이미경
(Korea Promotion Institute for Traditional Medicine Industry)
,
김동희
(Korea Promotion Institute for Traditional Medicine Industry)
,
박태순
(Korea Promotion Institute for Traditional Medicine Industry)
,
손준호
(Korea Promotion Institute for Traditional Medicine Industry)
본 연구에서는 만형자 분획물의 항산화 및 주름개선 효과에 대하여 알아보고자 하였다. 만형자 ethyl acetate 분획물은 DPPH, ABTS에서 우수한 항산화 활성을 나타내었으며, 주름개선 효과를 검증하기 위하여 elastase 저해활성을 측정한 결과 $1,000{\mu}g/mL$에서 74% 저해활성을 나타내었다. 만형자 ethyl acetate 분획물의 세포생존율을 확인하기 위하여 섬유아세포로 MTT assay에 의해 확인 한 결과 5, 10, 15, 20, $25{\mu}g/mL$의 농도구간에서 100%에 가까운 세포 생존율을 확인하였다. 만형자 ethyl acetate 분획물의 MMP-1 저해활성을 측정 한 결과 $25{\mu}g/mL$에서 14%의 저해효과를 나타내었으며, 만형자 ethyl acetate 분획물의 MMP-1의 단백질 발현 억제 효과를 확인한 결과 $25{\mu}g/mL$의 농도에서 50% 감소하였다. 이러한 결과로 보아 만형자 ethyl acetate 분획물의 주름개선 효과를 확인할 수 있으며, 천연 기능성 화장품 소재로서의 가능성을 확인하였다.
본 연구에서는 만형자 분획물의 항산화 및 주름개선 효과에 대하여 알아보고자 하였다. 만형자 ethyl acetate 분획물은 DPPH, ABTS에서 우수한 항산화 활성을 나타내었으며, 주름개선 효과를 검증하기 위하여 elastase 저해활성을 측정한 결과 $1,000{\mu}g/mL$에서 74% 저해활성을 나타내었다. 만형자 ethyl acetate 분획물의 세포생존율을 확인하기 위하여 섬유아세포로 MTT assay에 의해 확인 한 결과 5, 10, 15, 20, $25{\mu}g/mL$의 농도구간에서 100%에 가까운 세포 생존율을 확인하였다. 만형자 ethyl acetate 분획물의 MMP-1 저해활성을 측정 한 결과 $25{\mu}g/mL$에서 14%의 저해효과를 나타내었으며, 만형자 ethyl acetate 분획물의 MMP-1의 단백질 발현 억제 효과를 확인한 결과 $25{\mu}g/mL$의 농도에서 50% 감소하였다. 이러한 결과로 보아 만형자 ethyl acetate 분획물의 주름개선 효과를 확인할 수 있으며, 천연 기능성 화장품 소재로서의 가능성을 확인하였다.
In this study, the antioxidant and anti-wrinkling effects of fraction from Vitex trifolia L. were investigated. Among the fractions, ethyl acetate fraction showed the highest antioxidant activities in 1-1-diphenyl-2-picryl-hydrazyl, 2,2'-azino-bis(3-ethylbenzothiazoine-6-sulfonic acid) radical scave...
In this study, the antioxidant and anti-wrinkling effects of fraction from Vitex trifolia L. were investigated. Among the fractions, ethyl acetate fraction showed the highest antioxidant activities in 1-1-diphenyl-2-picryl-hydrazyl, 2,2'-azino-bis(3-ethylbenzothiazoine-6-sulfonic acid) radical scavenging and elastase inhibition with 76, 89, and 74%, respectively, at a concentration of $1,000{\mu}g/mL$. This fraction, at the concentration of $25{\mu}g/mL$, inhibited 70% fibroblast cell viability and 86% the matrix metalloprotease (MMP)-1. In addition, the results from Western blot assay showed that this fraction ($25{\mu}g/mL$) expressed the MMP-1 protein level by decreasing 50%. The findings suggest that the ethyl acetate fraction from V. trifolia has great potential as a cosmeceutical ingredient with antioxidant and anti-wrinkling effects.
