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문제 정의
- 본 연구에서는 진피의 활용도를 높이기 위한 연구의 일환으로 유기용매별에 따른 생리활성물질의 용출량을 측정하기 위해, 진피와 에탄올 진피 추출물을 대상으로 유기용매인 에틸 아세테이트, 아세톤, 염화 메틸렌, 메탄올을 이용하여 추출한 시료를 대상으로 총 폴리페놀 함량, 전자공여능, glutathione S-transferase(GST)의 활성 저해력을 측정한 결과는 다음과 같다.
- 본 연구에서는 진피의 활용도를 높이기 위한 연구의 일환으로 유기용매별에 따른 생리활성물질의 용출량을 측정하기위해 진피와 에탄올로 추출한 진피 추출물을 대상으로 유기용매인 에틸 아세테이트, 아세톤, 염화 메틸렌, 메탄올을 이용하여 추출한 시료를 대상으로 총 폴리페놀 함량, 전자공여능, glutathione S-transferase(GST)의 활성 저해력을 측정하였다.
제안 방법
- DPPH는 free radical에 대한 시료의 항산화 활성을 평가하기 위하여 Kim 등(2002)의 방법을 응용하여 측정하였다. 95% 에탄올에 용해시킨 0.
- Gallic acid의 검량선으로부터 총 폴리페놀 함량을 gallic acid equivalents(GAE μg/mL extract)로 환산하였다.
- 추출한 여액은 여과를 한 후에 감압하에 농축을 하여 얻어진 용액은 더 이상의 농축 없이 총 폴리페놀 함량 측정과 전자공여능, glutathione S-transferase(GST)의 활성 저해력 실험에 사용하였다. 또한 에탄올 진피 추출물에서의 유기용매별 추출도 위와 같은 방법으로 시료를 만들어서 총 폴리페놀 함량 측정과 전자공여능, glutathione S-transferase(GST)의 활성 저해력 실험에 사용하였다.
- 본 실험은 60℃에서 24시간 동안 열풍 건조하여 분말화한 진피 10 g을 100 mL의 80% 에탄올을 이용하여 60℃에서 3시간 동안 추출하고, filter paper(Whatman No. 3)로 이용하여 2회 여과한 후 진피 추출물은 50℃에서 농축을 하고, 동결건조기(PVTFA 10AT, Inshin, Korea)를 사용하여 동결건조 후 분말화하였다.
- 잘 혼합된 용액에 20 μL의 50 mM CDNB를 넣고 강하게 혼합시킨 후에 340 nm에서 UV/VIS spectrophotometer를 이용해서 1분 동안의 흡광도 변화를 측정하여 기본 포합반응으로 하였다.
- 진피를 각각 100 g씩 500 mL beaker에 넣고 극성을 달리하는 유기용매인 ethyl acetate, acetone, methylene chloride, methanol 용액 400 mL를 넣은 후에 파라필름으로 밀봉을 한 상태에서 각각 37℃ 항온수조에서 72시간 교반하여 유용한 성분을 추출하였다. 추출한 여액은 여과를 한 후에 감압하에 농축을 하여 얻어진 용액은 더 이상의 농축 없이 총 폴리페놀 함량 측정과 전자공여능, glutathione S-transferase(GST)의 활성 저해력 실험에 사용하였다.
- 포합 반응에 대한 초기 속도 측정에는 1,2-dichloro-4-nitro- benzene(DCNB)를 사용하였다. 측정 방법은 적정 용매와 기질, 글루타티온(GSH) 효소를 혼합한 뒤 340 nm에서 UV/VIS spectrophotometer를 이용해서 1 분 동안의 흡광도 변화를 측정하였다. 효소 활성 단위는 1 분당 1 μmol의 생성물 형성을 촉매하는 효소의 양으로 정의하였다.
대상 데이터
- 추출에 사용된 시약들은 Duksan Pure Chemical Co.(Gyeong- gi, Korea) 제품으로 99.5% 순도로 더 이상의 정제 없이 실험에 사용하였다.
