초록 ▼

5. 최종 연구결과 요약

세부과제명:에드와드 감염증 예방을 위한 불활화 백신 개발
- E. tarda 특성 조사 및 불활화 백신 후보주 선정
∘ 2003-2010년 사이 국내에서 분리된 E. tarda를 대상으로 분리 숙주, 지역, 연도를 기준으로 37개 균주를 선정함 (뱀장어 24주, 넙치 9주, 관상어 2주, 잉어 2주)
∘ 대표 분리주의 생화학적 특성, 항생제 내성수준, 유전학적 근연관계 (16S rRNA, PFGE type), 교차 응집 수준, 병원성을 고려하여 불활화 백신 후보주를 선발하고자

5. 최종 연구결과 요약

세부과제명:에드와드 감염증 예방을 위한 불활화 백신 개발
- E. tarda 특성 조사 및 불활화 백신 후보주 선정
∘ 2003-2010년 사이 국내에서 분리된 E. tarda를 대상으로 분리 숙주, 지역, 연도를 기준으로 37개 균주를 선정함 (뱀장어 24주, 넙치 9주, 관상어 2주, 잉어 2주)
∘ 대표 분리주의 생화학적 특성, 항생제 내성수준, 유전학적 근연관계 (16S rRNA, PFGE type), 교차 응집 수준, 병원성을 고려하여 불활화 백신 후보주를 선발하고자 함
∘ 분리주의 운동성, 용혈능 및 생화학적 특성에 대해 조사한 결과, 뱀장어 유래 균주에서 citrate 분해, H2S 생성능, mannitol 발효능 및 용혈능이 균주별로 차이가 나타남을 확인함
∘ Penicillin, macrolide, quinolone, aminoglycoside, cephalosporin, tetracycline 계열 항생제 20종에 대해 분리 균주의 내성 수준을 조사한 결과 뱀장어 유래 E.tarda는 tetracycline (67-71%), quinolone (50-58%)에 대해 높은 내성 수준을 보임
∘ E. tarda 16S rRNA 염기서열을 기준으로 계통발생학적 분석 결과 subgroup I, II로 분류되며 뱀장어 유래 E. tarda의 경우 두 그룹에 모두 속함
∘ I-Ceu 효소를 이용하여 genomic DNA를 처리한 뒤 PFGE 분석 결과, 뱀장어 분리 E. tarda는 A-K pulsotype으로 분류됨 (80% similarity 기준)
: 뱀장어 분리 주요 type은 A-pulsotype으로 넙치 유래 균주는 G-pulsotype으로 분류됨
∘ 분리 주 type 별 혈청 교차 응집 수준을 분석하기 위해서 pulsotype별 (A,B,C,I,J) 토끼항혈청 (polyclonal antibody) 생산하였으며, microtiter법을 사용하여 분석함
: 뱀장어 유래 4개 균주 (ET-085, ET-166, ET-175, ET-198)을 제외하고 유전형 간의 혈청 교차 응집반응을 확인
: 뱀장어 분리 주요 type은 A-pulsotype으로 넙치 유래 균주는 G-pulsotype으로 분류됨
∘ 극동산 뱀장어 (A.japonica)에 대한 잠정 백신 후보주의 병원성 조사 결과 ET-060과 ET-191 접종 그룹에서 90%, 62.5%의 누적폐사율을 보임
:E.tarda의 뱀장어 병원성을 판별하기 위해 임상증상 및 균 분리를 기준으로 병원성 지수 평가 결과 ET-060 (1.0), ET-191 (1.0), ET-159 (0.6), ET-070 (0.4), ET-175 (0.3), ET-166 (0.0)으로 나타남
∘ 1012cfu/ml 이상으로 증식된 ET-060, ET-159, ET-191 균주를 대상으로 포르말린 농도, 처리 시간 및 온도 조건별로 불활화 여부를 확인한 결과 0.1% 포르말린, 37℃, 8hr 이상 반응 시 효과적으로 불활화 됨
- E. tarda 균의 접종 방법에 따른 면역원성·병원성 조사
∘ 복강 접종에 따른 면역원성을 조사하기위하여 극동산 뱀장어 (30-40g)를 대상으로 시험백신(ET-191)과 면역보조제(ISA760, ISA763A, ISA780) 혼합액을 복강 접종 후 1, 3, 5, 7 주간 혈청 응집 항체가를 확인함
: 복강 접종 1주 이후 응집 항체가가 증가하여 3주후 최고치에 도달하였으며, 이후 감소하는 경향을 보임
: FKC+ISA763A 접종 1주 이후부터 항체가는 평균적으로 26 이상 수준으로 나타났으며, 접종 균주이외에 넙치 분리 주와도 교차 응집반응을 보임
: 또한, E. tarda균에 대한 혈청 살균력도 접종 3주째 최고치(FKC+ISA763A 접종 그룹, 41.24%)에 도달하였으며, 이후 감소하는 경향을 보임
∘ 복강 접종에 대한 효능을 확인하기 위하여 시험백신과 면역보조제 혼합액을 복강 접종 2주 후 공격접종을 실시한 결과, FKC+ISA763A 접종 그룹에서 80%의 상대생존율을 보였으며, E. tarda에 대한 효과적인 방어력을 확인함
∘ 침지 접종 방법을 적용하기 위하여 시험백신 (ET-191)과 어류침지용 면역보조제 (IMS1312) 혼합액을 26℃에서 1시간동안 3회 침지 접종을 실시함 1회 침지 접종 결과에 비해 응집 항체가가 일정하게 유지됨을 확인하여 3회 침지 접종을 통해 지속적인 면역을 유도할 수 있는 것으로 나타남
∘ 최종 침지 백신 접종 2주 후(접종 5주 후) 1.07 x 108cfu/fish 농도로 공격접종(복강) 실시한 결과 FKC(70%), FKC+IMS1312 (90%)의 생존율을 보여서 1회 침지 접종에 비해 E. tarda 방어에 충분한 항체가 형성되는 것으로 판단함
- 어류에 적용가능한 면역보조제의 조사
∘ 어류에 적용 가능한 복강용 면역보조제 중 ISA760, ISA763A, ISA780를 대상으로 뱀장어에 대한 면역원성 및 방어능 조사 결과, 불활화 백신과 ISA763A (Non-mineral type oil)를 복강 접종으로 사용하는 것이 뱀장어 에드와드 감염증을 예방하는데 있어서 효과적임
∘ 어류에 적용 가능한 침지용 면역보조제 중 IMS1312는 수용성이며, 뱀장어 에드와드 감염증을 예방하는데 효과적임

