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문제 정의
- 따라서 본 연구에서는 십자화과 채소의 일종인 콜라비 중 자색 콜라비의 가식부와 껍질의 항산화 효과와 암세포 증식억제효과를 비교 분석하여 콜라비가 다양한 기능성 식품소재로 활용할 수 있는 자료를 제공하고자 실시하였다.
제안 방법
- 여과된 색소추출액은 35℃ 이하에서 감압농축 후 지질성분을 제거하기 위해 ethylether:hexane(l :6, v/v)의 혼합액으로 세척하였으며, 이를 다시 농축하여 남아있는 ethylether와 hexane을 제거하여 분석 시험용매로 사용하였다. Anthocyanin 함량 분석을 위한 표준물질인 cyanidin- 3-glucoside (C3G)와 HPLC chromatograme 비교하여 정량분석을 실시하였다. HPLC(Aglilent 1100, Waldbronn, Germany) 분석은 mobile phase를 distilled water:methanol:formic acid 75:20:5로 조제한 후 gradient program을 조합하고, 칼럼은 AtlantisTM de 18(4.
- Anthocyanin 함량 분석을 위한 표준물질인 cyanidin- 3-glucoside (C3G)와 HPLC chromatograme 비교하여 정량분석을 실시하였다. HPLC(Aglilent 1100, Waldbronn, Germany) 분석은 mobile phase를 distilled water:methanol:formic acid 75:20:5로 조제한 후 gradient program을 조합하고, 칼럼은 AtlantisTM de 18(4.6 x 150 mm, 3 μm)를 사용하였으며, 이동상 0.85 mL/min으로 UV detector 520 nm에서 분석하였다.
- Louis, MO, USA) 에 첨가하고, 초음파(SONICS®, UCX- 750, CT, USA)를 이용하여 시료 추출물과 유지가 잘 혼합되도록 하였다. Rancimat의 측정 조건은 시료 추출물 각각 3.0 g을 반응용기에 취하고 증류수 70 mL 를 측정용기에 넣은 후 110℃에서 air flow rate 20 L/h로 하여 산화안정성을 비교하였다. 합성 항산화제 인 BHA와 BHT와 천연 항산화제인 비타민 C 은 양성 대조군으로 아무 것도 첨가하지 않은 것을 음성대조군으로 비교 실험하였다.
- 분양받아 사용하였다. 각 세포주는 100 Units/ mL의 penicillin-streptomycin(GIBCO, Rockville, MD, USA) 과 10%의 fetal bovine serum(FBS)이 함유된 RPMI 1640(Rosewell Park Memorial Institute, Hyclone, Logan, UT, USA), DMEM(Dulbeco Minimum Essential Medium, GIBCO, Rockville, MD, USA), lVEM(Minimum Essential Medium, GIBCO, Rockville, MD, USA) 배지를 사용하여 37℃, 5% CCh incubator (Model 311, Forma, Waltham, MA, USA) 에서 배양하였다. 배양된 각각의 암세포는 일주일에 2~3회 refeeding하고, 6-7일 만에 phosphate buffered saline (PBS)로 세척한 후 0.
- 동결 건조한 콜라비 가식부와 껍질 분말은 각각 100 g당 80% ethanol 1,500 mL을 첨가한 후 환류 냉각관을 부착한 65℃의 Heating mantle(Mtops ms-265, Seoul, Korea) 에서 3시간씩 3회 추출한 다음 Whatman filter paper(No.2, GE Heathcare, Buckinghamshire, UK)로 여과하였다. 여액을 40℃ 수욕 상에서 rotary vacuum evaporator(EYELA VACUUM NVC-1100, Tokyo, Japan)로 용매를 제거하고 감압.
- 본 연구는 자색 콜라비 껍질(비가식부위)과 가식부 에탄올 추출물의 항산화 효과 및 암세포 증식 억제효과를 비교 분석하였다. 콜라비 에탄올 추출물의 총 flavonoid 함량은 껍질에서 23.