- 본 실험에 사용된 진피는 2014년 5월에 제주특별자치도 E농장에서 재배된 것을 제공 받아 사용하였다. －70℃에서 동결건조(Freeze dryer MCFD8508, Ilshin Lab Co.
데이터처리
- 모든 자료의 통계처리는 SPSS(version 21)를 이용하여 평균과 표준편차로 나타내었고, 각 처리군 간의 유의성에 대한 검증은 분산분석(one-way ANOVA)을 이용하여 분석하였으며, 실험군 간의 유의성은 Duncan multiple range test로 p<0.05 수준에서 유의성을 검증하였다.
이론/모형
- 그리고 효소의 최적 pH와 최적 온도는 각각 9.0과 55℃인 것으로 나타났고(Cho & Kong 2005), GST 효소 활성저해와 관련한 실험 조건은 Cho HY(2007)가 밝힌 기질 농도의 영향, pH 영향, 온도의 영향 등을 참조하였다.
- 총 페놀 함량은 Singleton 등(1999)의 Folin-Ciocalteu 방법에 준하여 측정하였다. 추출물 10 μL, 증류수 600 μL, 2 N Folin-Ciocalteu 시약 50 μL를 vortex로 혼합하였다.
성능/효과
- 1. 총 폴리페놀 함량은 ethyl acetate인 경우 진피는 928.48±1.19 μg GAE/mL, 에탄올 추출 진피는 664.64±0.74 μg GAE/mL로, acetone인 경우 진피는 886.03±0.44 μg GAE/mL, 에탄올 추출 진피는 702.67±0.85 μg GAE/mL로, methylene chloride인 경우 진피는 413.08±1.39 μg GAE/mL, 에탄올 추출 진피는 429.64±0.61 μg GAE/mL로, methanol인 경우 진피는 12,648.60±0.56 μg GAE/mL, 에탄올 추출 진피는 16,108.20±0.73 μg GAE/ mL로 나타나, 진피나 에탄올 추출 진피는 모두 methanol로 추출한 것이 상대적으로 높게 나타났으며, 총 폴리페놀의 함량 차이는 유기용매별 통계적으로 유의한 차이가 나타났다(p<0.05).
- 2. 전자공여능은 ethyl acetate인 경우 진피는 62.80%, 에탄올 추출 진피는 51.49%로 나타났으며, acetone인 경우 진피는 97.43%, 에탄올 추출 진피는 63.17%로 나타났으며, methylene chloride인 경우 진피는 52.20%, 에탄올 추출 진피는 67.68% 로 나타났으며, methanol인 경우 진피는 97.63%, 에탄올 추출 진피는 96.18%로 나타났다. Electron donating ability(EDA)는 유기용매 중 메탄올로 추출하였을 때가 상대적으로 가장 높게 나타났으며, 유기용매별로 통계적으로 유의한 차이가 나타났다(p<0.
- 3. Glutathione S-transferase(GST)에 대한 활성 저해능은 ethyl acetate인 경우 진피는 76.22%, 에탄올 추출 진피는 75.54%로 나타났으며, methylene chloride인 경우 진피는 31.73%, 에탄올 추출 진피는 73.53%로 나타났으며, methanol인 경우 진피 는 97.48%, 에탄올 추출 진피는 48.70%로 나타났다. Glutathione S-transferase(GST)에 대한 활성 저해능은 진피인 경우 유기용매 중 메탄올로 추출하였을 때가 가장 높게 나타났고, 에탄올 추출 진피인 경우는 에탄올과 methylene chloride로 추출할 때가 높게 나타났으며, 유기용매별로 통계적으로 유의한 것으로 나타났다(p<0.
- Electron donating ability(EDA)는 유기용매 중 메탄올로 추출하였을 때가 상대적으로 가장 높게 나타났으며, 유기용매별로 통계적으로 유의한 차이가 나타났다(p<0.05).