목차 Contents

• 표지 ... 1
• 농림축산검역검사기술개발 연구과제 최종결과보고서 ... 2
• Ⅰ. 연구배경 및 목표 ... 5
• 1. 연구배경 ... 5
• 2. 연구최종목표 ... 7
• 3. 연차별 연구개발 목표 및 내용 ... 8
• Ⅱ. 연구방법 및 수행전략 ... 9
• 1. 재 료 ... 9
• 2. 연구전략 및 방법 ... 9
• Ⅲ. 연구결과 ... 10
• 다. 제3세부과제명: 에드와드감염증 예방을 위한 불활화 백신 개발 (2013-2014년) ... 10
• Ⅳ. 연구결과요약 ... 28
• 가. 제1세부과제명: 에드와드감염증 예방을 위한 신속진단법 개발 ... 28
• 나. 제2세부과제명: 양만장에서분리된 Edwardsiella tarda의 특성 및 병원성 비교 조사 ... 28
• 다. 제3세부과제명 : 에드와드감염증 예방을 위한 불활화백신 개발 ... 28
• V. 고찰 ... 30
• VI. 연구결과 활용실적 및 계획 ... 31
• VII. 연구사업 추진상 문제점 및 건의사항 ... 31
• VIII. 주요연구 변경사항 ... 31
• IX. 참고자료 ... 32
• 끝페이지 ... 33