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문제 정의
- 따라서 본 연구에서는 현재 수산용 항균제로 허가된 항균제 20종(NFRDI, 2011)에 대하여 essential oil 및 flavonoid와 같은 천연에서 유래하는 물질을 병용하였을 때 어류 세균성 질병의 원인균인 Edwardsiellta tarda와 Streptococcus iniae에 대하여 항균제의 효능을 증가시킬 수 있는 치료 약제로서의 가능성을 탐색하고자 하였다.
제안 방법
- E. tarda와 S. iniae에 대한 항균제의 최종농도가 최소 0.0078 μg/ml에서 최대 512 μg/ml의 범위로 측정하였고, 천연 유래 물질에 대한 어병세균의 MIC는 최소 8 μg/ml에서 최대 8192 μg/ml의 범위로 농도를 측정하였으며, 시험균의 최종농도가 well당 1×106 cfu/ml로 하였다.
- Essential oil과 flavonoid가 세균의 성장을 억제한다는 많은 연구결과가 있지만, 어병 세균에는 직접 적인 비교가 어려워 어병세균에 대한 항균력의 유무를 알아보기 위해 천연물의 최소억제농도 시험을 진행하였다. You et al.
- 높은 농도의 천연물은 어류에 독성이 나타낼 수 있을 것으로 사료되어져 천연물의 병용연구 시험농도를 1 μg/ml로 고정하여 시험하였다.
- 물에 잘 녹지 않는 erythromycin, josamycin, spiramycin, thiamphenicol, chloramphenicol은 ethanol에 녹여 제조하였으며, oxolinic acid, nalidixic acid, flumequine, sulfamethazine, sulfamonomethoxine, sulfadimethoxine, sulfixosazole은 멸균 증류수에 소량의 sodium hydroxide를 첨가하여 녹인 후 사용하였다. 시험에 사용된 NaOH의 농도는 1% 이하였고 pH는 7.
- 수산용 항생제 및 항균제 20종을 5가지 계열로 분류하여 E. tarda와 S. iniae에 대한 항균효과를 평가하였다. 최소억제농도(Minimuminhibitory con- centration, MIC)측정은 96-well plate와 BHI (Brain heart infusion, Difco.
- 시험 약물은 천연 유래물질 5종과 항균제 20종을 계열별로 분류하여 E. tarda와 S. iniae에 대한 최소억제농도를 시험하였다. 시약은 Sigma사에서 erythromycin, spiramycin embonate, tetracycline hy-drochloride, oxytet racycline hydrochloride, doxycy-cline hyclate, ampicillin trihydrate, amoxicillin, ceph-alexin hydrate, neomycin trisulfate salt hydrate, streptomycin sulfate, oxolinic acid, flumequine, nalidixic acid, thiamphe nicol, chloramphenicol, sulfametha-zine, sulfamonomethoxine, sulfadimet hoxine, sulfi-soxazole, thymol, carvacrol, eugenol, cinnamaldehyde, quercetin를 구입하였으며, Josamycin은 Wako (Ja-pan)에서 구입하였다.
- 8 범위였다. 천연 유래 물질인 thymol, carvacrol은 ethanol에 녹여 제조하였으며, eugenol은 70% ethanol에 cinnamaldehyde는 60% ethanol에 녹여 제조하였고, quercetin은 methanol에 녹여 제조하였다. 시험에 사용된 ethanol, methanol의 농도는 1% 이하였다.
- iniae에 대한 항균효과를 평가하였다. 최소억제농도(Minimuminhibitory con- centration, MIC)측정은 96-well plate와 BHI (Brain heart infusion, Difco.)배지를 이용하여 표준 2배 희석법을 사용하였으며(Kim et al., 2011), 28℃에서 24시간 동안 배양한 후에 세균이 자라지 않는 최저 농도를 MIC 값으로 측정하였다.