- 70%로 나타났다. Glutathione S-transferase(GST)에 대한 활성 저해능은 진피인 경우 유기용매 중 메탄올로 추출하였을 때가 가장 높게 나타났고, 에탄올 추출 진피인 경우는 에탄올과 methylene chloride로 추출할 때가 높게 나타났으며, 유기용매별로 통계적으로 유의한 것으로 나타났다(p<0.05).
- Glutathione S-transferase(GST)에 대한 활성 저해능은 진피인 경우, 유기용매 중 메탄올로 추출하였을 때가 가장 높게 나타났으며, 에탄올 추출 진피인 경우는 에탄올과 methylene chloride로 추출할 때가 높게 나타나, 유기용매별로 통계적으로 유의한 것으로 나타났다(p<0.05).
- Table 2에서 보는 바와 같이 총 폴리페놀 함량은 ethyl acetate인 경우 진피는 928.48±1.19 μg GAE/mL, 에탄올 추출 진피는 664.64±0.74 μg GAE/mL로, acetone인 경우 진피는 886.03±0.44 μg GAE/mL, 에탄올 추출 진피는 702.67±0.85 μg GAE/mL로, methylene chloride인 경우 진피는 413.08±1.39 μg GAE/mL, 에탄올 추출 진피는 429.64±0.61 μg GAE/mL로, methanol인 경우 진피는 12,648.60±0.56 μg GAE/mL, 에탄올 추출 진피는 16,108.20±0.73 μg GAE/mL로 나타나, 진피나 에탄올 추출 진피는 모두 methanol로 추출한 것이 상대적으로 높게 나타났으며, 총 폴리페놀의 함량 차이는 유기용 매별 통계적으로 유의한 차이가 나타났다(p<0.05).
- 유기용매별 진피 추출물의 electron donating ability(EDA)는 Table 3에 나타내었다. Table 3에서 보는 바와 같이 전자공여능은 ethyl acetate인 경우 진피는 62.80%, 에탄올 추출 진피는 51.49%로 나타났으며, acetone인 경우 진피는 97.43%, 에탄올 추출 진피는 63.17%로 나타났고, methylene chloride인 경우 진피는 52.20%, 에탄올 추출 진피는 67.68%, methanol인 경우 진피는 97.63%, 에탄올 추출 진피는 96.18%로 나타났다. Electron donating ability(EDA)는 유기용매 중 메탄올로 추출하였을 때가 상대적으로 가장 높게 나타났으며, 유기용매별로 통계적으로 유의한 차이가 나타났다(p<0.
- 유기용매별 진피 추출물의 glutathione S-transferase(GST)에 대한 활성 저해능 결과는 Table 4에 나타내었다. Table 4에서 보는 바와 같이 glutathione S-transferase(GST)에 대한 활성 저해능은 ethyl acetate인 경우 진피는 76.22%, 에탄올 추출 진피는 75.54%로 나타났고, methylene chloride인 경우 진피는 31.73%, 에탄올 추출 진피는 73.53%로 나타났으며, methanol인 경우 진피는 97.48%, 에탄올 추출 진피는 48.70%로 나타났다. Glutathione S-transferase(GST)에 대한 활성 저해능은 진피인 경우, 유기용매 중 메탄올로 추출하였을 때가 가장 높게 나타났으며, 에탄올 추출 진피인 경우는 에탄올과 methylene chloride로 추출할 때가 높게 나타나, 유기용매별로 통계적으로 유의한 것으로 나타났다(p<0.
- 또한 Fahl 등(1993)은 배양시킨 mammalian cell에서 GST 분자종들을 발현시켰더니 항암제인 chlorambutil, melphalan, cisplatin에 의한 내성이 크게 강화되었다고 보고하였다. 이러한 결과들은 mammalian cell에서 특정 GST 분자종들의 과다한 발현은 암 화학요법에서 사용되고 있는 alkyating agents에 의한 생물학적 내성을 유발시킬 수 있다는 것을 의미한다. 따라서 특정 GST 저해는 항암제, 특히 알킬화제의 효율을 높이는 방안으로 기대할 수 있다.
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