In this study, the antioxidant and anti-wrinkling effects of fraction from Vitex trifolia L. were investigated. Among the fractions, ethyl acetate fraction showed the highest antioxidant activities in 1-1-diphenyl-2-picryl-hydrazyl, 2,2'-azino-bis(3-ethylbenzothiazoine-6-sulfonic acid) radical scavenging and elastase inhibition with 76, 89, and 74%, respectively, at a concentration of $1,000{\mu}g/mL$. This fraction, at the concentration of $25{\mu}g/mL$, inhibited 70% fibroblast cell viability and 86% the matrix metalloprotease (MMP)-1. In addition, the results from Western blot assay showed that this fraction ($25{\mu}g/mL$) expressed the MMP-1 protein level by decreasing 50%. The findings suggest that the ethyl acetate fraction from V. trifolia has great potential as a cosmeceutical ingredient with antioxidant and anti-wrinkling effects.
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문제 정의
만형자에 관한 연구로는 monoterpene류를 포함한 약 76종의 정유성분과 골수성 백혈병 저해효과를 나타내는 flavonoids와 식물생장을 조절하는 phenol 화합물 등이 분리 동정된 바 있다(Kang과 Kim, 1994; Ono 등, 2000; Xin 등, 2006). 따라서 본 연구에서는 만형자 추출물의 피부노화를 억제시키는 항산화 효과와 피부탄력 및 주름 개선에 관련된 콜라겐 생합성 촉진 및 분해억제효능을 평가하여 기능성 화장품 원료로서의 사용 가능성을 살펴보고자 하였다.
본 연구에서는 MMPs family중 MMP-1의 단백질 발현을 보기 위하여 MMP-1의 단백질 발현을 만형자 ethylacetate 분획물 처리군에서 MMP-1의 protein 발현 모두 5, 10, 25 µg/mL의 농도 의존적으로 억제 되는 것을 확인하였다(Fig. 6).
제안 방법
ABTS radical scavenging activity 측정. ABTS radical scavenging을 이용한 항산화력 측정은 ABTS radical scavenging (Re 등, 1999)에 의하여 측정하였다.
DPPH radical scavenging ability 측정. DPPH radical scavenging에 대한 실험은 Blois의 방법(Blois, 1958)을 변형하여 96 well plate에 맞게 수정하여 측정하였다.
DPPH radical scavenging ability 측정. DPPH radical scavenging에 대한 실험은 Blois의 방법(Blois, 1958)을 변형하여 96 well plate에 맞게 수정하여 측정하였다. 각 시료용액 100 µL에 0.
분리된 단백질은 PVDF membrane에 옮긴 다음 실온에서 1시간 blocking buffer (5% skim milk in TBST)에서 incubation시켰다. MMP-1 각각의 1차 항체를 1:1000으로 희석하여 4℃에서 over night한 다음, 다시 10분 간격으로 TBST로 3회 washing하고 mouse anti-rabbit IgG HRP의 각각의 2차 항체를 1:1,000로 희석하여 실온에서 1시간 동안 붙이고, 3회 washing한 뒤 LAS 4,000 image analyzer (Fugifilm life science, Japan) 기기를 이용하여 밴드확인 및 정량하였다.
Elastase 저해활성 측정은 Cannell의 방법(Cannell 등, 1998)에 따라 측정하였다. 기질로서 n-succinyl-(L-Ala)3-p-nitroanilide를 사용하여 37℃에서 30분간 기질로부터 생성되는 p-nitroanilide의 생성량을 445 nm에서 측정하였다. 각 시료용액을 일정 농도가 되도록 조제하여 40 µL씩 96 well plate에 취하고, 50 mM tris-HCl buffer (pH 8.
따라서 본 실험에서는 섬유아세포에 만형자 분획물 5, 10, 25 µg/mL의 농도로 처리하여 MMP-1 저해활성 측정과 단백질 발현 실험을 하였다.
