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문제 정의
- 현재까지 삼엽목통의 경우 saponin 성분과 페놀성 성분에 관 한 연구가 활발히 이루어지고 있지만, 오엽목통의 경우 saponin 성분의 연구만 있을 뿐 페놀성 성분들에 관한 연구는 미비한 실 정이다. 이러한 점에 착안하여 본 연구에서는 목통의 분획별 항 산화활성을 비교하여 페놀성 성분들을 분리하고 기기분석을 통 한 구조규명과 항산화활성 확인실험을 진행하였다. 또한 주성분 이며 항산화 활성이 있는 페놀성 성분에 대한 HPLC-UV 함량 분석법을 개발 및 검증 하였으며, 확립된 분석법을 기준으로 국 내 약령시장에서 유통되고 있는 30품목에 대한 모니터링을 진행 #Corresponding Author Wan-Kyunn Whang College of Pharmacy, Chung-Ang University, Seoul 156-756, Korea Tel.
제안 방법
- 2,2'-Azino-bis(3-ethylbenzothizoline-6-sulfonic acid)(ABTS) 를 이용한 free radical scavenging activity 측정 − 본 연구에 서 사용한 ABTS assay는 Arnao16)의 방법에 의거하여 ABTS가 potassium sulfate와 반응하여 생기는 ABTS. + 양이온에 radical scavenging activity을 이용하여 시료의 항산화 활성을 평가하였 다. 7.
- 5% ethanol) 180 μl을 첨가하여, tecan austriagmbh(의료용 면역흡광 측정기, sunrise)로 10초 진탕하여 37o C에서 20분 동 안 incubation시킨 후 tecan austria gmbh(ELISA reader, BIORAD, US)를 이용하여 517 nm에서 흡광도를 측정 하였다. 14,15) 양성 대조군으로서 L-ascorbic acid를 농도별로 조제하여 본 실 험에 사용하였다. 각 시료의 항산화활성을 측정하기 위하여 산 화를 억제한 정도를 free radical scavenging activity로서 표기 하였고, 각 시료의 IC50을 비교 검토하였다.
- 2,2'-Azino-bis(3-ethylbenzothizoline-6-sulfonic acid)(ABTS) 를 이용한 free radical scavenging activity 측정 − 본 연구에 서 사용한 ABTS assay는 Arnao16)의 방법에 의거하여 ABTS가 potassium sulfate와 반응하여 생기는 ABTS.
- 5-O-caffeoylquinic acid는 ODS(이동상 20% methanol), sephadex LH-20(이동상 20% methanol) sephadex LH-20(이동 상 10% methanol)을 이용해 분리하였고, syringoylglycerol 2-Oβ-D-glucoside는 ODS(이동상 20% methanol), sephadex LH20(이동상 30% methanol), ODS(이동상 20% methanol)을 이용 하여 분리하였다.
- 60분간 초음파 추출한 후 원심분리기를 이용하여 3.500 rpm에서 10분간 원심분리한 후 여과한 여액을 membrane filter(0.45 μm)에 통과시켜 이중 10 μl를 HPLC system에 주입 하여 분석하였다.
- water 층은 Diaion HP-20로 open column chromatography를 실시하여 water 분획, 30% methanol 분획, 60% methanol 분획, 100% methanol을 얻었다. DPPH, ABTS free radical scavenging을 통 하여 각 분획물 중 가장 높은 항산화활성을 나타낸 30% methanol 분획을 ODS, sephadex LH-20, silica gel을 이용한 open column chromatography를 통하여 총 3개의 화합물을 분리하였다. 얻어 진 화합물은 물리 화학적 성상과 문헌조사 및 각종 기기분석( 1 HNMR, 13C-NMR, Mass Spectrometer)을 통하여 2-(3,4-dihydroxy phenyl)-ethyl-β-D-glucopyranoside, 5-O-caffeoylquinic acid, syringoylglycerol2-O-β-D-glucoside로 최종 구조 동정하였 다(Fig.
- 수층을 분 취한 후 chloroform을 이용하여 진탕 반복추출을 하고, 분획하여 chloroform층 분획 13 g과 water 분획 368 g, precipitate 1 g을 얻었다. Diaion HP-20을 이용하여 open column chromatography 를 실시하여 water 분획 208 g, 30% methanol 분획 29 g, 60% methanol 분획 91 g, methanol 분획 29 g을 각각 얻었다. 그 중 30% methanol 분획물을 대상으로 2-(3,4-dihydroxyphenyl)- ethyl-β-D-glucopyranoside, 5-O-caffeoylquinic acid, syringoylglycerol 2-O-β-D-glucoside를 분리하였다.
