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가설 설정
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제안 방법
- 10 μM H2-DCFDA를 처리한 후 빛이 들어가지 않도록 주의하여 37℃에서 2시간 동안 반응시킨 뒤 멸균된 PBS를 이용하여 2회 세척하였고, Gel/Mount를 이용하여 마운팅 하였다.
- 시료는 녹색 및 자색 콜라비 착즙액 원액(100%)을 증류수로 50%, 25%로 희석하여 이용하였다. 7.4 mM ABTS와 2.6 mM potassium persulfate를 혼합한 후, 암소에서 24시간 방치하여 양이온(ABTS+)을 형성시킨 후, 750 nm에서 흡광도의 값이 1.7 이하가 되도록 보정하여 ABTS 용액을 제조하였다. 농도별로 희석된 시료를 20 μL씩 1.
- ABTS radical 소거능은 Custdio 등(18)의 방법을 변형하여 측정하였다. 시료는 녹색 및 자색 콜라비 착즙액 원액(100%)을 증류수로 50%, 25%로 희석하여 이용하였다.
- DPPH radical 소거능은 Liang 등(17)의 방법을 변형하여 측정하였다. 시료는 녹색 및 자색 콜라비 착즙액 원액(100%)을 증류수를 이용하여 50% 및 10%로 희석하여 사용하였으며, 0.
- 시료 25 μL와 40 nM fluorescein 150 μL를 black 96-well plate에 첨가한 후, 측정 직전에 peroxy radical 생성제인 150 mM AAPH 25 μL를 첨가하였다. Fluorescence microplate reader (Spectramax GEMINI EM, Molecular Devices, Sunnyvale, CA, USA)를 이용하여 485 nm에서 전자여기 후 535 nm에서 방출되는 조건으로 37℃에서 90분 동안 매 3분 간격으로 fluorescence의 감소율을 분석하였다. 결과 값은 시료 첨가구와 무 첨가구의 area under curve (AUC) 값을 나타낸 후, Trolox를 이용하여 작성한 표준 검량 곡선(y=0.
- Reducing power는 Jayaprakasha 등(20)의 방법을 변형하여 측정하였다. 농도별로 희석한 녹색 및 자색 콜라비 착즙액 0.
- 10 μM H2-DCFDA를 처리한 후 빛이 들어가지 않도록 주의하여 37℃에서 2시간 동안 반응시킨 뒤 멸균된 PBS를 이용하여 2회 세척하였고, Gel/Mount를 이용하여 마운팅 하였다. 그 후, 역상현미경(Leica DM 3000B, Wetzlar, Germany)로 관찰하였다.
- 녹색 및 자색 콜라비 착즙액의 pH 측정은 pH meter (pH 510, EUTECH, Co., Anyang, Korea)를 이용하여 3회 반복 측정 후 평균치를 나타내었고, oBx는 각각의 시료를 500 μL씩 취한 다음 당도계(PAL-α Brix 0-85%, Atago, Tokyo, Japan)를 이용하여 3회 반복 측정하여 평균값을 산출하였다.
- 녹색 및 자색 콜라비 착즙액의 아질산염 소거능 측정은 Kato 등(21)의 방법을 변형하여 사용하였다. 시료 1 mL에 1 mM NaNO2용액 1 mL을 첨가하고 0.
- XTT working solution은 40 μL씩 취하여 각각의 well에 첨가한 후, plate를 바닥에 붙인 상태로 가볍게 흔들면서 혼합하였다. 다음 빛을 차단하고 CO2 incubator에서 4시간 동안 반응한 후, microplate reader를 이용하여 450 nm 흡광도 값에서 690 nm의 흡광도 값을 뺀 결과 값으로 세포 독성을 계산하였다.
