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문제 정의
- 본 연구에서는 오계 정자에 Diff Quik 염색을 실시하여 닭 정자의 형태 관찰과 생존성을 동시에 판별하는 방법으로 이용될 수 있음을 증명하였다. 또한, 신선정액과 동결정액에서 또한 동일한 시료를 디지털 영상으로 컴퓨터에 저장하여 운동성을 관찰함으로써 운동성을 보이는 정자와 보이지 않는 정자를 분석하였고, 현장에서 채취한 닭정자는 Diff Quik 용액으로 간단히 염색하여 생존성과 운동성을 유추할 수 있는 근거를 마련하고자 실험을 실시하였다.
- 본 연구에서는 오계 정자의 동결 과정에 나타날 수 있는 염색질 이상도를 신선정자와 비교하여 관찰하였으며, 정자의 생존성과 연관성을 분석하였다. 최 등(2013)에 의한 MA동결 보호제를 활용한 오계 정자의 동결 결과, 정자의 생존율이 35%에서 67%로 다양하게 나타남을 보고하였다.
- 본 연구에서는 육종이 필요한 종계장에서 슬라이드 위에 도말된 닭 정액시료를 간편하게 염색하여 정자의 염색질 이상성과 운동성을 유추할 수 있는 기법을 확립하고자 실시하였다. 오계 정자 도말 슬라이드를 Diff-Quik 시약으로 염색하여 관찰하면 신선정액에서는 정자 생존성이 93.
제안 방법
- 0)을 이용하여 저장하였다. 모니터에 나타난 저장된 동영상을 1초간 반복 재생을 실시하고, 트레이싱 페이퍼에 영상을 투과시켜 직접 운동성 정자와 비 운동성 정자를 표기하여 자료를 획득하였다. 한 시료 당 총 3∼5 위치의 동영상을 촬영하여 총 정자수가 200개 이상이 되도록 측정하였다(Kuster et al.
- /mL로 조정하여 실험에 사용하였다. 미리 가온된 슬라이드와 커버글라스를 이용하여 37℃로 가온된 광학 현미경(Olympus IX71)에 올리고, 20배 대물렌즈로 정자를 관찰하였다. 이미지 전용컴퓨터를 이용하여 모니터 상에서 나타나는 디지털 영상을 이미지 전용 프로그램(Olympus사의 DP2-BSW, Band soft 사의 Bandicam v2.
- 신선정자와 동결정자는 Diff Quik 염색 시약(Dade BehringInc. USA)을 활용하여 염색하였다. 약 4∼10 µL를 가온된 슬라이드 글라스에 점적하고, 다른 슬라이드를 경사면에 접촉시켜 도말을 실시하였다.
- 약 4∼10 µL를 가온된 슬라이드 글라스에 점적하고, 다른 슬라이드를 경사면에 접촉시켜 도말을 실시하였다.
- 염색된 시료는 상온에 보관하였으며, ×100오일 렌즈에서 관찰하였고, 밝은 두부를 가진 정자와 진한 두부를 가진 정자로 구별하여 분석하였다.
- 융해된 동결정자를 HS-1희석액으로 1:8로 재희석을 실시하고, 37℃에서 5분간 배양하며 37℃로 미리 가온된 슬라이드 글라스에 희석정액 4 μL를 점적 후, 슬라이드 가온판 위에서 재빨리 다른 슬라이드를 정자소적에 접촉하여 도말을 실시하였다. 염색된 정자에서 두부가 물결모양으로 관찰되는 정자를 측정하여 활력도가 우수한 정자로 판정하였다.
- 1). 오계의 개체별 차이를 관찰하고자 종계 3개체에서 원정액을 채취하고, Diff-Quik 염색을 실시하고 동영상으로 움직임을 관찰하여 그 생존율을 비교하였다. Table 1에서는 오계의 신선 정액의 생존성이 93.
- 오계의 신선 정자와 동결정자에서 Diff-Quik 정상 핵형염색과 활성화된 두부의 움직임에 관한 연관성 분석을 실시하였다. Table 4에서는 신선 정자군에서 정자의 생존성과 정상 핵행 염색의 출현율에 관한 상관계수는 0.
- 오계정자는 동결 전 신선상태의 정자의 운동성과 융해 후정자의 운동성을 관찰하여 그 활력도를 판정하였으며, DiffQuik 염색방법에 의한 핵상 염색도에 따라 이 비율을 상호비교하였다. Fig.
- 오계정자에서 생존성을 보이는 정자의 비율과 Diff-Quik염색에서 정상 핵형 염색의 출현비율에 관한 연관성을 분석하였다. Table 2에서는 신선 정자군에서 정자의 생존성과 정상 핵행 염색의 출현율에 관한 상관 계수는 0.
