관련 효소(COX-2, 5-LO)의 세포내 발현억제 효과를 확인하기 위하여 RAW 264.7 cell에 시료 및 LPS(1 μg/mL)를 처리하였다.
- 시료의 처리농도는 세포독성실험에서 세포에 안전하며 예비실험에서 ICAM-1, VCAM-1, COX-2 및 5-LO의 발현을 억제하는 최소 농도범위를 참고하여 100 μg/g, 200 μg/g 및 400 μg/g 으로 정하였다.
- 아라키돈산을 기질로 하여 프로스타글란딘(PG)을 생성하는 COX-2의 효소활성을 측정하기 위하여 COX inhibitor screening assay kit(Cayman Chemical, Ann Arbor, MI, USA)을 사용하였다. 먼저 1.
- 염증지표인 혈청 C-reactive protein의 농도는 Rat Creactive protein ELISA kit(BD Biosciences, San Jose, CA, USA)를 이용하여 측정하였다. 즉 시험관에 혈청 또는 kit에 포함된 표준 CRP를 농도별로 희석한 후 100 μL를 96 well plate에 넣고 well에 코팅되어 있는 일차 항체에 혈장중의 항원을 결합시키고 각 well을 5번 세척하며 여기에 conjugate가 결합되어 있는 detection 항원을 일차 항체(anti-CRP antibody)에 30분간 반응시킨 후 각 well을 5번 세척하고 기질인 TMB(tetramethyl-benzidine)로 10분간 발색하고 반응을 정지시킨 후 ELISA reader(Molecular Devices) 기기를 이용해서 450 nm의 파장에서 흡광도를 측정하였다.
- 즉 10 mM PBS buffer(pH 7.4) 10 mL에 human LDL(≥ 5 mg/mL, Sigma-Aldrich Co., St. Louis, MO, USA)을 희석한 후 320μL를 취하여 각 시험관에 분주하고 여기에 0.1 mM CuSO440 μL 및 농도별로 희석한 시료 40 μL를 첨가하여 37°C에서 30분간 반응시킨 후 20% TCA(trichloroacetic acid) 1 mL 및 0.67% TBA(2-thiobarbituric acid, in 0.05 M NaOH)를 1 mL 첨가하였다.
- 즉 시험관에 혈청 또는 kit에 포함된 표준 CRP를 농도별로 희석한 후 100 μL를 96 well plate에 넣고 well에 코팅되어 있는 일차 항체에 혈장중의 항원을 결합시키고 각 well을 5번 세척하며 여기에 conjugate가 결합되어 있는 detection 항원을 일차 항체(anti-CRP antibody)에 30분간 반응시킨 후 각 well을 5번 세척하고 기질인 TMB(tetramethyl-benzidine)로 10분간 발색하고 반응을 정지시킨 후 ELISA reader(Molecular Devices) 기기를 이용해서 450 nm의 파장에서 흡광도를 측정하였다.
- 즉 시험관에 혈청 또는 순차적 농도로 희석한 표준 cholesterol 용액을 20 μL 넣고 kit에 포함된 효소시액을 3 mL 첨가한 후 교반하고 37°C에서 5분간 반응시킨 후 ELISA reader(Molecular Devices) 기기를 이용하여 500 nm의 파장에서 흡광도를 측정하였다.
- 혈청 total cholesterol 농도는 총콜레스테롤 정량 검사용 kit(아산제약, 서울, 한국)을 이용하여 측정하였다. 즉 시험관에 혈청 또는 순차적 농도로 희석한 표준 cholesterol 용액을 20 μL 넣고 kit에 포함된 효소시액을 3 mL 첨가한 후 교반하고 37°C에서 5분간 반응시킨 후 ELISA reader(Molecular Devices) 기기를 이용하여 500 nm의 파장에서 흡광도를 측정하였다.
- 즉 시험관에 혈청 또는 순차적 농도로 희석한 표준 cholesterol 용액을 20 μL 넣고 kit에 포함된 효소시액을 3 mL 첨가한 후 교반하고 37°C에서 5분간 반응시킨 후 ELISA reader(Molecular Devices) 기기를 이용하여 500 nm의 파장에서 흡광도를 측정하였다. 혈청 total cholesterol의 농도는 표준 cholesterol의 표준곡선을 이용하여 계산하였다.
대상 데이터
- 고지혈증 동물모델 제작을 위하여 실험에 사용한 동물은 260~300 g의 7주령 수컷 Sprague Dawley계 흰쥐(샘타코, 오산, 한국)를 구입한 후 체중을 기준으로 골고루 분산하여 대조군 및 실험군을 각각 6마리로 구분하고 1주 동안 고형 사료(샘타코) 및 정제수를 자유롭게 섭취시켰으며, 사육실 온도는 20±2°C, 상대습도는 55±5%를 유지하였고 광주기와 암주기를 12시간이 되도록 빛을 조절하여 새로운 사육 환경에 적응시켰다.