- 항생제 20여종과 천연물 유래 물질 5종의 병용효과는 최종 농도가 균은 1×106 cfu/ml, 항균제는 E. tarda는 0.0156-512 μg/ml, S. iniae는 0.0078-512 μg/ml, 천연 유래물질은 최종농도가 1 μg/ml로 조제한 후 well당 항생제: 천연 유래물질: 균이 2 : 2 : 1의 비율로 80 μl : 80 μl : 40 μl 씩 well당 분주한 후 24시간동안 28℃에 인큐베이터에 배양 후 microplate reader를 통해 450 nm에서 MIC를 측정하였다.
- 항생제 및 천연 유래 물질과 균의 비율은 4 : 1로 160 μl : 40 μl씩 well당 분주하여 28℃에서 24시간 배양한 후 microplate reader를 통해 450 nm에서 MIC를 측정하여 0시간과 24간의 흡광 값을 비교하여 흡광 값의 차가 0.2이하인 값을 어병세균의 성장이 저해된 농도인 최소억제농도로 정의하였으며 이는 육안으로 판정시 0.2이하는 구별이 가지 않아 0.2로 설정하였다.
- 항생제와 천연물 유래물질의 병용효과의 비교를 위해 어류병원성 세균인 그람 음성균인 Edward- siella tarda와 그람 양성균 Streptococcus iniae의 MIC를 측정하였다. 항생제 20여종과 천연물 유래 물질 5종의 병용효과는 최종 농도가 균은 1×106 cfu/ml, 항균제는 E.
대상 데이터
- 시험에 사용된 ethanol, methanol의 농도는 1% 이하였다. 모든 시약 희석 시 BHI (Brain heart infusion, Difco)배지를 사용하였으며, 모든 시약은 염 및 물을 제외하고 순도는 100%로 보정하고 사용하였다.
- 본 연구에 사용된 균주는 Edwardsiella tarda KCTC 12267와 그람 양성 세균인 Streptococcus iniae KCTC 3657을 한국 생명공학연구원 생물자원 센터에서 분양받아 5% glycerol이 첨가된 Brain heart infusion (BHI) broth (Difco™, USA)에 접종하여 28℃에서 24시간 배양하여 사용하였다.
- iniae에 대한 최소억제농도를 시험하였다. 시약은 Sigma사에서 erythromycin, spiramycin embonate, tetracycline hy-drochloride, oxytet racycline hydrochloride, doxycy-cline hyclate, ampicillin trihydrate, amoxicillin, ceph-alexin hydrate, neomycin trisulfate salt hydrate, streptomycin sulfate, oxolinic acid, flumequine, nalidixic acid, thiamphe nicol, chloramphenicol, sulfametha-zine, sulfamonomethoxine, sulfadimet hoxine, sulfi-soxazole, thymol, carvacrol, eugenol, cinnamaldehyde, quercetin를 구입하였으며, Josamycin은 Wako (Ja-pan)에서 구입하였다.
데이터처리
- Data는 평균 ± 표준오차로 표현하였으며, 유의성 검정에는 SPSS 12.0K program을 사용하여 분산분석(ANOVA: analysis of variance)을 한 후 p<0.05 수준에서 Duncan의 다중검증법 (DMRT: Duncan's multiple range test)에 따라 분석하였다.
- Values are mean±S.E.M. SRa (synergism ratio)=MIC alone/MIC combination *Statistically significant at p<0.05 by Duncan's multiple range test.
성능/효과
- Tetra- cycline 계 항균제인 oxytetracycline에서 eugenol과 병용시 높은 상승효과를 나타내었고, tetracycline과 doxycycline은 5종의 천연물 유래물질 모두에서 길항작용이 나타났다. Aminoglycoside 계 항균제는 neomycin에서 모든 천연 유래물질에서 길항작용을, streptomycin은 5종의 천연물 유래물질에서 모두 상가작용을 나타났다. Macrolide 계 항균제인 erythromycin, spiramycin은 5종 모두에서 길항작용이 나타났으며, josamycin은 quercetin과 병용시 길항작용을 나타낸 반면, 그 외 4종에서 상승작용을 나타냈다.
- Aminoglycoside 계 항균제인 neomycin은 thymol, carvarol, eugenol에서 길항작용, cinnamaldehyde, quercetin은 상가 및 길항작용을 나타내었으며, streptomycin은 5종의 천연 유래물질 모두에서 길항작용을 나타내었다. Macrolide 계인 erythromycin은 thymol, carvacrol, eugenol, cinnamaldehyde에서 상가작용, qurecetin은 길항작용을 나타내었다.