- 배양이 끝난 후, 배지를 제거하고 각 well에 XTT working solution이 20% 포함된 배지를 200μL씩 첨가하였다. 다음 빛을 차단하고 CO2 incubator에서 4시간 동안 반응한 후, microplate reader를 이용하여 450 nm 흡광도 값에서 690 nm의 흡광도 값을 뺀 결과 값으로 세포 손상 보호 효과를 계산하였다.
- 따라서 본 연구에서는, 녹색 및 자색 콜라비 착즙액의 세포 보호 효과 및 항산화 활성을 측정하기 위하여 10-50 μg/mL 농도를 이용하여 실험을 진행하였다.
- 따라서, 본 연구에서는 녹색 및 자색 콜라비 착즙액의 항산화 효능을 확인하기 위하여 이화학적 특성(pH 및 oBrix), 총 페놀 함량, 항산화 효능(oxygen radical absorbance capacity (ORAC), DPPH radical 소거능, ABTS radical 소거능, ferric ion reducing antioxidant power (FRAP), reducing power 및 아질산염 소거능을 평가하였고, 피부 섬유아세포(human dermal fibroblast)에서 과산화 수소에 의하여 발생하는 산화적 스트레스에 대한 세포 보호 효과를 측정하였으며 H2-2',7'-dichlorodihydrofluorescein diacetate (DCFDA)법으로 관찰하였다.
- 배양이 끝난 후, 배지를 제거하고 각 well에 XTT working solution이 20% 포함된 배지를 200μL씩 첨가하였다.
- 본 연구에서는 녹색 및 자색 콜라비 착즙액의 이화학적 특성(pH 및 oBx), 총 페놀함량, 항산화 활성(ORAC 지수, DPPH radical 소거능, ABTS radical 소거능, FRAP 및 reducing power), 아질산염 소거능, 피부 섬유아세포에서의 세포 보호 효과 및 ROS 생성억제 효과를 측정하였다. 총 페놀 함량은 녹색 콜라비 착즙액(153.
- 산화적 스트레스 요인에 의한 세포 손상 보호 효과는 XTT assay를 변형하여 측정하였다. 먼저 피부 섬유아세포를 96-well plate에 seeding하고 녹색 및 자색 콜라비 착즙액 동결 건조물을 10-50 μg/mL의 농도로 처리하고 24시간 동안 배양하였다.
- 시료 25 μL와 40 nM fluorescein 150 μL를 black 96-well plate에 첨가한 후, 측정 직전에 peroxy radical 생성제인 150 mM AAPH 25 μL를 첨가하였다.
- DPPH radical 소거능은 Liang 등(17)의 방법을 변형하여 측정하였다. 시료는 녹색 및 자색 콜라비 착즙액 원액(100%)을 증류수를 이용하여 50% 및 10%로 희석하여 사용하였으며, 0.2 mL씩 1.5 mL tube에 취하고 ethanol로 용해한 0.4 mM DPPH 용액 0.8 mL을 첨가하여 혼합한 후 상온에서 10분간 반응하였다. 그리고 microplate reader를 이용하여 490 nm에서 흡광도 값을 측정한 후 다음 식(1)에 대입하여 백분율로 나타내었다.
- 피부 섬유아세포는 실험목적에 따라 96-well plate 및 6- well plate에 각각 1×106 cells/well 농도로 seeding한 후, FBS (10%) 및 P/S (1%)를 함유한 저농도 포도당 DMEM (89%)에서 배양하였다. 이 때, 콜라비 착즙액 동결 건조물의 효과를 관찰하기 위하여 음성대조군에는 아무것도 처리하지 않았으며, 양성 대조군으로는 항산화제인 NAC를 처리하여 비교하였다.
- 콜라비 착즙액 동결건조물의 ROS생성 억제 효과를 평가하기 위하여 H2-DCFDA염색을 통하여 현미경 관찰을 하였다(Fig. 5). Hydrogen peroxide를 처리한 음성 대조군과 콜라비 착즙액 처리 군을 비교하였을 때, 농도 의존적으로 ROS 생성 억제효과를 나타내었다.
