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문제 정의
- 1993)에 관한 연구가 있을 뿐, 뱀장어 양식장에서 최근까지도 만연하고 있는 에드와드병의 예방 백신에 대한 연구는 매우 부족하다. 본 연구는 뱀장어 에드와드병의 효과적인 백신 개발에 대한 가능성을 찾고자, 에드와드균 불활화백신(FKC)을 제작한 후, 뱀장어에 침지와 경구 투여함으로써 특이적 면역계(혈청 응집항체가)의 활성과 생균의 접종공격에 의한 방어력을 조사하였다.
- 1993). 본 연구에서는 뱀장어에 주사백신을 상업적으로 적용하는 것에 많은 문제점이 있다고 생각하여 침지와 경구를 이용하여 백신의 가능성을 찾아보고자 하였으며, 국내 백신 검정기준에 근거하여 상대생존율이 50% 이상이면 방어력이 있는 것으로 최종 평가하였다. 그 결과, 침지(10 mg/mL), 침지(10 mg/mL)+경구(10 mg/g), 침지(5 mg/mL)의 총 3개 실험구에서 뱀장어에 면역 처리한 FKC 백신이 에드와드균에 대하여 공격할 수 있는 방어력이 만족할 만한 수준이었다(상대 생존율 50% 이상).
- 본 연구는 뱀장어 양식에서 오랜 기간 문제시 되고 있는 에드와드병(Edwardsiellosis)에 대한 효과적인 백신 투여 방법의 가능성을 알아보고자 하였다. 뱀장어 유래의 Edwardsiella tarda로부터 포르말린 불활화백신(FKC)을 제작하여, 크기가 다른 3개 그룹의 뱀장어(26.
제안 방법
- 5% NaCl이 첨가된 BHI broth(증류수 1,000 mL)에 접종하고 30oC에서 26시간 정도 배양하였다. 배양된 종균은 API 20E 진단 Kit(BioMerieux, France)를 이용하여 E. tarda의 표준균주인 ATCC 15947을 대조균주로 각 형질의 반응도를 체크하여 생화학 특성의 상동성(4744000)을 확인하였다.
- 배양종료 후 배양액의 균수시험과 순수시험을 실시하기 위해 소량의 배양액을 무균적으로 채취한 다음, 배양균액에 포르말린 0.3% 농도를 첨가하여 12시간 이상 하룻밤 정치하며 불활화하였다.
- 시험용 백신의 분병을 완료한 후, 백신을 이용하여 무균시험 및 불활화 확인시험, 방부제 정량 시험을 실시하였다. 이때 무균시험 및 불활화 확인시험에 사용된 배지는 각각 10 mL의 nutrient agar, nutrient broth, fluid thioglycollate medium을 사용하였으며, 방부제 정량시험은 포르말린 함량 측정기를 사용하였다.
- 무균시험 및 불활화 확인시험, 방부제 정량시험을 통해 제품에 이상이 없음을 확인한 다음 시험백신으로 출고하였다.
- ① 백신 5 mg/mL 농도에 1시간 동안 침지 투여(immersion, 5 mg/mL), ② 백신 10 mg/mL 농도에 1시간 동안 침지 투여(immersion 10 mg/mL, 1 hr), ③ 백신을 사료 10 mg/g되게 조정하여 1일 1회, 10일간 경구 투여(oral 10 mg/g, 10 days), ④ 백신 5 mg/mL 농도에 1시간 동안 침지 투여한 후, 백신을 사료 10 mg/g되게 조정하여 1일 1회, 10일간 경구 투여(immersion 5 mg/mL, 1 hr + oral 10 mg/g, 10 days), ⑤ 백신 10 mg/mL 농도에 1시간 동안 침지 투여한 후, 백신을 사료 10 mg/g되게 조정하여 1일 1회, 10일간 경구 투여(immersion 10 mg/mL, 1 hr + oral 10 mg/g, 10 days), ⑥ 대조구(control)로 하였다. 침지 투여는 사육수 mL당 백신의 최종 용량이 5 mg과 10 mg이 되도록 FRP 수조에다 백신 원액을 현탁한 후에 실험어를 수용하였으며 처리하는 동안 산소를 공급하였다. 경구 투여는 뱀장어용 분말사료 g당 백신의 최종 용량이 10 mg이 되도록 조정하였으며 매일 새롭게 만들어서 공급하였다.