- 채취된 정액은 5℃ 보온병에 담아 10분 이내로 실험실로 운반하였다. 운반된 정액은 5℃하에서 1:1 비율로 동해방지제가 첨가되지 않은 HS-1 희석액으로 희석 후 30분간 평형시간을 가진 후 1차 희석정액에 동일 비율로 15% MA를 첨가한 희석액에 1:1로 희석하여 동해방지제 MA의 최종농도를 7.5%로 맞추었다. HS-1의 조성은 Hanzawa et al.
- 융해된 동결정자를 HS-1희석액으로 1:8로 재희석을 실시하고, 37℃에서 5분간 배양하며 37℃로 미리 가온된 슬라이드 글라스에 희석정액 4 μL를 점적 후, 슬라이드 가온판 위에서 재빨리 다른 슬라이드를 정자소적에 접촉하여 도말을 실시하였다.
- 미리 가온된 슬라이드와 커버글라스를 이용하여 37℃로 가온된 광학 현미경(Olympus IX71)에 올리고, 20배 대물렌즈로 정자를 관찰하였다. 이미지 전용컴퓨터를 이용하여 모니터 상에서 나타나는 디지털 영상을 이미지 전용 프로그램(Olympus사의 DP2-BSW, Band soft 사의 Bandicam v2.0)을 이용하여 저장하였다. 모니터에 나타난 저장된 동영상을 1초간 반복 재생을 실시하고, 트레이싱 페이퍼에 영상을 투과시켜 직접 운동성 정자와 비 운동성 정자를 표기하여 자료를 획득하였다.
- 준비된 도말 슬라이드는Diff Quik 고정제에 10∼20초 노출시켰으며, 그 후 에오신염색 용액과 티아진 염색 용액에 연속적으로 동일한 시간으로 노출시켜 염색하고, 증류수에 짧게 노출하여 과도한 용액을 제거하였다.
- 염색된 시료는 상온에 보관하였으며, ×100오일 렌즈에서 관찰하였고, 밝은 두부를 가진 정자와 진한 두부를 가진 정자로 구별하여 분석하였다. 한 시료 당 전체 정자가 200개 이상이 되도록 최소 4군데 이상에서 측정하였다. 균일한 결과가 얻을 수 있도록 훈련된 3명의 연구자가 동일한 시료를 자료를 수집하여 상호 비교하여 균일하고 반복성 있는 실험을 유지하였다.
- 희석정액과 동결정액의 영상분석을 실시하였으며, 오계정자의 생존성과 염색질 이상 핵형 염색 출현빈도, 정자의 활력도를 조사하였다.
대상 데이터
- 국립축산과학원 가축유전자원센터에서 보존 중인 32∼40주령의 재래닭 오계 수탉 9수를 정액 채취용으로 본 실험에 사용하였다.
- 오계의 원정액은 HS-1 희석액으로 1:4로 1차 희석하였고, 동결정액과 동일하게 정자의 농도가 150×106/mL로 조정하여 실험에 사용하였다.
데이터처리
- 통계분석은 Statistical Analysis System(SAS release ver9.1, 2002)의 Student’s t-test를 이용하여 평균값을 비교하였고, Pearson’s correlation coefficients analysis를 이용하여 연관성을 검증하였다.
이론/모형
- (2010)의 방법에 따라 제조하였으며, 동결정액의 포장용기로는 0.5 mLstraws(Mini tube, Germany)를 사용하였고, 동결방법으로 액체질소 상면 4∼5cm에서 30분간 동결 후 —196℃에 침지하였다.
- 정액 채취는 맛사지 정액채취법(Burrows and Quinn, 1935; 1937)의 변형인 횡취법(side collection)으로 주 2회 눈금이 있는 15 mL 튜브(Becton Dickinson, USA)에 혼합 채취하였다. 채취된 정액은 5℃ 보온병에 담아 10분 이내로 실험실로 운반하였다.
성능/효과
- 오계의 개체별 차이를 관찰하고자 종계 3개체에서 원정액을 채취하고, Diff-Quik 염색을 실시하고 동영상으로 움직임을 관찰하여 그 생존율을 비교하였다. Table 1에서는 오계의 신선 정액의 생존성이 93.53%, 82.42%및 90.63%일 때, Diff-Quik 염색질의 정상도는 87.96%, 74.25% 및 85.10%로 관찰되었으며, 동일한 시료를 동결하고 융해후 정액의 생존성은 조사하면 69.58%, 61.98% 및 72.20%로 관찰될 때, 염색질의 정상도는 58.91%, 48.49% 및 63.34%로 관찰되었다.
- 한 시료 당 전체 정자가 200개 이상이 되도록 최소 4군데 이상에서 측정하였다. 균일한 결과가 얻을 수 있도록 훈련된 3명의 연구자가 동일한 시료를 자료를 수집하여 상호 비교하여 균일하고 반복성 있는 실험을 유지하였다.