- , Seoul, Korea)를 이용하여 착즙하였다. 콜라비 착즙액의 수율은 착즙액 무게에 대한 콜라비 원물의 무게를 백분율로 계산하였다. 피부 섬유아세포 실험에 사용된 콜라비 착즙액은 동결건조기(MCFD8508, Ilshin Lab.
- 표준물질은 gallic acid를 이용하였으며, 표준 검량 곡선(y=17.098x−0.0415, R2=0.9943)으로부터 총 페놀 함량을 계산하였다.
- 피부 섬유아세포는 실험목적에 따라 96-well plate 및 6- well plate에 각각 1×106 cells/well 농도로 seeding한 후, FBS (10%) 및 P/S (1%)를 함유한 저농도 포도당 DMEM (89%)에서 배양하였다.
대상 데이터
- Folin & Ciocalteu’s phenol reagent, gallic acid, sodium carbonate, 1,1-diphenyl-2-picrylhydrazyl (DPPH), sodium phosphate dibasic, 2,2'-azobis(2-methylpropionamidine)dihydrochloride (AAPH), Griess reagent, 6-hydroxy-2,5,7,8,-tetramethylchroman-2-carboxylic aicd (Trolox), sodium nitrite, potassium ferricyanide, potassium persulfate, 2,4,6-tris(2-pyridyl)-s-triazine (TPTZ), acetic acid, trichloroacetic acid (TCA), 2,2'-azino-bis(3-ethylbenzothiazoline-6-sulfonic acid) (ABTS), N-acetyl-L-cysteine (NAC) 및 H2-DCFDA는 Sigma (St. Louis, MO, USA)로부터 구입하였고, Gel/Mount는 Biomeda (Foster City, CA, USA)로부터 구입하였다.
- Potassium phosphate monobasic, fluorescein (sodium salt)는 Junsei Chemical (Tokyo, Japan)에서 구입하여 사용하였고, 피부 섬유아세포 배양에 사용된 Dulbecco’s modified Eagle’s medium (DMEM), fetal bovine serum (FBS), penicillin-streptomycin (P/S), phosphate-buffered saline (PBS) 및 trypsin-EDTA는 Gibco (Gaithersburg, MD, USA)로부터 구입하여 사용하였다.
- 본 연구에 사용된 제주산 녹색 및 자색 콜라비는 2013년 10월 춘천 소재 대형마트에서 구입하여 사용하였다. 콜라비는 잎을 제거하고 비대한 줄기부분은 수세한 후, 가식부만 남도록 과피 부분을 제거하고 착즙기(HU-400, Hurom Co.
- ABTS radical 소거능은 Custdio 등(18)의 방법을 변형하여 측정하였다. 시료는 녹색 및 자색 콜라비 착즙액 원액(100%)을 증류수로 50%, 25%로 희석하여 이용하였다. 7.
- 피부 섬유아세포 실험에 사용된 콜라비 착즙액은 동결건조기(MCFD8508, Ilshin Lab. Co., Seoul, Korea)를 사용하여 완전 건조시켜 분말화하여 −70℃에서 냉동보관하면서 시료로 사용하였다.
- 피부 섬유아세포는 강원대학교 생물공학과 Bioprocess Engineering 실험실로부터 분양받아 본 연구실에서 계대배양하여 사용하였다(22). 피부 섬유아세포는 실험목적에 따라 96-well plate 및 6- well plate에 각각 1×106 cells/well 농도로 seeding한 후, FBS (10%) 및 P/S (1%)를 함유한 저농도 포도당 DMEM (89%)에서 배양하였다.
데이터처리
- a-bMeans in the same column not sharing a common letter are significantly different (p<0.05) by Duncan’s multiple test.
- a-eMeans in the same column not sharing a common letter are significantly different (p<0.05) by Duncan’s multiple test.
- a-fMeans in the same column not sharing a common letter are significantly different (p<0.05) by Duncan’s multiple test.