- ① 백신 25mg/mL 농도에 30분 동안 침지 투여, ② 백신 25 mg/mL에 30분 동안 침지한 후, 2주째 백신 25 mg/mL 에 30분 동안 침지, ③ 백신 25 mg/mL에 30분 동안 침지한 후, 백신을 사료 25 mg/g되게 조정하여 1일 1회, 4주 동안 경구 투여, ④ 대조구로 하였다. 침지 투여는 사육수 mL당 백신의 최종 용량이 25 mg이 되도록 FRP 수조에다 백신 원액을 현탁한 후에 실험어를 수용하였으며 처리하는 동안 산소를 공급하였다. 경구 투여는 뱀장어용 분말사료 g당 백신의 최종 용량이 25 mg이 되도록 조정하였으며 매일 새롭게 만들어서 공급하였다.
- 크기가 2.2±0.4 g인 그룹을 대상으로 시험백신의 용량과 투여방법에 따라 4개의 실험구를 설정하였다([Table 2]).
- 대조구는 백신을 처리하지 않았다. 이들 6개 실험구는 백신처리가 완료된 후, 별도 수조로 옮겨서 30일 동안 사육하면서 응집항체가 측정 및 공격접종에 의한 백신 방어효능을 조사하였다.
- 그룹별로 각 실험구마다 200마리씩 백신처리에 사용하였다. ① 백신 25mg/mL 농도에 30분 동안 침지 투여, ② 백신 25 mg/mL에 30분 동안 침지한 후, 2주째 백신 25 mg/mL 에 30분 동안 침지, ③ 백신 25 mg/mL에 30분 동안 침지한 후, 백신을 사료 25 mg/g되게 조정하여 1일 1회, 4주 동안 경구 투여, ④ 대조구로 하였다. 침지 투여는 사육수 mL당 백신의 최종 용량이 25 mg이 되도록 FRP 수조에다 백신 원액을 현탁한 후에 실험어를 수용하였으며 처리하는 동안 산소를 공급하였다.
- 대조구는 백신을 처리하지 않았다. 이들 4개 실험구는 백신처리가 완료된 후, 별도 수조로 옮겨서 8주 동안 사육하면서 응집항체가 측정 및 접종공격에 의한 백신 방어효능을 조사하였다.
- 시험 백신이 방어력에 미치는 효과를 조사하기 위하여 실험 1은 백신을 투여한 후 30일째 실험 구별로 그리고 실험 2는 백신을 투여한 후 8주째 실험구별로 예비 병원성 시험으로 얻어진 감염농도인 2.0×106 CFU/fish를 복강 내 주사하여 상대 생존율을 조사하였다.
- 백신을 투여한 후 실험 1은 10일, 20일, 30일이 경과한 다음 실험구별로 10마리씩 미병부의 혈관에서 주사기로 채혈하여 상법에 따라 혈청을 분리하였으며, microtiter법으로 응집항체가를 측정하였다. 실험 2는 4주째와 8주째 실험구별로 30마리씩 채혈(3~5마리씩 pooled)하여 실험 1과 같은 방법으로 응집항체가를 측정하였다.
- 뱀장어 크기별로 백신 투여방법과 농도에 따라 면역시킨 후 에드와드균에 대한 방어력을 조사하였다. 실험 1(26.
- 상대생존율(Relative percent survival, RPS)은 RPS(%) = 1-(백신 접종군 누적 폐사율/대조구 누적 폐사율) ×100의 산출식으로 구하였다.
- 뱀장어 유래의 Edwardsiella tarda로부터 포르말린 불활화백신(FKC)을 제작하여, 크기가 다른 3개 그룹의 뱀장어(26.8±1.2 g, 7.1±0.7 g, 2.2±0.4 g)에 침지 및 경구 투여를 실시하였다.