- 이러한 특성을 이용하게 되면 동결 후 융해된 정자의 활성도를 도말 슬라이드 위에서 유추할 수 있으며, 정자의 정상핵형 염색도와 생존성, 정자 두부의 운동성은 서로 상관관계가 존재함을 알 수 있었다. 그러므로 본 연구결과에 따르면, 닭 정자에 있어서 Diff-Quik 염색방법은 사람의 정자와 동일하게 정자의 이상성 유무를 판단하게 하는 가장 간편하고 가장 빠른 염색방법으로 응용할 수 있음을 알 수 있으며, 특별한 실험도구나 장비를 이용하기 어려운 현장이나 농가에서 닭 정액의 품질을 객관화 할 수 있는 실험 방법으로 추정된다.
- 10%로 관찰되었다. 동일한 시료를 동결하고 융해후 정액의 생존성은 조사하면 69.58%, 61.98% 및 72.20%로 관찰되었으며, 염색질의 정상도는 58.91%, 48.49% 및 63.34%로 관찰되었다. 융해된 동결정액에서 활력이 우수한 정자를 쉽게 관찰하기 위하여 정자를 HS-1 희석액으로 재 희석하고, 37℃에서 가온하여 도말하면 염색된 정자의 두부에서 활력이 우수한 정자의 비율을 간단히 유추할 수 있음을 보여주었다.
- 이 방법은 각 염색시료에 노출되는 시간이 약 15초에서 20초 내외로 전통적 염색방법에 비하여 매우 빠르며, 정상 정자의 비율이 확인하는 것이 매우 중요한 체외수정 클리닉과 현장에서 실시하는 야생 동물의 연구에 널리 사용되고 있다. 본 연구에서는 오계 정자에 Diff Quik 염색을 실시하여 닭 정자의 형태 관찰과 생존성을 동시에 판별하는 방법으로 이용될 수 있음을 증명하였다. 또한, 신선정액과 동결정액에서 또한 동일한 시료를 디지털 영상으로 컴퓨터에 저장하여 운동성을 관찰함으로써 운동성을 보이는 정자와 보이지 않는 정자를 분석하였고, 현장에서 채취한 닭정자는 Diff Quik 용액으로 간단히 염색하여 생존성과 운동성을 유추할 수 있는 근거를 마련하고자 실험을 실시하였다.
- 특히 닭정자의 생존성과 운동성 측정은 정자의 수정능과 발생능을 추정할 수 있는 중요한 요인으로 간주되고 있으나, 닭의 정자는 형태가 매우 길고, 두부와 편모의 경계가 명확하지 않아 판정이 어려운 것으로 알려져 있다. 본 연구의 결과에서는 오계의 신선 정액이 생존율이 서로 상이하게 나타나더라도, 정자 두부의 정상적인 염색질의 출현율은 비교적 균일하게 나타남을 보여주고 있다. 닭의 정액 동결 성적에 관한 균일성을 좌우하는 것이 개체에 따른 정자 염색질의 이상성이 한 원인이 될 수 있음을 설명하고 있으며, 닭 정액의 동결에 고려하여야 할 사항임을 상기시켜 준다.
- 본 연구에서는 육종이 필요한 종계장에서 슬라이드 위에 도말된 닭 정액시료를 간편하게 염색하여 정자의 염색질 이상성과 운동성을 유추할 수 있는 기법을 확립하고자 실시하였다. 오계 정자 도말 슬라이드를 Diff-Quik 시약으로 염색하여 관찰하면 신선정액에서는 정자 생존성이 93.53%, 82.42% 및 90.63%일 때, Diff-Quik 염색질의 정상도는 87.96%, 74.25% 및 85.10%로 관찰되었다. 동일한 시료를 동결하고 융해후 정액의 생존성은 조사하면 69.
- 오계의 동결 후 융해된 정자에서는 정상 핵형이 56.92±12.15%일 때 67.92±7.55%로 관찰되었으며, 활성화된 정자의 두부 움직임을 보여주고 있는 정자의 비율은 47.32±5.02%로 관찰되었다.
- 34%로 관찰되었다. 융해된 동결정액에서 활력이 우수한 정자를 쉽게 관찰하기 위하여 정자를 HS-1 희석액으로 재 희석하고, 37℃에서 가온하여 도말하면 염색된 정자의 두부에서 활력이 우수한 정자의 비율을 간단히 유추할 수 있음을 보여주었다. 특히, 신선 정자에서 정상 염색질을 가진 정자의 비율과 생존성이 상관관계는 매우 높은 것으로 판단되며, 동결정자에서도 상관관계가 높다고 추정되었다.