- 유의성 분석은 ANOVA 검정을 실시하였으며 Duncan의 다중범위 검정법(Duncan’s multiple range test)으로 유의성은 p<0.05 수준에서 검정하였다.
- 총 페놀 함량과 ORAC 지수의 통계적 분석은 Microoffice Excel 2010 (Microsoft Inc., Redmond, WA, USA) t-test를 이용하여 분석하였으며 항산화 활성, 아질산염 소거능, 세포독성 및 세포 보호 효과 결과값의 통계처리는 SAS version 9.2 (SAS institute Inc., Cary, NC, USA)를 이용하여 분석하였다. 유의성 분석은 ANOVA 검정을 실시하였으며 Duncan의 다중범위 검정법(Duncan’s multiple range test)으로 유의성은 p<0.
이론/모형
- Effect of green and purple kohlrabi juice powders on cell viability. Cell viability was measured by XTT assay. Cells were seeded in 96-well plates at a density of 1×106 cells/well in DMEM/ FBS medium and kohlrabi incubated for 24 h prior to treatment at 37℃ in 5% CO2.
- 녹색 및 자색 콜라비 착즙액의 총 페놀 함량은 Duval과 Shetty(15)의 방법을 이용하여 측정하였다. 각 시료 1 mL에 2% follinciocalteau’s phenol regent 1 mL 첨가한 후 10% Na2CO3 용액을 1mL을 첨가하여 혼합한 후 상온에서 1시간 동안 반응시켰다.
- 산화적 스트레스를 측정하기 위해 H2-DCFDA assay를 이용하였다. 피부 섬유아세포를 cover slide가 들어가 있는 6-well plate에 분주하여 24시간 동안 배양한 후, 녹색 및 자색 콜라비 착즙액 동결 건조물을 각각 10-50 μg/mL을 처리한 다음 1 mM hydrogen peroxide를 3시간 동안 처리하여 산화적 스트레스를 유도한 후, 멸균된 PBS (pH 7.
- 피부 섬유아세포에 대한 콜라비 착즙액 동결 건조물의 세포 독성평가는 XTT {2,3-bis(2-methoxy-4-nitro-5-sulfophenyl)-2H-tetrazolium-5-carboxanilide innersalt} assay kit를 이용하여 측정하였다. 세포는 1×106 cells/well 농도로 96-well plate에 seeding하고 24시간 후에 녹색 및 자색 콜라비 착즙액 동결 건조물을 각각 10-25μg/mL을 처리하여 24시간 동안 배양하였다.
성능/효과
- 74 μM TE/mL)보다 더 높게 나타났다. DPPH radical 소거능, ABTS radical 소거능, FRAP 및 reducing power에서는 콜라비 착즙액 10, 50, 100% 농도에서 농도 의존적으로 항산화 활성이 증가하는 경향을 나타내었으며, 같은 농도로 비교하였을 때, 녹색 콜라비 착즙액에서 자색 콜라비 착즙액보다 높은 항산화 활성을 보였다. 아질산염 소거능에서도 녹색 콜라비 착즙액이 자색 콜라비 착즙액보다 높은 효능을 나타내었다.
- Hydrogen peroxide로 산화적 스트레스를 유도한 상태에서 세포 보호 효과를 측정한 결과 10 μg/mL의 농도에서는 녹색 및 자색 콜라비 착즙액에서 hydrogen peroxide를 처리한 군과 차이를 나타내지 않았으나, 25, 50 μg/mL의 농도에서는 농도 유의적으로 세포보효효과가 증가하였다.