만형자 n-hexane, ethyl acetate, butanol, water 분획물을 농도별로 48시간 처리한 결과 ethyl acetate 분획물 5, 10, 15, 20, 25 µg/mL 농도구간에서 100%에 가까운 세포 생존율을 확인 하였다.
Fibroblast cell (CCD-986sk)의 생존율 확인. 섬유아세포에서 만형자 분획물의 처리가 세포 증식에 미치는 영향을 확인하기 위하여 MTT assay를 이용한 세포 생존율을 측정하였다(Fig. 4). 만형자 n-hexane, ethyl acetate, butanol, water 분획물을 농도별로 48시간 처리한 결과 ethyl acetate 분획물 5, 10, 15, 20, 25 µg/mL 농도구간에서 100%에 가까운 세포 생존율을 확인 하였다.
세포를 96 well plate에 5×103 cells/well이 되게 180 µL씩 분주하고, PBS을 첨가한 다음 자외선을 조사하고 시료를 농도 별로 20 µL 처리한 후 37℃, 5% CO2 incubator에서 48시간 배양 하였다.
24 g을 얻었다. 이후 용매추출법(solvent extraction method)을 이용하여 극성도가 낮은 n-hexane으로 추출한 후, 다시 ethyl acetate와 butanol용매로 순차적으로 추출하였다. 각 용매 추출 분획을 감압 농축하여 n-hexane 가용분획(약 0.
이후, 배양된 배지를 제거하고 PBS을 첨가한 다음 자외선을 조사하고 이때 MMP-1의 활성을 높이기 위하여 TNF-α를 10 ng/mL의 농도로 첨가하고 시료를 농도 별로 처리한 후 48시간을 배양하였다.
대상 데이터
7 mM 2,2'-azino-bis(3-ethylbenzothiazoline-6-sulfonic acid)와 2.45 mM potassium persulfate를 혼합하여 실온에서 24시간 동안 방치하여 ABTS를 형성시킨 후 ethanol로 희석하여 사용하였다.
실험재료. 본 실험에 사용한 만형자(Vitex trifolia L.)는 2014년 2월 초순에 (주)휴먼허브(Korea)에서 구입하여 실험 재료로 사용하였다.
(USA)에서 구입하였으며, hemacytometer (Marienfeld, Germany), MMP-1 primary antibody와 secondary antibody는 santacruz (USA)에서 구입하였다. 본 실험에 이용한 각 세포의 배양은 10% FBS과 1% penicillin/streptomycin (100 U/mL)을 첨가한 DMEM 배지를 사용하였으며, 37℃, 5% CO2 incubator에 적응시켜 배양하였다.
세포주 배양. 본 실험에서 사용한 섬유아세포 CCD-986sk 세포는 ATCC에서 구입하여 사용하였다. 세포 독성 측정 및 배양을 위해 dulbecco’s modified eagle medium (DMEM), fetal bovine serum (FBS), phosphate buffer solution (PBS), penicillin/streptomycin, 0.
세포 독성 측정 및 배양을 위해 dulbecco’s modified eagle medium (DMEM), fetal bovine serum (FBS), phosphate buffer solution (PBS), penicillin/streptomycin, 0.4% trypan blue stain은 Gibco BRL Co. (USA)에서 구입하였으며, hemacytometer (Marienfeld, Germany), MMP-1 primary antibody와 secondary antibody는 santacruz (USA)에서 구입하였다.
실험에 사용된 시약. 추출 및 용매 분획에 사용한 ethyl alcohol(EtOH), n-hexane, ethyl acetate (EtOAc), methanol (MeOH),n-butanol (n-BuOH) 등의 용매는 국내 덕산(18 L, 공업용, Korea)제품을 사용하였다. 항산화능 측정 실험과 주름억제 효과 측정에 사용된 시약인 1-1-diphenyl-2-picryl-hydrazyl (DPPH), 2,2'-azinobis(3 ethylbenzothiazoline-6-sulfonic acid) (ABTS), potassium persulfate, porcine pancreas elastase, n-succinyl-(L-Ala)3p-nitroanilide, collagenase, 3-(4,5-dimethylthiazol-2-yl) 2,5-diphenyltetrazliumbromide (MTT) 등은 Sigma-Aldrich (USA)에서 구입하여 사용하였으며, MMP-1 활성을 측정하기 위하여 MMP-1 kit (Amersham Bioscience, USA), tumor necrosis factor-α (TNF-α)는 Sigma-Aldrich에서 구입하여 사용하였다.
