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문제 정의
- 본 연구에서는 미세조류의 유용물질 생산을 위한 균주 개량을 위해 C. vulgaris에 화학적 돌연변이원인 EMS를 처리하여 돌연변이를 유도하고 변이주를 선별한 후 분리 및 배양하고 확보된 변이주의 특성을 분석하였다.
제안 방법
- C. vulgaris의 광합성 색소 함량을 분석하기 위하여 27일 동안 배양한 미세조류 균주의 클로로필, 카로티노이드 함량을 분석하였다. 색소의 추출은 세포의 색소를 methanol로 용출시킨 후 분광 광도계(Optizen 2120 UV/Visible Spectrophotometer, Mecacys, Korea)를 이용하여 650 nm, 665 nm에서 흡광도를 측정하여 클로로필 함량을 측정 하였고, 카로티노이드 함량은 461, 664 nm에서 흡광도를 측정하였다[22].
- 세포 성장은 분광 광도계(Optizen 2120 UV/Visible Spectrophotometer, Mecacys, Korea)를 이용하여 680 nm에서 흡광도를 측정하였다. 건조 균체량(dry cell weight, DCW)은 항량된 종이필터(Whatman)를 이용하여 세포 배양액 10 mL을 여과한 뒤, 여과된 균체를 드라이 오븐에서 105 ℃로 3 h 동안 건조시켜 그 무게를 측정하였다.
- 본 연구에서는 미세조류 C. vulgaris에 화학적 돌연변이원인 EMS를 처리하여 돌연변이를 유도하였고, 유용성분이 증대된 변이주 E14, E24를 확보하였다. EMS 처리에 의한 변이주의 생장 패턴은 WT와 유사하였고 세포건조중량은 WT는 2.
- vulgaris의 광합성 색소 함량을 분석하기 위하여 27일 동안 배양한 미세조류 균주의 클로로필, 카로티노이드 함량을 분석하였다. 색소의 추출은 세포의 색소를 methanol로 용출시킨 후 분광 광도계(Optizen 2120 UV/Visible Spectrophotometer, Mecacys, Korea)를 이용하여 650 nm, 665 nm에서 흡광도를 측정하여 클로로필 함량을 측정 하였고, 카로티노이드 함량은 461, 664 nm에서 흡광도를 측정하였다[22]. 각 색소의 양은 다음과 같은 식으로 계산하였다.
- 세포 배양 27일 차에 세포 내 클로로필 및 카로티노이드 함량을 측정하였다. EMS를 처리한 돌연변이주 E14, E24의 세포건조중량당 클로로필 함량(chlorophyll/DCW)으로 나타내보면, WT에 비해 E14는 99%, E24는 52% 증가하였다(Figure 2).
- 세포 성장은 분광 광도계(Optizen 2120 UV/Visible Spectrophotometer, Mecacys, Korea)를 이용하여 680 nm에서 흡광도를 측정하였다. 건조 균체량(dry cell weight, DCW)은 항량된 종이필터(Whatman)를 이용하여 세포 배양액 10 mL을 여과한 뒤, 여과된 균체를 드라이 오븐에서 105 ℃로 3 h 동안 건조시켜 그 무게를 측정하였다.
- 야생균주(WT)와 E14, E24를 3일 간격으로 흡광도를 이용하여 27일간 세포생장을 관찰하였다(Figure 1
- 인산 완충액으로 2회 세척하고, 새로운 F/2 배지를 넣은 다음 EMS (Sigma, USA)를 0.05, 0.5, 1 µM 농도로 처리하여 1 h 동안 정상 조건에서 암배양하였다.
대상 데이터
- 돌연변이주의 선별을 위해 F/2 고체배지에 EMS를 처리한 C. vulgaris 세포를 도말하였다. 생존율이 낮을수록 돌연변이의 확률이 높으므로 비교적 EMS 농도가 높은 1 µM 농도로 처리하여 얻은 변이주 2종에 대해 E14, E24로 명명하였다.
- 본 연구에 사용된 미세조류는 녹조류인 Chlorella vulgaris (C. vulgaris)로, 한국해양미세조류은행에서 분양받아 사용하였다. F/2 배지는 1 L의 인공해수에 NaNO3 150 mg, NaH2PO4⋅9H2O 8.
이론/모형
- C. vulgaris 세포를 27일간 배양하여 Chen 등[23]의 방법으로 세포 내 지질함량을 측정하였다. 미세조류의 세포벽은 단단하기 때문에 효과적인 염색을 위해 흡광도(680 nm)를 0.
- 형광값(fluorescence intensity)은 미세조류 자체의 형광값(autoflorescence)을 뺀 값으로 나타내었다. Choi 등[24]의 방법을 이용하여 세포 내 중성 지질 함량 정량을 측정하였다.
성능/효과
- 27일간 배양한 C. vulgaris의 WT와 변이주의 총 지질 함량을 측정한 결과 E14는 WT에 비해 12% 감소하였고, E24는 약 23% 증가된 것으로 측정되었다(Figure 4
- 73 g/L로 나타났다. E14, E24의 세포건조중량당 클로로필 함량은 WT에 비해 각각 99, 52% 증가하였고, 세포건조중량당 카로티노이드 함량은 E14는 7% 증가, E24는 약 5% 감소하였다. 지질 함량의 경우 WT에 비해 E14는 12% 감소하였으나, E24의 경우 23% 증가하였다.
- 야생균주(WT)와 E14, E24를 3일 간격으로 흡광도를 이용하여 27일간 세포생장을 관찰하였다(Figure 1(a)). 관찰 결과 세포 생장률은 WT, E14, E24 순으로 나타났지만 WT와 큰 차이를 보이지 않았다. 또한 세포건조중량을 측정한 결과 WT는 2.
- 세포건조중량당 지질 함량(lipid/DCW)으로 나타내보면 WT에 비해 E24는 약 5% 증가하였고, E14는 WT의 지질 함량에 비해 82%의 값을 나타내어 총 지질 함량 결과와 동일하게 나타내었다(Figure 4
- 지질 함량의 경우 WT에 비해 E14는 12% 감소하였으나, E24의 경우 23% 증가하였다. 이 결과 EMS에 의해 유도된 C. vulgaris 돌연변이주 E14, E24의 경우 세포 성장에 큰 영향을 미치지 않으며 높은 색소 함량이 나타내어 높았다.
후속연구
- 이를 토대로 볼 때 미세조류는 영양분 고갈과 같은 환경적 스트레스가 발생하였을 경우 세포 내 지질 축적 대사의 변화로 인해 지질 함유량이 증가한다. 하지만, 변이주 E24의 경우 WT와 비교했을 때 세포 생장은 유사함에도 불구하고 지질 함량은 증가하여 산업적 소재로 이용될 수 있을 것으로 예상된다.
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