- Aminoglycoside계 항균제는 E. tarda에 대해 4~8 μg/ml, S. iniae에 대해 32~128 μg/ml 범위에 MIC가 나타났으며, Macrolide계 항균제는 E. tarda에 대해 2~32 μg/ml 범위에 나타난 반면, S. iniae에 대해 0.01625~1 μg/ml 범위에 MIC가 나타났고, Chlor- amphenicol계 항균제는 E. tarda와 S. iniae에 대해 0.125~8 μg/ml, 2~4 μg/ml 범위의 MIC가 나타났다.
- Macrolide 계 항균제인 erythromycin, spiramycin은 5종 모두에서 길항작용이 나타났으며, josamycin은 quercetin과 병용시 길항작용을 나타낸 반면, 그 외 4종에서 상승작용을 나타냈다. Chloramphenicol 계 항균제인 thiamphe-nicol은 thymol, carvacrol에서 상승작용, cinnamalde-hyde에서 상승 및 상가작용, eugenol, quercetin은 상가작용을 나타내었고 chloramphenicol은 5종의 천연 유래물질에 대해 모두 길항작용을 나타내었다. Quinolone 계 항균제인 oxolinic acid는 thymol, cavarcrol에서 길항작용을 나타내었고, 그 외 3종에서 상가 및 길항작용을 나타내었으며, flumequine, nalidixic acid는 5종 천연 유래물질에서 모두 상승작용을 나타내었다.
- E. tarda와 S. iniae에 대해 β-lactam계 항균제는 각 MIC가 0.5~4 μg/ml, 0.5~32 μg/ml 범위로 나타났고, Tetracycline계 항균제은 두 세균 모두 0.0625~0.25 μg/ml 범위에서 MIC가 나타났다.
- Macrolide 계인 erythromycin은 thymol, carvacrol, eugenol, cinnamaldehyde에서 상가작용, qurecetin은 길항작용을 나타내었다. Josamycin에 대해 thymol과 quercetin에 상승작용, carvacrol, eugenol, cinnamaldehyde에서는 상가작용을 나타내었다. Spiramycin은 quercetin에서 길항작용, 그 외 4종에 대해 상가작용을 나타냈다.
- Aminoglycoside 계 항균제는 neomycin에서 모든 천연 유래물질에서 길항작용을, streptomycin은 5종의 천연물 유래물질에서 모두 상가작용을 나타났다. Macrolide 계 항균제인 erythromycin, spiramycin은 5종 모두에서 길항작용이 나타났으며, josamycin은 quercetin과 병용시 길항작용을 나타낸 반면, 그 외 4종에서 상승작용을 나타냈다. Chloramphenicol 계 항균제인 thiamphe-nicol은 thymol, carvacrol에서 상승작용, cinnamalde-hyde에서 상승 및 상가작용, eugenol, quercetin은 상가작용을 나타내었고 chloramphenicol은 5종의 천연 유래물질에 대해 모두 길항작용을 나타내었다.
- Chlor- amphenicol 계 항균제는 5종의 천연 유래물질에서 상가작용을 나타냈다. Quinolone 계 항균제인 ox-olinic acid는 5종 천연 유래물질 모두에서 상승작용을 나타내었으며, flumequine은 5종 천연 유래물질 모두에서 길항작용을 나타내었다. Sulfonamide 계 항균제는 5종의 천연 유래물질에서 최고농도인 512 μg/ml 이상에서 MIC값이 나타났다(Table 3).