- 1(A)에 나타내었다. 녹색 및 자색 콜라비 착즙액을 농도별로 측정한 결과 10, 50% 및 100%의 농도에서 녹색 콜라비 착즙액은 DPPH radical 소거능이 31, 63, 68%순으로 나타났고, 자색 콜라비 착즙액에서는 26, 42, 64%로 농도 의존적으로 DPPH radical 소거능이 상승하는 것으로 나타났다. 이는 총 페놀 함량과 유사한 결과로 페놀성 화합물의 수산기가 전자 공여작용을 함으로써 총 페놀 함량이 높은 녹색 콜라비 착즙액에서 자색 콜라비 착즙액보다 높은 항산화 활성을 나타낸 것으로 판단되어진다.
- ABTS radical 소거능은 시료 내의 항산화 성분에 의하여 potassium persulfate와 ABTS 시약이 반응하여 생성되는 청록색의 ABTS free radical이 탈색되는 원리를 이용하는 방법이다(31). 녹색 및 자색 콜라비 착즙액의 ABTS radical 소거능은 25-100%에서 농도 유의적으로 증가하는 결과(Fig. 1B)를 나타내었으며, 녹색 콜라비 착즙액 100% 농도에서 57%로 가장 높은 항산화 효능을 보였고, 자색 콜라비 착즙액 100% 농도에서는 ABTS radical 소거능이 38%로 나타났다.
- TPTZ)로 환원되는 원리를 이용한 방법이다(32). 녹색 및 자색 콜라비 착즙액의 FRAP은 10-100%에서 농도가 증가함에 따라 유의적으로 증가하는 것으로 나타났다(Fig. 1C). 착즙액 100% 농도에서 비교하였을 때, 녹색 콜라비 착즙액의 경우 흡광도 593 nm에서 O.
- 아질산염은 식육제품 및 수산물의 가공, 저장과정 중에 발색제 및 보존제로 이용되고 있으며, 식품 중에 존재하는 아민류와 반응하여 발암물질인 nitrosoamine을 생성하고 과량 섭취 시 methemoglobin증과 같은 각종 중독증상을 유발한다(35). 녹색 및 자색 콜라비 착즙액의 아질산염 소거능을 측정한 결과 Fig. 2와 같이 녹색 콜라비 착즙액 100%에서 59%로 가장 높게 측정되었고, 자색 콜라비 착즙액에서는 45%로 나타났으며, 농도 유의적으로 아질산염 소거능이 증가하는 경향을 나타내었다. 본 실험에 사용된 pH 1.
- 1D와 같다. 농도별로 녹색 및 자색 콜라비 착즙액의 환원력을 측정한 결과 농도가 높아짐에 따라 활성이 증가하는 경향을 보였으며, 녹색 콜라비 착즙액의 경우 흡광도 655 nm에서 O.D.값이 0.3으로 나타난 반면 자색 콜라비 착즙액은 0.18로 나타났다. 이와 같은 결과는 Carillon 등(34)의 항산화 실험에서 시료의 농도에 따라 항산화 효능이 상승하는 것과 일치하는 결과이다.
- Hydrogen peroxide로 산화적 스트레스를 유도한 상태에서 세포 보호 효과를 측정한 결과 10 μg/mL의 농도에서는 녹색 및 자색 콜라비 착즙액에서 hydrogen peroxide를 처리한 군과 차이를 나타내지 않았으나, 25, 50 μg/mL의 농도에서는 농도 유의적으로 세포보효효과가 증가하였다. 또한 녹색 콜라비 착즙액에서는 양성대조군으로 사용한 항산화 물질인 NAC 수준까지 세포생존율이 증가하였다. H2-DCFDA 염색을 통하여 관찰한 ROS 생성 억제 효과는 세포 보호 효과와 유사한 경향으로 관찰되었다.
- 2와 같이 녹색 콜라비 착즙액 100%에서 59%로 가장 높게 측정되었고, 자색 콜라비 착즙액에서는 45%로 나타났으며, 농도 유의적으로 아질산염 소거능이 증가하는 경향을 나타내었다. 본 실험에 사용된 pH 1.2 조건은 인체의 위내 pH 조건과 유사한 것으로 녹색 콜라비 착즙액이 생체 내에서도 우수한 아질산염 소거작용을 통하여 nitrosoamine의 생성을 억제할 것으로 사료된다.