- 2 mM DPPH 1 mL을 test tube에 취한 후 혼합하여 37C에서 30 분간 반응시켜 UV-spectrophotometer(Shimadzu UV- 1601PC, Kyoto, Japan)를 사용하여 517 nm에서 흡광도를 측정하였다. 이때, 활성의 비교를 위하여 양성대조군으로 비타민 C와 합성 항산화제인 BHA 와 BHH를 이용하여 동일한 방법으로 측정하였다. 콜라비 추출물의 DPPH radical 소거 능은(1-시료첨가구의 흡광도/무첨가구의 흡광도) X 100에 의하여 계산하여 나타냈다.
- 총 flavonoid 함량은 Davis법을 변형한 방법 (Chae et al. 2002)에 따라 측정하였다. 콜라비 가식 부와 껍질의 에탄올 추출물을 각각 1 mL에 diethylene glycol 2 mL을 첨가한 다음 IN NaOH 20 을 넣고 37℃ water bath에서 1시간 동안 반응시킨 후 UV-spectrophotometer(Shimadzu UV-1601PC, Kyoto, Japan)로 420 nm에서 흡광도를 측정하였다.
- 콜라비 가식부와 껍질 에탄올 추출물의 간암 세포 성장 억제효과를 측정하기 위해 간암(HepG2) 세포주를 대상으로 MTT assay를 이용한 간암세포 증식 억제효과를 알아보았다. 콜라비 가식부와 껍질 에탄올 추출물의 농도별(16.
- 대상으로 MTT assay를 이용한 간암세포 증식 억제효과를 알아보았다. 콜라비 가식부와 껍질 에탄올 추출물의 농도별(16.125, 31.25, 62.50, 125, 250, 500, 1000 μg/mL)로 시료 처리를 한 후각 세포 생존율을 측정한 결과는 Fig. 1과 같다. 간암 세포에 대한 암세포 성장 억제효과를 살펴보면, 콜라비 껍질 에탄올 추출물의 경우에만 500 μg/mL 이상에서는 간암 세포 성장 억제효과가 나타났으나, 콜라비 가식부 추출물은 간암세포 증식억제 효과가 나타나지 않았다.
- 콜라비 가식부와 껍질 에탄올 추출물의 대장암세포 성장 억제효과를 측정하기 위해 대장암 (HCT-116) 세포주를 대상으로 MTT assay를 이용하여 알아보았다. 콜라비 가식부와 껍질 에탄올 추출물의 농도별(16.
- 콜라비 가식부와 껍질 에탄올 추출물의 폐암 세포 성장 억제효과를 측정하기 위해 폐암(A549) 세포주를 대상으로 MTT assay를 이용한 폐암 세포증식 억제효과를 알아보았다. 콜라비 가식부와 껍질 에탄올 추출물의 농도별(16.
- 측정하였다. 콜라비 껍질과 가식부의 에탄올 추출물에 포함된 용매를 완전히 제거한 함량이 600 ppm이 되도록 soybean oil(Sigma-Aldrich Co., St. Louis, MO, USA) 에 첨가하고, 초음파(SONICS®, UCX- 750, CT, USA)를 이용하여 시료 추출물과 유지가 잘 혼합되도록 하였다. Rancimat의 측정 조건은 시료 추출물 각각 3.
- 콜라비 부위별 추출물의 총 flavonoid 함량은 rutin을 기준 물질로 측정하였으며, 그 결과는 Table 1과 같다. 콜라비 가식부와 껍질 에탄올 추출물의 총 flavonoid 함량은 각각 0.
- 콜라비 가식 부와 껍질의 에탄올 추출물을 각각 1 mL에 diethylene glycol 2 mL을 첨가한 다음 IN NaOH 20 을 넣고 37℃ water bath에서 1시간 동안 반응시킨 후 UV-spectrophotometer(Shimadzu UV-1601PC, Kyoto, Japan)로 420 nm에서 흡광도를 측정하였다. 표준 곡선은 rutin을 이용하여 최종 농도가 0, 0.2, 0.4, 0.6, 0.8 및 1.0 mg/mL가 되도록 조제하였으며, 이 검량곡선으로부터 시료 중의 flavonoid 함량을 구했다.
- 0 g을 반응용기에 취하고 증류수 70 mL 를 측정용기에 넣은 후 110℃에서 air flow rate 20 L/h로 하여 산화안정성을 비교하였다. 합성 항산화제 인 BHA와 BHT와 천연 항산화제인 비타민 C 은 양성 대조군으로 아무 것도 첨가하지 않은 것을 음성대조군으로 비교 실험하였다.