- 실험백신의 효능을 알아보기 위해서는 대상어종에서 면역 시스템의 발달을 파악할 필요가 있겠으나 뱀장어의 면역체계에 관해서는 거의 연구되지 못하였으므로 본 연구에서는 실험어를 개 그룹(26.8±1.2 g, 7.1±0.7 g, 2.2±0.4 g)으로 설정하였다 또한 백신 투여농도는 선행 연구자들의 보고를 참고하였지만 예비실험을 통해 임의로 결정하였다.
- 수거된 균체는 총량을 측정하여 기록한 다음 0.15% formalin첨가 PBS액에 넣어 bulk 상태로 보관하면서 상품화된 BL agar를 이용하여 불활화 유무를 확인하였다. 이때 보관은 5oC 이내에서 냉장보관하였다.
- 그룹별로 각 실험구마다 80마리씩 백신처리에 사용하였다. ① 백신 5 mg/mL 농도에 1시간 동안 침지 투여(immersion, 5 mg/mL), ② 백신 10 mg/mL 농도에 1시간 동안 침지 투여(immersion 10 mg/mL, 1 hr), ③ 백신을 사료 10 mg/g되게 조정하여 1일 1회, 10일간 경구 투여(oral 10 mg/g, 10 days), ④ 백신 5 mg/mL 농도에 1시간 동안 침지 투여한 후, 백신을 사료 10 mg/g되게 조정하여 1일 1회, 10일간 경구 투여(immersion 5 mg/mL, 1 hr + oral 10 mg/g, 10 days), ⑤ 백신 10 mg/mL 농도에 1시간 동안 침지 투여한 후, 백신을 사료 10 mg/g되게 조정하여 1일 1회, 10일간 경구 투여(immersion 10 mg/mL, 1 hr + oral 10 mg/g, 10 days), ⑥ 대조구(control)로 하였다. 침지 투여는 사육수 mL당 백신의 최종 용량이 5 mg과 10 mg이 되도록 FRP 수조에다 백신 원액을 현탁한 후에 실험어를 수용하였으며 처리하는 동안 산소를 공급하였다.
- 백신을 투여한 후 실험 1은 10일, 20일, 30일이 경과한 다음 실험구별로 10마리씩 미병부의 혈관에서 주사기로 채혈하여 상법에 따라 혈청을 분리하였으며, microtiter법으로 응집항체가를 측정하였다. 실험 2는 4주째와 8주째 실험구별로 30마리씩 채혈(3~5마리씩 pooled)하여 실험 1과 같은 방법으로 응집항체가를 측정하였다. 응집항체가 분석에 사용된 뱀장어를 제외하고 남은 실험 어를 대상으로 접종공격 실험에 제공하였다.
- 뱀장어 크기별로 백신 농도를 달리하여 침지법과 경구법으로 에드와드균의 불활화 예방백신(FKC)을 처리한 후, 혈청 내 응집항체가를 조사함으로써 뱀장어에 면역이 처리되었는지 조사하였다. 실험 1(26.
- 4 g)에 침지 및 경구 투여를 실시하였다. 그리고 혈청 응집항체가의 활성과 E. tarda 공격 접종에 대한 방어력(상대생존율, RSP)의 변화를 조사하였다. 모든 그룹에서 응집항체가와 공격접종에 의한 방어력은 상관성이 없었다.
대상 데이터
- 전남 영광에 위치한 양만장에서 사육중인 뱀장어(Anguilla japonica)를 크기별로 구입하여 국립수산과학원 내수면양식연구센터 생물사육실로 운반하였다. 이들은 200L FRP 수조(26±1oC)에 수용하여 시판 뱀장어용 분말사료를 반죽해서 제작한 사료를 1일 1회 공급하면서, 크기에 따라 평균체중이 26.
- 전남 순천의 양만장에서 질병으로 폐사한 뱀장어로부터 분리한 Edwardsiella tarda를 동결건조한 후 주식회사 대성미생물연구소에 분양하여 생산한 FKC를 시험 백신으로 사용하였다. 대성미생물연구소에서 제작한 시험 백신의 공정과정은 다음과 같다.