- H2-DCFDA 염색을 통하여 관찰한 ROS 생성 억제 효과는 세포 보호 효과와 유사한 경향으로 관찰되었다. 이상의 결과를 종합하여 볼 때 녹색 및 자색 콜라비 착즙액이 다양한 항산화 모델에서 효능을 나타내었으며, 피부 섬유아세포에서 세포 보호 효과 및 ROS 생성 억제효과가 관찰되어 기능성 식품원료로서의 활용도가 매우 넓을 것으로 판단된다.
- 이와 같은 결과는 Bae 등(38)의 연구에서 차가버섯을 처리한 군에서 농도 의존적으로 세포 보호 효과가 증가하였으며, ROS 생성 억제 효과도 증가하는 것과 일치하는 결과이다. 이상의 결과에 의해 콜라비 착즙액의 다양한 항산화 활성 및 아질산염 소거능에서 효능을 나타내고 있으며, 피부 섬유아세포에서 세포 보호 효과 및 ROS 생성 억제 효과가 우수함을 확인하였다. 따라서 콜라비 착즙액은 산화적 스트레스에 대한 세포 손상의 보호제 및 천연 항산화제로서 응용가능성이 있다고 사료되며, 향후 추가적인 항산화 작용기전 연구를 통하여 식품이나 의약품, 화장품 등 다양한 분야에서 활용가능성이 기대된다.
- 총 페놀 함량은 녹색 콜라비 착즙액(153.74 mg GAE/mL)에서 자색 콜라비 착즙액(122.55 mg GAE/mL)보다 더 높게 나타난 반면, ORAC 지수의 경우 자색 콜라비 착즙액(664.32 μM TE/mL)에서 녹색 콜라비 착즙액(572.74 μM TE/mL)보다 더 높게 나타났다.
- 콜라비 착즙액이 피부 섬유아세포의 세포독성에 미치는 영향을 알아보기 위하여 녹색 및 자색의 콜라비 착즙액을 농도별로 처리하고 XTT assay 방법으로 세포의 생존율을 측정한 결과(Fig. 3), 10-50 μg/mL에서 독성을 나타내지 않았다.
- 특히 녹색 콜라비 착즙액 50μg/mL의 농도에서 양성대조군인 NAC 5 mM 수준까지 세포를 보호하는 효과를 나타내었으며, 자색 콜라비 착즙액 50 μg/mL에서도 세포 생존율이 70% 정도로 생존율이 증가하는 경향을 나타내었다.
- 4와 같다. 피부 섬유아세포는 1 mM hydrogen peroxide를 처리함으로써 처리하지 않은 군보다 유의적으로 50% 정도로 생존율이 감소한 반면, 콜라비 착즙액 전처리 군에서는 농도 의존적으로 산화적 스트레스 영향에 반하여 세포 생존율이 다시 증가함을 확인하였다. 특히 녹색 콜라비 착즙액 50μg/mL의 농도에서 양성대조군인 NAC 5 mM 수준까지 세포를 보호하는 효과를 나타내었으며, 자색 콜라비 착즙액 50 μg/mL에서도 세포 생존율이 70% 정도로 생존율이 증가하는 경향을 나타내었다.
후속연구
- 이상의 결과에 의해 콜라비 착즙액의 다양한 항산화 활성 및 아질산염 소거능에서 효능을 나타내고 있으며, 피부 섬유아세포에서 세포 보호 효과 및 ROS 생성 억제 효과가 우수함을 확인하였다. 따라서 콜라비 착즙액은 산화적 스트레스에 대한 세포 손상의 보호제 및 천연 항산화제로서 응용가능성이 있다고 사료되며, 향후 추가적인 항산화 작용기전 연구를 통하여 식품이나 의약품, 화장품 등 다양한 분야에서 활용가능성이 기대된다.
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