- 7 세포와 인간 간세포 주인 HepG2는 한국세포주은행(Seoul, Korea)으로부터 분양받았으며, 세포배양을 위해 10% FBS(fetal bovine serum)와 1% penicillin-streptomycin을 포함하는 DMEM(Dulbecco's modified Eagle medium, Gibco-BRL, Rockville, MD, USA) 배지를 사용하였다. 또한 인간 제대정맥혈관내피세포주인 HUVEC는 MTCC사(Seoul, Korea)에서 분양받았으며, 세포배양을 위해 10％ FBS가 함유된 EGM2(Endothelial Growth Media-2, Lonza, Walkersville, MD, USA) 배지를 사용하였다. 각 세포는 37°C, 5% CO2 조건에서 배양(MCO-17AIC, SANYO, Osaka, Japan)하였다.
- 마우스의 대식세포주인 RAW 264.7 세포와 인간 간세포 주인 HepG2는 한국세포주은행(Seoul, Korea)으로부터 분양받았으며, 세포배양을 위해 10% FBS(fetal bovine serum)와 1% penicillin-streptomycin을 포함하는 DMEM(Dulbecco's modified Eagle medium, Gibco-BRL, Rockville, MD, USA) 배지를 사용하였다.
- 오디(전라북도 부안군) 1 kg을 식품용 분쇄기로 700 rpm에서 5분간 분쇄 후 4배량(w/v)의 40% 에탄올 수용액으로 50°C에서 4시간, 총 3회 추출하였다.
데이터처리
- 실험 결과는 3회 반복하여 평균±표준편차로 나타내었다.
- 실험결과는 3회 반복하여 평균±표준오차(mean±SEM)로 나타냈으며, SPSS(version 21, IBM Corp., New York, NY, USA) 통계프로그램으로 Student's t-test를 이용하여 P<0.05일 때 유의한 것으로 판정하였고, one-way ANOVA 를 실시한 후 P<0.05의 유의수준에서 Duncan's multiple range test에 의하여 각 실험군의 평균치 간의 유의성을 검증하였다.
이론/모형
- 25 μg/mL) of MBE for 24 hours. Cell viability was measured by MTT assay. Data were obtained from three independent experiments and are expressed as the mean±SE.
- Human LDL의 산화억제 실험은 thiobarbituric acid reacting substance(TBARS) 방법을 사용하였다. 즉 10 mM PBS buffer(pH 7.
- RAW 264.7 세포와 HepG2 세포에 대한 MBE의 독성 측정은 MTT(3-(4,5-dimethylthiazol-2-yl)-2,5-diphenyltetrazolium bromide)법을 실시하여 측정하였다(22). RAW 264.
성능/효과
- In vitro 실험에서 COX-2의 활성저해 효과를 측정한 결과 MBE의 IC50값은 215.94±18.15이었고, human LDL의 산화억제 효과는 최종반응 농도가 200 및 400 μg/mL일 경우 유의적인 감소(P<0.05) 효과가 있었다.
- MBE가 DPPH 라디칼을 50％ 소거하는 SC50값은 89.36±5.46 μg/mL로 정제되지 않은 복합물질임을 감안하면 다른 식물추출물에 비해 항산화능이 우수함을 알 수 있었다.
- MBE를 5,000 μg/mL 처리한 경우 RAW 264.7 세포의 생존율은 68.90±4.61%이었으며 HepG2세포의 생존율은 83.33±5.40%로 약간의 독성을 보였으나, 2,500 μg/mL 이하의 농도를 처리한 경우 세포독성을 보이지 않았다.
- MBE를 식이한 실험군(MBE-100, MBE-200, MBE-400)은 sham군의 각각 251.8%, 233.9% 및 205.4%로 유의적으로 증가(P<0.05)하였으며 음성대조군과 비교해서는 MBE-100군은 유의적인 감소를 하지 않았고 MBE-200 및 MBE-400군은 각각 86.2% 및 75.7%로 유의적인 감소(P<0.05)를 하는것으로 나타났다.
- MBE의 최종반응 농도가 100 μg/mL, 200 μg/mL 및 400 μg/mL일 경우 human LDL의 산화는 각각 94.68±3.20%, 90.03±3.92% 및 76.48±5.55%로, LDL의 산화는 MBE가 100 μg/mL의 경우 유의적으로 감소하지 않았지만, 200 μg/mL 및 400 μg/mL일 경우 유의적(P<0.05)으로 감소하였다.
- 고지혈증 동물모델을 이용한 실험에서 MBE의 일부 실험군(200 mg 및 400 mg/kg 체중/day, 14 days)에서 혈청 total cholesterol의 수치는 음성대조군에 비해 유의적으로 감소(P<0.05)시켰으나 혈청 C-reactive protein의 수치는 모든 실험군에서 음성대조군 대비 유의적으로 감소하지 않았다.