- 크기가 26.8±1.2 g 및 7.1±0.7 g인 그룹을 대상으로 백신의 용량과 투여방법에 따라 6개 실험구를 설정하였다([Table 1]).
- 7 g인 그룹을 대상으로 백신의 용량과 투여방법에 따라 6개 실험구를 설정하였다([Table 1]). 그룹별로 각 실험구마다 80마리씩 백신처리에 사용하였다. ① 백신 5 mg/mL 농도에 1시간 동안 침지 투여(immersion, 5 mg/mL), ② 백신 10 mg/mL 농도에 1시간 동안 침지 투여(immersion 10 mg/mL, 1 hr), ③ 백신을 사료 10 mg/g되게 조정하여 1일 1회, 10일간 경구 투여(oral 10 mg/g, 10 days), ④ 백신 5 mg/mL 농도에 1시간 동안 침지 투여한 후, 백신을 사료 10 mg/g되게 조정하여 1일 1회, 10일간 경구 투여(immersion 5 mg/mL, 1 hr + oral 10 mg/g, 10 days), ⑤ 백신 10 mg/mL 농도에 1시간 동안 침지 투여한 후, 백신을 사료 10 mg/g되게 조정하여 1일 1회, 10일간 경구 투여(immersion 10 mg/mL, 1 hr + oral 10 mg/g, 10 days), ⑥ 대조구(control)로 하였다.
- 4 g인 그룹을 대상으로 시험백신의 용량과 투여방법에 따라 4개의 실험구를 설정하였다([Table 2]). 그룹별로 각 실험구마다 200마리씩 백신처리에 사용하였다. ① 백신 25mg/mL 농도에 30분 동안 침지 투여, ② 백신 25 mg/mL에 30분 동안 침지한 후, 2주째 백신 25 mg/mL 에 30분 동안 침지, ③ 백신 25 mg/mL에 30분 동안 침지한 후, 백신을 사료 25 mg/g되게 조정하여 1일 1회, 4주 동안 경구 투여, ④ 대조구로 하였다.
- 실험 2는 4주째와 8주째 실험구별로 30마리씩 채혈(3~5마리씩 pooled)하여 실험 1과 같은 방법으로 응집항체가를 측정하였다. 응집항체가 분석에 사용된 뱀장어를 제외하고 남은 실험 어를 대상으로 접종공격 실험에 제공하였다.
데이터처리
- 응집항체가의 분석 자료는 one-way ANOVA -test를 실시하여 유의적인 차이가 있으면, Tukey's multiple range test로 평균간의 유의성(P=0.05)을 분석하였다.
성능/효과
- Bulk상으로 보관 중인 E. tarda 불활화 항원을 상업용 면양혈청 평판배지에 도말한 후, 배양하여 균과 곰팡이의 배양여부 등을 통해 이상이 없음을 확인하였다. E.
- 2.2±0.4 g 그룹에서는 침지(25 mg/mL)+경구(25 mg/g) 실험구가 상대생존율이 47.1%로 가장 높게 나타났다([Table 8]).
- 7.1±0.7 g 그룹에서는 침지(10 mg/mL)+경구(10 mg/g) 실험구가 상대생존율이 56.8%로 가장 높게 나타났다([Table 7]).
- 26.8±1.2 g 그룹에서는 침지(10 mg/mL) 실험구에서 상대생존율이 62.6%로 가장 높게 나타났으며, 침지(10 mg/mL)+경구(10 mg/g) 실험구는 상대생존율이 52.2%로 나타났다([Table 6]).
- 2.2±0.4g 그룹에서는 백신 처리 후 4주째에 침지(25 mg/mL)+경구(25 mg/g) 실험구의 응집항체가가 24.1±0.5를 나타내어 유의적으로 높았으나, 8주째까지 지속되지 못하였다.