항산화능 측정 실험과 주름억제 효과 측정에 사용된 시약인 1-1-diphenyl-2-picryl-hydrazyl (DPPH), 2,2'-azinobis(3 ethylbenzothiazoline-6-sulfonic acid) (ABTS), potassium persulfate, porcine pancreas elastase, n-succinyl-(L-Ala)3p-nitroanilide, collagenase, 3-(4,5-dimethylthiazol-2-yl) 2,5-diphenyltetrazliumbromide (MTT) 등은 Sigma-Aldrich (USA)에서 구입하여 사용하였으며, MMP-1 활성을 측정하기 위하여 MMP-1 kit (Amersham Bioscience, USA), tumor necrosis factor-α (TNF-α)는 Sigma-Aldrich에서 구입하여 사용하였다.
데이터처리
결과 통계처리는 SPSS 10.0을 사용하였으며, 유의차 검증은 분산분석(ANOVA: analysis of variance) 프로그램을 이용하여 t-test를 이용하여 통계적 유의수준 p <0.05에서 검증하였다.
이론/모형
ABTS radical scavenging activity 측정. ABTS radical scavenging을 이용한 항산화력 측정은 ABTS radical scavenging (Re 등, 1999)에 의하여 측정하였다.
Elastase 저해활성 측정. Elastase 저해활성 측정은 Cannell의 방법(Cannell 등, 1998)에 따라 측정하였다. 기질로서 n-succinyl-(L-Ala)3-p-nitroanilide를 사용하여 37℃에서 30분간 기질로부터 생성되는 p-nitroanilide의 생성량을 445 nm에서 측정하였다.
이후, 배양된 배지를 제거하고 PBS을 첨가한 다음 자외선을 조사하고 이때 MMP-1의 활성을 높이기 위하여 TNF-α를 10 ng/mL의 농도로 첨가하고 시료를 농도 별로 처리한 후 48시간을 배양하였다. 세포의 배양액을 수거하여 실험에 사용하였으며 Gross B.E. 등의 방법(Gross와 Lapiere, 1962)에 따라 MMP-1 biotrack activity assay kit (Amersham Bioscience, USA)을 이용하여 측정하였다.
성능/효과
C)에서는 1000 µg/mL에서 95%의 전자공여능을 나타내었다. 만형자 ethyl acetate 분획물에서 DPPH free radical 소거율이 높게 나타나는 것을 확인할 수 있었다.
동일 농도 대조군인 EGCG (Epigallocatechin-3-gallate)와 비교시 같은 농도에서 elastase 저해활성이 62% 나타내었다. 만형자 ethyl acetate 분획물이 대조군인 EGCG보다 elastase 저해활성이 더욱 우수하는 것을 확인 할 수 있었다.
C에서는 1,000 µg/mL에서 95%의 전자공여능을 나타내었다. 만형자 분획물 중 ethyl acetate 분획물이 가장 강한 활성을 나타내는 것을 확인할 수 있었다.
본 실험에서는 만형자 분획물의 항산화 효과를 알아보기 위하여 DPPH를 이용하여 항산화 효과를 측정한 결과(Fig. 1), 1,000 µg/mL에서 n-hexane 분획물의 경우 46%, ethyl acetate 분획물 76%, butanol 분획물 37%, water 분획물이 29%를 나타내었으며, 대조군인 vitamin C (vit. C)에서는 1000 µg/mL에서 95%의 전자공여능을 나타내었다.