- Chloramphenicol 계 항균제인 thiamphe-nicol은 thymol, carvacrol에서 상승작용, cinnamalde-hyde에서 상승 및 상가작용, eugenol, quercetin은 상가작용을 나타내었고 chloramphenicol은 5종의 천연 유래물질에 대해 모두 길항작용을 나타내었다. Quinolone 계 항균제인 oxolinic acid는 thymol, cavarcrol에서 길항작용을 나타내었고, 그 외 3종에서 상가 및 길항작용을 나타내었으며, flumequine, nalidixic acid는 5종 천연 유래물질에서 모두 상승작용을 나타내었다. Sulfonamide 계 항균제인 sulfadimethoxine은 5종의 천연 유래물질에서 상가작용, sulfamethazine은 thymol, cinnamaldehyde, quer-cetin에서 상승작용, sulfamonomethoxine은 thymol 에서 상가 및 길항작용, 그 외 4종에서 길항작용 sulfixoazole은 5종 천연 유래물질 모두에서 상가 및 길항작용을 나타냈다(Table 2).
- Sulfonamide 계 항균제는 5종의 천연 유래물질에서 최고농도인 512 μg/ml 이상에서 MIC값이 나타났다(Table 3).
- tarda에 대한 항균제와 천연유래물질의 병용효과는 β-lactam 계 약물인 ampi-cillin은 cinnamaldehyde에서 상가작용을 나타낸 반면, 그 외 4종의 천연 유래물질에서 길항작용을 나타냈으며, amoxicillin과 cephalexin은 5종의 천연물 유래물질 모두에서 상가작용을 나타내었다. Tetra- cycline 계 항균제인 oxytetracycline에서 eugenol과 병용시 높은 상승효과를 나타내었고, tetracycline과 doxycycline은 5종의 천연물 유래물질 모두에서 길항작용이 나타났다. Aminoglycoside 계 항균제는 neomycin에서 모든 천연 유래물질에서 길항작용을, streptomycin은 5종의 천연물 유래물질에서 모두 상가작용을 나타났다.
- iniae에 대한 항균제와 천연물 유래물질의 병용효과는 β-lactam 계열인 ampicillin 은 cinnamaldehyde은 상가 및 길항, 그 외 4종의 천연 유래 물질에서 길항작용을 나타냈으며, amoxi-cillin은 5종의 천연 유래물질 모두에서 상가작용을 나타내었고, cephalexin은 eugenol과 cinnamalde-hyde에서 길항작용을 나타낸 반면, thymol, carva-crol, quercetin에서 상가작용을 나타내었다. Tetra-cycline 계 항균제인 oxytetracycline은 thymol과 car-vacrol에서 상가작용, eugenol은 상승작용, cinna-maldehyde, quercetin은 길항작용을 나타내었으며, tetracycline은 5종의 천연 유래물질에서 상가작용을 나타내었으며, doxytetracycline은 5종 모두 길항작용을 나타내었다.
- 그람 음성균인 E. tarda에 대한 항균제와 천연유래물질의 병용효과는 β-lactam 계 약물인 ampi-cillin은 cinnamaldehyde에서 상가작용을 나타낸 반면, 그 외 4종의 천연 유래물질에서 길항작용을 나타냈으며, amoxicillin과 cephalexin은 5종의 천연물 유래물질 모두에서 상가작용을 나타내었다.
- 그람양성균인 S. iniae에 대한 항균제와 천연물 유래물질의 병용효과는 β-lactam 계열인 ampicillin 은 cinnamaldehyde은 상가 및 길항, 그 외 4종의 천연 유래 물질에서 길항작용을 나타냈으며, amoxi-cillin은 5종의 천연 유래물질 모두에서 상가작용을 나타내었고, cephalexin은 eugenol과 cinnamalde-hyde에서 길항작용을 나타낸 반면, thymol, carva-crol, quercetin에서 상가작용을 나타내었다.
- 두 어병세균에 대해 천연 유래 물질 중 quercetin이 E. tarda에 대해 최소억제농도가 16~32 μg/ml, S. iniae에 대해 64~128 μg/ml에서 나타나 다른 4종의 물질보다 낮은 농도에서 높은 항균효과를 나타내었다.
- 또한 본 연구에서 Macrolide 계 약물에 대한 E. tarda와 S.iniae의 MIC는 2~32 μg/ml, 0.03125~1 μg/ml 범위에 나타났다.
- 본 연구 결과를 요약하면, 천연물과 항생제의 상승작용은 천연물과 항생제의 같은 작용 혹은 서로 다른 작용으로 인해 항생제의 감수성이 높게 나타난 것으로 사료되어진다. E.