대상 데이터
- 부분은 가식부로 사용하였다. 가식부와 비가식부(껍질)를 각각 구분하여 동결 건조하고 분쇄하여 분말로 제조한 후 -70℃에서 냉동 보관 하면 서 시료로 사용하였다. 각 실험항목에 대한 시료의 분석은 3회 반복 실시하였다.
- 본 실험에 사용된 자색 콜라비는 2013년 2월 제주도 애월읍에서 재배한 것을 구입하여 콜라비의 껍질은 1 mm 정도로 깎아서 사용하였으며, 나머지 부분은 가식부로 사용하였다. 가식부와 비가식부(껍질)를 각각 구분하여 동결 건조하고 분쇄하여 분말로 제조한 후 -70℃에서 냉동 보관 하면 서 시료로 사용하였다.
- 본 실험에 사용한 암세포주는 인체 간암세포인 Hep G2, 인체 대장암세포인 HCT-116, 인체 폐암 세포인 A549로 한국세포주은행(KCLB, Seoul, Korea) 에서 분양받아 사용하였다. 각 세포주는 100 Units/ mL의 penicillin-streptomycin(GIBCO, Rockville, MD, USA) 과 10%의 fetal bovine serum(FBS)이 함유된 RPMI 1640(Rosewell Park Memorial Institute, Hyclone, Logan, UT, USA), DMEM(Dulbeco Minimum Essential Medium, GIBCO, Rockville, MD, USA), lVEM(Minimum Essential Medium, GIBCO, Rockville, MD, USA) 배지를 사용하여 37℃, 5% CCh incubator (Model 311, Forma, Waltham, MA, USA) 에서 배양하였다.
- 이용액을 3, 200 rpm에서 10분간 원심분리하여 상등액 을 40 uL 취하고 2mM sodium tetrachloropalladate solution 800 uL씩 첨가한 후 30분간 반응시켜 microplate reader를 사용하여 405 nm에서 흡광도를 측정하였다. 표준물질로는 glucosinolate와 구조가 비슷한 sinigrin hydrate(Sigma, Mo, USA) 을 사용하였다.
데이터처리
- 모든 실험은 독립적으로 3회 반복 실시하여 얻은 결과로, 본 실험에서 얻어진 결과는 SPSS 18.0 P/C package(SPSS Inc., Chicago, IL, USA)를 이용하여 통계 분석하였다. 실험군당 평균 土 표준오차로 표시하였고, 세 집단 이상의 평균치 분석은 일원 배치 분산분석 (one-way analysis of variance) 을 한 후 통계적 유의성 검정은 p<0.
- , Chicago, IL, USA)를 이용하여 통계 분석하였다. 실험군당 평균 土 표준오차로 표시하였고, 세 집단 이상의 평균치 분석은 일원 배치 분산분석 (one-way analysis of variance) 을 한 후 통계적 유의성 검정은 p<0.05 수준에서 Tukey's test를 이용하여 상호 검정 (Post-Hoc test)하였으며, 두 집단 간 통계적 유의성 검정은 Student's t-test를 실시하여 유의성을 검정하였다.
이론/모형
- Kim et aL(2000)의 방법에 따라 껍질과 가식 부 분말 1 g을 취하여 1%의 HC1 을 함유한 methanol로 색소를 추출하였다. 색소 추출 효율을 높이기 위하여 진탕기를 이용하여 4℃ 암소에서 24시간 진탕한 다음 Whatman No.
- 시료의 전자공여능 측정을 Blois(1958)에 준하여, 콜라비 에탄올 추출물 분획들의 DPPH에 대한수소공여능을 측정하였다. 콜라비 가식부와 껍질의 에탄올 추출물을 각각 1 mL과 0.
- 암세포 증식 억제 효과를 측정하기 위해 Ishiyama et aL(1996)의 방법에 따라 MTT(3-(4, 5- dimethylthiazol -2-yl)-2, 5-diphenyltetrazolium bromide) assay로 실험하였다. 즉, 1x105 cell/well 농도로 96 well plate에 100 씩 분주한 후 37℃, 5% CO2 배양기에서 24 시간 배양 후, 전 배양에 사용된 배지를 제거하고 배지에 일정 농도로 희석된 추출물을 100 "L를첨가하여 다시 24시간 배양하였다.