- 특히, 신선 정자에서 정상 염색질을 가진 정자의 비율과 생존성이 상관관계는 매우 높은 것으로 판단되며, 동결정자에서도 상관관계가 높다고 추정되었다. 이러한 결과는 Diff-Quik 염색방법으로 닭 정액의 품질을 정자의 염색질의 이상성 유무로 판단할 수 있음을 보여주고 있다. 특히 본 연구에서 제시된 방법은 닭 정자의 우수성을 판단하는데 유용할 것으로 판단되며, 닭 정액 시료를 준비할 때 준비한 도말슬라이드를 현미경적 관찰에 의하여 활성화된 정자의 비율과 정상 염색질을 가진 정자의 비율을 추정하는 방법을 제시하였으며, 이는 인공 수정에 필요한 현장에서 수컷 개체의 종축 이용성을 쉽게 판단할 수 있는 근거를 마련할 수 있음을 의미한다.
- 이러한 특성을 잘 이용하여 슬라이드도 말을 준비하게 되면, 닭 정자는 간단한 방법으로도 활성화된 정자의 움직임이 슬라이드 상에서 관찰할 수 있음을 본 연구에서 밝혔다. 이러한 특성을 이용하게 되면 동결 후 융해된 정자의 활성도를 도말 슬라이드 위에서 유추할 수 있으며, 정자의 정상핵형 염색도와 생존성, 정자 두부의 운동성은 서로 상관관계가 존재함을 알 수 있었다. 그러므로 본 연구결과에 따르면, 닭 정자에 있어서 Diff-Quik 염색방법은 사람의 정자와 동일하게 정자의 이상성 유무를 판단하게 하는 가장 간편하고 가장 빠른 염색방법으로 응용할 수 있음을 알 수 있으며, 특별한 실험도구나 장비를 이용하기 어려운 현장이나 농가에서 닭 정액의 품질을 객관화 할 수 있는 실험 방법으로 추정된다.
- 또한, 닭 정자의 움직임은 포유동물과는 다르게 두부에서 이동성을 나타나는 운동이 개시되고 있다. 이러한 특성을 잘 이용하여 슬라이드도 말을 준비하게 되면, 닭 정자는 간단한 방법으로도 활성화된 정자의 움직임이 슬라이드 상에서 관찰할 수 있음을 본 연구에서 밝혔다. 이러한 특성을 이용하게 되면 동결 후 융해된 정자의 활성도를 도말 슬라이드 위에서 유추할 수 있으며, 정자의 정상핵형 염색도와 생존성, 정자 두부의 운동성은 서로 상관관계가 존재함을 알 수 있었다.
- 이러한 결과는 Diff-Quik 염색방법으로 닭 정액의 품질을 정자의 염색질의 이상성 유무로 판단할 수 있음을 보여주고 있다. 특히 본 연구에서 제시된 방법은 닭 정자의 우수성을 판단하는데 유용할 것으로 판단되며, 닭 정액 시료를 준비할 때 준비한 도말슬라이드를 현미경적 관찰에 의하여 활성화된 정자의 비율과 정상 염색질을 가진 정자의 비율을 추정하는 방법을 제시하였으며, 이는 인공 수정에 필요한 현장에서 수컷 개체의 종축 이용성을 쉽게 판단할 수 있는 근거를 마련할 수 있음을 의미한다.
- 닭의 정액 동결 성적에 관한 균일성을 좌우하는 것이 개체에 따른 정자 염색질의 이상성이 한 원인이 될 수 있음을 설명하고 있으며, 닭 정액의 동결에 고려하여야 할 사항임을 상기시켜 준다. 특히 오계정액의 신성정액에서 나타나는 정자 염색질의 정상도는 정자의 생존성과 고도의 연관성이 있음이 본 연구에서 밝혀졌으며, 이는 닭 정액 품질을 판단하는데 있어서 동결 전 정액의 염색 방법으로 Diff-Quik 염색을 응용할 때 염색질의 정상도를 판단하는데 가치가 높음을 의미한다. 또한, 닭 정자의 움직임은 포유동물과는 다르게 두부에서 이동성을 나타나는 운동이 개시되고 있다.
- 융해된 동결정액에서 활력이 우수한 정자를 쉽게 관찰하기 위하여 정자를 HS-1 희석액으로 재 희석하고, 37℃에서 가온하여 도말하면 염색된 정자의 두부에서 활력이 우수한 정자의 비율을 간단히 유추할 수 있음을 보여주었다. 특히, 신선 정자에서 정상 염색질을 가진 정자의 비율과 생존성이 상관관계는 매우 높은 것으로 판단되며, 동결정자에서도 상관관계가 높다고 추정되었다. 이러한 결과는 Diff-Quik 염색방법으로 닭 정액의 품질을 정자의 염색질의 이상성 유무로 판단할 수 있음을 보여주고 있다.
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