- 7.1±0.7 g 그룹에서는 백신처리 후 20일째에 침지(5 mg/mL) 실험구의 응집항체가는 25.0±0.6을나타내어 유의적으로 높았으며, 30일째까지 24.8±0.7의 높은 값으로 유의적인 차이가 있었다([Table 4]).
- 또한 본 연구에서 뱀장어로부터 얻어진 높은 응집항체가인 24.7±1.0~25.0±0.6 (대조구 22.4±0.5~22.8±0.4)에 비하여 월등히 높은 값을 보였다.
- 틸라피아(10~40g)에 에드와드균의 FKC로 주사백신을 처리한 후 8주까지 면역반응을 조사한 보고(Lee Joo-Seok & Park Soo-IL 1992)에 따르면, 응집항체가는 1주째 25(대조구 2), 2주째에 29으로가장 높았으며, 3~4주째까지 28을 유지하였고 8주째에도 26을 형성하였다. 따라서 뱀장어, 넙치 및 틸라피아의 사례에서 볼 때 에드와드균의 FKC는 주사백신이 침지백신보다 높은 면역반응을 유도하는 것으로 생각된다. 또한 본 연구에서 뱀장어로부터 얻어진 높은 응집항체가인 24.
- 본 연구에서는 뱀장어에 주사백신을 상업적으로 적용하는 것에 많은 문제점이 있다고 생각하여 침지와 경구를 이용하여 백신의 가능성을 찾아보고자 하였으며, 국내 백신 검정기준에 근거하여 상대생존율이 50% 이상이면 방어력이 있는 것으로 최종 평가하였다. 그 결과, 침지(10 mg/mL), 침지(10 mg/mL)+경구(10 mg/g), 침지(5 mg/mL)의 총 3개 실험구에서 뱀장어에 면역 처리한 FKC 백신이 에드와드균에 대하여 공격할 수 있는 방어력이 만족할 만한 수준이었다(상대 생존율 50% 이상).
- 1993) 처리한 결과, 높은 면역반응과 일정 수준의 생존율은 확인되었으나 양쪽이 뚜렷한 상관성을 나타내지 못하였다. 특히 생존율은 면역반응의 결과에 비하여 상대적으로 낮은 효과를 보였다. 본 연구의 결과에서도 실험에 사용한 뱀장어의 모든 그룹에서 응집항체가와 방어력은 서로 연관성이 없어 앞선 연구자들의 결과와 잘 일치하였다.
- 특히 생존율은 면역반응의 결과에 비하여 상대적으로 낮은 효과를 보였다. 본 연구의 결과에서도 실험에 사용한 뱀장어의 모든 그룹에서 응집항체가와 방어력은 서로 연관성이 없어 앞선 연구자들의 결과와 잘 일치하였다.
- tarda 공격 접종에 대한 방어력(상대생존율, RSP)의 변화를 조사하였다. 모든 그룹에서 응집항체가와 공격접종에 의한 방어력은 상관성이 없었다. 그러나 26.
- 그러나 26.8g±1.2 g 그룹의 경우, 침지(10 mg/mL)와 침지(10 mg/mL)+경구(10 mg/g) 실험구에서 RSP는 각각 62.6% 및 52.2%를 나타내었으며, 7.1±0.7 g 그룹의 경우, 침지(10 mg/mL)+경구(10 mg/g) 실험구에서 RSP는 56.8%로 나타나서 방어력(RPS>50%)이 확인되었다.
후속연구
- 본 연구에서는 기본적인 백신 제작방법인 에드와드균의 FKC로 경구와 침지 투여함으로써 응집 항체가의 증가와 일정한 수준의 방어력을 얻었으므로, 향후 경구백신은 nano, microparticles, 식물발현시스템 등의 첨단기술(Park Eun-Joon et al. 2010), 침지백신은 ultrasound, combined immersion/puncture 등의 기술(Plant Karen P. & LaPatra Scott E. 2011), 또한 백신의 효능을 높이기 위하여 면역 보조제(adjuvant)와 면역 증강물질 (immunostimulants)에 대하여 추가적인 연구(Tafalla et al. 2013)가 필요하다고 생각한다.
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