- 고콜레스테롤 식이를 하고 정제수를 식이한 음성대조군의 혈청 C-reactive protein은 39.79±4.81 μg/mL로 sham군의 12.60±4.08 μg/mL에 비해 약 316% 유의적 증가(P<0.05)를 하여 고콜레스테롤 식이로 고지혈증을 유발했음을 확인하였다.
- 산화된 LDL은 대식세포에 탐식되어 거품 세포(foam cells)를 형성하여 혈관내피세포의 손상, 혈전형성 및 죽상판의 확대를 야기하는 것으로 알려져 있다(26-29). 따라서 MBE의 LDL 산화억제 효과는 혈전형성 및 동맥경화증에 있어서 죽상판 확대를 억제함으로써 혈액순환장애의 개선에 도움을 줄 것으로 예상된다.
- 또한 HMGR의 저해제로 사용되는 Lovastatin을 14일간 식이한 양성대조군은 sham군의 133.9%로 유의적 증가(P<0.05), 음성대조군의 49.3%로 유의적으로 감소(P<0.05)하였다.
- 또한 MBE를 식이한 실험군은 각 농도별(100 mg, 200 mg 및 400 mg/kg B.W/day, 14days)로 각각 음성대조군에 비해 통계적 유의수준 이하(P>0.05)로 7.62%, 11.11% 및 14.93% 감소하는 것으로 나타났다.
- 또한 TNF-α에 의하여 활성화된 HUVECs 에서 MBE가 증가된 ICAM-1 및 VCAM-1의 발현을 감소(P<0.05)시켰으며 LPS에 의하여 활성화된 RAW 264.7 세포에서 MBE가 증가된 COX-2 및 5-LO의 발현을 감소 (P<0.05)시킴을 알 수 있었다.
- 2주 후 각 실험동물의 식이 섭취량 및 체중을 측정하고 Table 2에 나타낸 바와 같은 시료의 섭취량이 되도록 각 시료를 고콜레스테롤 식이조성 사료에 첨가하고 다시 2주간 식이 하였다. 마지막 식이의 공급 24시간 후 실험동물의 체중을 측정하여 사료에 첨가한 시료에 따른 체중의 증감이 없었음을 확인하였고 에테르로 마취한 후 하대정맥에서 채혈하고 20분간 상온에서 방치한 후 고속 원심분리기(MF80, ㈜한일에스엠이, 안양, 한국)를 이용하여 3,000 rpm으로 15분간 원심분리를 시행하여 혈청을 얻었다.
- 본 연구에서는 고지혈증 동물모델을 사용하여 오디추출물의 total cholesterol 생성억제를 확인한 결과 MBE가 양성대조군으로 사용한 합성의약품인 Lovastatin보다 혈청 total cholesterol을 효과적으로 감소시키지는 않지만, 200 mg/kg 체중 이상으로 MBE를 섭취할 경우 유의적으로 감소 (P<0.05)시킴을 알 수 있었다.
후속연구
- 동맥경화증에서 ICAM-1 및 VCAM-1의 발현 증가와 이에 따른 세포 간 접착의 유발로 혈관협착 및 혈전형성이 가속화된다는 사실이 국내외 많은 연구에서 입증되었다(30-33). MBE는 이러한 ICAM-1 및 VCAM-1의 발현을 효과적으로 억제함으로써 혈액순환장애의 발생 및 악화를 개선할 수 있을 것으로 기대된다.
- 또한 COX-2는 죽상판의 확대에 관여한다는 연구도 보고되었다(25). MBE의 COX-2 활성저해 효과는 이러한 죽상판의 확대를 방지함으로써 혈액순환장애의 개선에 긍정적인 효과를 낼 것으로 기대된다.
- 05)시켰으나 혈청 C-reactive protein의 수치는 모든 실험군에서 음성대조군 대비 유의적으로 감소하지 않았다. 이러한 MBE의 항산화능, COX-2 활성억제 및 COX-2와 5-LO의 발현억제를 통한 염증억제, 혈중 total cholesterol 감소를 통한 이상지질혈증의 개선 효과 및 ICAM-1과 VCAM-1의 발현억제를 통한 혈관협착 방지의 효과들을 종합해 보면 오디추출물인 MBE가 혈액순환장애를 유발하거나 확대시키는 다양한 핵심요소들을 다각도로 개선시킴으로써 혈액순환장애의 예방과 치료에 긍정적인 효과가 있을 것으로 사료된다.
- 93% 감소하는 것으로 나타났다. 혈액순환장애 및 죽상 동맥경화증 환자들에게서 증가하는 것으로 보고된(35-40) 염증지표인 혈청 C-reactive protein 농도가 본 연구의 고지혈증 동물모델에서 MBE의 식이에 의해 유의적으로 감소 하지 않은 이유는 MBE의 식이기간이 충분하지 않았다고 판단됨으로 향후 장기간의 MBE 식이에 따른 혈중 C-reactive protein의 농도 유의적 변화를 연구할 필요가 있다고 사료된다.
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