- 본 연구에서 Quinolone 계 항균제에 대한 E. tar-da와 S. iniae의 각 MIC값은 0.0625~1 μg/ml, 64~128 μg/ml 이상의 범위에 나타나 Quinolone 계 항균제는 S. iniae 보다 E. tarda에 감수성이 높은 것으로 나타났다.
- , 1989; Hemais- warya and Doble, 2009). 본 연구에서는 Eugenol은 E. tarda에 대해 oxytetracycline, josamycine, flume- quine, nalidixic aicd의 감수성을 증가시켰고, S. iniae에 대해 eugenol은 oxytetracycline, oxolinic acid의 감수성을 증가시켰다. 이에 eugenol이 세포질막에 작용하여 항균제의 활성을 증강시켜준 것으로 사료되어진다.
- aerofenes의 아미노산 탈카르 복시화의 활성을 방해하여 항균작용을 나타낸다는 보고되어있다. 본 연구에서는 cinnamaldehyde는 E. tarda에 대해 oxytetracycline, josamycin, thiampenicol, flumequine, nalidixic acid, sulfamethazine의 감수성을 증가시켰으며, S. iniae에 대해 oxolinic acid의 감수성을 증가시켰다. 이에 cinnamaldehyde의 단백질 합성 작용과 항균제의 단백합성 작용 및 대사억제 작용으로 인해 항균제의 감수성이 증가한 것으로 사료되어진다.
- 본 연구에서는 eugenol과 cinnamaldehyde의 MIC가 E. tarda에 대해서는 512~1024, 64~128 μg/ml의 범위로 S. iniae에 대해서는 2048, 512~1024 μg/ml의 범위로 나타났다.
- (1997)의 연구에서는 프로폴리스의 성분중 하나인 quercetin이 세균의 내부 막의 투과성을 증가시키고 막전위의 손실을 증가시켜 항균작용이 나타난다고 보고되었다. 본 연구에서는 quercetin은 E. tarda에 대해 flumequine, nalidixic acid의 감수성을 증가시켰으며, S. iniae에 대해 josamycin과 oxolinic acid의 감수성을 증가시켰다. 이는 quercetin의 DNA gyrase의 억제작용과 Quinolone 계 항균제의 DNA 합성을 억제작용에 의해 항균제의 감수성을 증진 시킨 것으로 사료되어진다.
- , 2008). 이에 본 연구 또한 oxytetracycline, josamycin, thiamphenicol, flumequine, nalidixic acid, oxolinic acid에 대해 상승작용을 보였으며, 이는 thymol과 carvacrol에 의해 세포막의 투과율이 증강되어 항균제의 감수성이 높아진 것으로 사료되어진다.
후속연구
- 본 연구 결과를 요약하면, 천연물과 항생제의 상승작용은 천연물과 항생제의 같은 작용 혹은 서로 다른 작용으로 인해 항생제의 감수성이 높게 나타난 것으로 사료되어진다. E. tarda에 대해 oxytetracycline과 eugenol의 병합, flumequine과 eugenol의 병합이 기존의 항균제의 감수성을 1/2~1/4정도 높였고, S. iniae에 대해 josamycin과 quercetin의 병합이 항균제의 감수성을 1/2 정도 높여 향후 치료제로서의 사용이 기대되어지며 치료제로서의 효과를 더 연구할 필요성이 있을 것으로 사료되어진다. 또한 무분별한 항균제 사용으로 인한 항균제의 오 · 남용으로 야기될수 있는 피해를 조금이나마 줄일 수 있을 것으로도 기대되지는 바이며, 본 연구가 어병세균인 E.
- 또한 무분별한 항균제 사용으로 인한 항균제의 오 · 남용으로 야기될수 있는 피해를 조금이나마 줄일 수 있을 것으로도 기대되지는 바이며, 본 연구가 어병세균인 E. tarda와 S. iniae에 대한 천연유래물질과 항생제의 항균효과를 연구하는데 있어 현재까지 이루어지지 않아 기초적인 연구 자료로서 사용될 것으로 기대 된다.
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