- 이때, 활성의 비교를 위하여 양성대조군으로 비타민 C와 합성 항산화제인 BHA 와 BHH를 이용하여 동일한 방법으로 측정하였다. 콜라비 추출물의 DPPH radical 소거 능은(1-시료첨가구의 흡광도/무첨가구의 흡광도) X 100에 의하여 계산하여 나타냈다.
- 항산화지 수(antioxidant index, AI)는 Joo & Kim (2002)의 방법에 의하여 Rancimat (Metrohm model 679, Herisan, Switzerland)을 이용하여 측정하였다. 콜라비 껍질과 가식부의 에탄올 추출물에 포함된 용매를 완전히 제거한 함량이 600 ppm이 되도록 soybean oil(Sigma-Aldrich Co.
성능/효과
- 콜라비 가식 부와 껍질 에탄올 추출물의 DPPH radical 소거능을 측정한 결과는 Table 2와 같다. 1 mg/mL에서 콜라비 가식 부와 껍질 에탄올 추출물의 DPPH radical 소거 능은 각각 23.13%와 87.28%로 콜라비 껍질이 가식 부에 비해 3배 이상 높은 것으로 나타났다. 콜라비 껍질 에탄올 추출물의 DPPH radical 소거 능은 천연항산화제인 비타민 C에 비해서는 적었으나, 합성항산화제인 BHT 및 BHA와는 비슷한 수준을 나타내었다.
- 1과 같다. 간암 세포에 대한 암세포 성장 억제효과를 살펴보면, 콜라비 껍질 에탄올 추출물의 경우에만 500 μg/mL 이상에서는 간암 세포 성장 억제효과가 나타났으나, 콜라비 가식부 추출물은 간암세포 증식억제 효과가 나타나지 않았다. 같은 십자화과 채소인 배추와 양배추 에탄올 추출물의 간암 세포의 성장 억제 활성을 측정한 결과 배추와 양배추 추출물의 농도가 증가할수록 간암 세포의 생존율이 저하되 어 250 ppm 농도에서 각각 42.
- 25 로 합성 항산화제인 BHT 및 BHA와 비슷한 수준으로 나타나 높은 항산화 활성이 나타났으며, 가식부는 항산화 활성이 아주 미미하게 보였다. 간암(Hep G2), 대장암(HCT116) 및 폐암(A549) 세포에 대한 콜라비 에탄올 추출물의 암세포 증식 억제효과를 알아본 결과, 콜라비 껍질 에탄올 추출물의 농도가 증가함에 따라 농도 의존적으로 암세포 증식 억제 활성이 높아지는 경향이었다. 그러나 가식부 추출물의 경우는 암세포 성장 억제효과가 나타나지 않았다.
- 본 연구에서는 페놀성 물질의 함량이 비교적 높은 껍질의 radical 소거능 활성이 높게 나타났으며 비교적 페놀성 함량이 낮은 가식부의 경우 낮은 radical 소거능을 나타내었다. 이는 총 폴리페놀 함량이 DPPH radical 소거능과 상관관계를 갖는다는 보고(Kang et al.
- 콜라비 가식부 및 껍질 에탄올 추출물의 유지 산화 억제효과를 알아보기 위하여 Rancimat으로 측정한 항산화지수는 Table 3과 같다. 양성대조군으로 사용한 천연항산화제인 비타민 C의 항산화 지수가 가장 높았고, 합성항산화제인 BHH와 BHA는 비타민 C에 비하여 낮게 나타났다. 콜라비 가식 부와 껍질의 항산화 지수는 BHT, BHA 및 비타민 C에 비해서는 낮았으나 시료를 미첨가한 음성대조군보다는 높게 나타났다.
- 이상의 결과 콜라비 가식부와 껍질 에탄올 추출물 중 콜라비 껍질 추출물의 항산화효과 및 항암 활성이 높게 나타났다. 콜라비 껍질 추출물은 간암, 대장암 및 폐암세포 모두 증식 억제 활성을 보였고, 특히 대장암세포에서 40% 이상의 증식 억제 활성을 보였다.