체내에서 생성되는 수종의 MMPs 가운데 MMP-1은 collagen에 특이적으로 작용하는 protease로서 MMP-1의 활성을 억제하여 collagen의 분해를 감소시키면, 피부조직의 탄력을 유지하고 주름생성을 예방할 수 있는 것으로 알려져 있다(Talwar 등, 1995; Nagase와 Woessner, 1999). 본 연구에서 만형자 분획물이 MMP-1 생성에 미치는 영향을 평가한 결과(Fig. 5), UV-B를 처리하지 않은 군과 처리한 군은 각각 52, 100%의 MMP-1을 생산하여 UV-B를 처리함으로써 MMP1 양이 활성화됨을 확인할 수 있었다. 만형자 ethyl acetate 분획물 25 µg/mL에서 14%의 MMP-1의 발현 저해효과를 나타내었다.
이러한 주름 생성과 관련된 elastase 저해활성을 측정한 결과(Fig. 3), 만형자 분획물 1,000 µg/mL에서 butanol 분획물 9%, water 분획물 8%의 낮은 활성을 나타낸 반면 n-hexane 분획물에서는 1,000 µg/mL 농도에서 52% 저해활성을 나타내었고, 특히 만형자 ethyl acetate 분획물의 경우 1,000 µg/mL 농도에서 74% 저해활성을 나타내었다.
후속연구
만형자 ethyl acetate 분획물 25 µg/mL에서 14%의 MMP-1의 발현 저해효과를 나타내었다. 본 연구 결과를 통해 만형자 ethyl acetate 분획물이 피부탄력 및 주름 개선 효능에 기여할 것으로 판단된다.
질의응답
핵심어
질문
논문에서 추출한 답변
주름 생성과 관련된 elastase가 피부 구조에 미치는 영향은?
Elastase는 단백질인 엘라스틴을 분해하는 효소로 다른 중요한 기질 단백질인 콜라겐을 분해할 수 있는 비특이적 가수 분해 효소이다. 피부의 진피조직 속에서는 콜라겐과 피부의 탄력성에 관련된 엘라스틴이 그물망 구조로 형성하고 있는데, 엘라스틴이 elastase에 의해 분해되어 피부의 그물망 구조 결합이 끊어짐으로, elastase가 주름생성의 주원인 효소로 알려져 있다(Kligman, 2000). 이러한 주름 생성과 관련된 elastase 저해활성을 측정한 결과(Fig.
만형자란 무엇인가?
만형자(Vitex trifolia L.)는 마편초과의 순비기나무의 열매이다. 만형자의 기원 식물인 순비기나무는 독특하면서 강한 향기를 가지고 있어 예전부터 잎과 가지는 목욕용 재료나 실내의 습기를 제거하기 위한 흡습제 및 방매제로 사용하였으며, 종자인 만형자는 두통을 완화시키는 효과가 있다고 하여 민간에서는 베갯 속으로 사용하였다.
동양의학에서 사용되는 만형자의 치료 효과는?
만형자의 기원 식물인 순비기나무는 독특하면서 강한 향기를 가지고 있어 예전부터 잎과 가지는 목욕용 재료나 실내의 습기를 제거하기 위한 흡습제 및 방매제로 사용하였으며, 종자인 만형자는 두통을 완화시키는 효과가 있다고 하여 민간에서는 베갯 속으로 사용하였다. 또한 우리나라를 포함한 중국과 일본 등 동양의학에서 만형자는 성질이 차고 맛은 쓰면서 맵고 독이 없어 강장, 진정, 진통, 소염작용이 있어 감기, 만성중이염, 이명, 난청, 시력장애, 두통, 신경통, 습진 및 다양한 염증과 알러지성 질환의 치료에 사용하고 있다(Park과 Lee, 2000). 만형자에 관한 연구로는 monoterpene류를 포함한 약 76종의 정유성분과 골수성 백혈병 저해효과를 나타내는 flavonoids와 식물생장을 조절하는 phenol 화합물 등이 분리 동정된 바 있다(Kang과 Kim, 1994; Ono 등, 2000; Xin 등, 2006).
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