- 양성대조군으로 사용한 천연항산화제인 비타민 C의 항산화 지수가 가장 높았고, 합성항산화제인 BHH와 BHA는 비타민 C에 비하여 낮게 나타났다. 콜라비 가식 부와 껍질의 항산화 지수는 BHT, BHA 및 비타민 C에 비해서는 낮았으나 시료를 미첨가한 음성대조군보다는 높게 나타났다. 콜라비 껍질 추출물이 콜라비 가식부 주줄물에 비하여 항산화 지수가 유의적으로 높았다.
- 1과 같다. 콜라비 가식부와 껍질 에탄올 추출물의 총 flavonoid 함량은 각각 0.18 mg/g과 23.20 mg/g으로 콜라비 껍질 부분의 총 flavonoid 함량이 훨씬 높은 것으로 나타났다. Park et al.
- 결과 Table 1과 같다. 콜라비 가식부와 껍질 추출물의 glucosinolate 함량은 각각 19.92 μmol/g와 12.74 μmol/g로 가식부가 껍질 부위에 비해 높게 나타났다. Choi et aL(2010)은 녹색 콜라비의 부위별 추출물의 glucosinolate 함량 측정 결과 과육 및 껍질의 glucosinolate 함량이 각각 3.
- 콜라비 가식부와 껍질의 에탄올 추출물 수율은 각각 5.23%와 6.77%의 범위로 나왔으며, 가식부에서 추출 수율이 좀 더 높게 나타났다.
- 높게 나타났다. 콜라비 껍질 추출물은 간암, 대장암 및 폐암세포 모두 증식 억제 활성을 보였고, 특히 대장암세포에서 40% 이상의 증식 억제 활성을 보였다. 따라서 콜라비 껍질에는 항암 활성을 나타내는 물질들을 함유하고 있으며 향후 암 예방 식품으로 활용 가능성이 있을 것으로 생각된다.
- 74 "mol/g로 나타났다. 콜라비 껍질 추출물의 DPPH radical 소거능은 87.28%, RancimM에 의한 항산화 지수는 9.25 로 합성 항산화제인 BHT 및 BHA와 비슷한 수준으로 나타나 높은 항산화 활성이 나타났으며, 가식부는 항산화 활성이 아주 미미하게 보였다. 간암(Hep G2), 대장암(HCT116) 및 폐암(A549) 세포에 대한 콜라비 에탄올 추출물의 암세포 증식 억제효과를 알아본 결과, 콜라비 껍질 에탄올 추출물의 농도가 증가함에 따라 농도 의존적으로 암세포 증식 억제 활성이 높아지는 경향이었다.
- 콜라비 가식 부와 껍질의 항산화 지수는 BHT, BHA 및 비타민 C에 비해서는 낮았으나 시료를 미첨가한 음성대조군보다는 높게 나타났다. 콜라비 껍질 추출물이 콜라비 가식부 주줄물에 비하여 항산화 지수가 유의적으로 높았다. Park et aL(2014)은 자색 콜라비 부위별 추출물의 항산화도 분석결과 부위별 추출물의 유의적 차이는 없었으나 콜라비 껍질이 가장 높은 값을 나타나 자색 콜라비 껍질이 천연항산화제로 활용가치가 내재되어 있다고 보고하였다.
- 2와 같다. 콜라비 껍질추출물은 16.125 zzg/mL 이상의 농도에서 대장암세포의 생존율이 유의하게 저하되었으며, 가장 높은 농도인 1000 μg/mL에서 가장 낮은 생존율을 보였다. 반면 콜라비 가식부 추출물은 대장암세포 증식 억제효과가 나타나지 않았다.
후속연구
- 콜라비 껍질 추출물은 간암, 대장암 및 폐암세포 모두 증식 억제 활성을 보였고, 특히 대장암세포에서 40% 이상의 증식 억제 활성을 보였다. 따라서 콜라비 껍질에는 항암 활성을 나타내는 물질들을 함유하고 있으며 향후 암 예방 식품으로 활용 가능성이 있을 것으로 생각된다.
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