- HPLC 분석에 사용한 기기로는 YL9100 system, YL9101 Vacuum Degasser, YL9110 Quaternary Pump, YL9120UV/Vis Detector(Korea), ACE 5 C18(4.6×250 mm, 5 μm), Kromasil 100-5 C18(4.6× 250 mm, 5 μm), Phenomenex C18(4.6×250 mm, 5 μm)을 사용 하였고, 성분 규명 및 항산화활성 시약은 1 H-NMR spectrometer (Varian Gemini 2000, 600 MHz, U.S.A.), 13C-NMR spectrometer (Varian Gemini 2000, 150 MHz, U.S.A.), FAB-MS spectrophotometer(VG 70-VSEQ), Source(ionized by 35 keV Cs+ ion beam), Matrix(glycerol, England), NMR Solvents(CD3OD, internal standard, TMS), L-Ascorbic acid(Sigma Chemical Co., U.S.A.), DPPH(1,1-diphenyl-2-picrylhydrazyl(Sigma Chemical Co., U.S.A.), ABTS(2, 2'-azinobis(3-ethylbenzothizoline-6-sulfonic Acid)(Sigma Chemical Co., U.S.A.), Potassium persulfate (Sigma Chemical Co., U.S.A.), Trolox(6-Hydroxy-2, 5, 7, 8- tetramethylchromane-2-carboxylic acid, 7%, Sigma Chemical Co., U.S.A.), Tecansunrise microplate reader(Switzerland), Tecan ELISA reader(Austria), Repeating Pipette(Capp Rhythm RP-50, Denmark)을 사용하여 측정하였다.
- 1%)와 비교적 흡사 한 정도를 나타내었고, IC50(μM)을 측정한 결과 syringoylglycerol 2-O-β-D-glucoside>5-O-caffeoylquinic acid>2-(3,4-dihydroxy phenyl)-ethyl-β-D-glucopyranoside 순으로 확인하였다(Table IV). HPLC를 이용한 함량분석 충북, 전북, 경남, 경북 지역을 포함하여 목통시료 총 30개 추 출물의 함량분석을 실시하였다(Fig. 2). 2가지 주요 페놀성 성분 에 대하여 2-(3,4-dihydroxy phenyl)-ethyl-β-D-glucopyranoside Table III − DPPH free radical scavenging activity IC50 value of compounds from A.
- 14,15) 양성 대조군으로서 L-ascorbic acid를 농도별로 조제하여 본 실 험에 사용하였다. 각 시료의 항산화활성을 측정하기 위하여 산 화를 억제한 정도를 free radical scavenging activity로서 표기 하였고, 각 시료의 IC50을 비교 검토하였다. 2,2'-Azino-bis(3-ethylbenzothizoline-6-sulfonic acid)(ABTS) 를 이용한 free radical scavenging activity 측정 − 본 연구에 서 사용한 ABTS assay는 Arnao16)의 방법에 의거하여 ABTS가 potassium sulfate와 반응하여 생기는 ABTS.
- 14,15) 양성 대조군으로서 L-ascorbic acid를 농도별로 조제하여 본 실 험에 사용하였다. 각 시료의 항산화활성을 측정하기 위하여 산 화를 억제한 정도를 free radical scavenging activity로서 표기 하였고, 각 시료의 IC50을 비교 검토하였다. 2,2'-Azino-bis(3-ethylbenzothizoline-6-sulfonic acid)(ABTS) 를 이용한 free radical scavenging activity 측정 − 본 연구에 서 사용한 ABTS assay는 Arnao16)의 방법에 의거하여 ABTS가 potassium sulfate와 반응하여 생기는 ABTS.
- 용리 조건은 이동상 조성을 시간에 따라 변화시키는 기울기 용리를 사용하였다(Table II). 검출파장 은 210 nm을 선택하여 목통 추출물 및 표준품의 패턴 및 함량 분석을 실시하였다.
- 분리된 3종의 phenolic 성분을 대상으로 antioxidant assay인 DPPH, ABTS를 실시하였고, 양성 대조약물과 비교한 결과 3종 의 화합물 모두 우수한 항산화활성을 보였으므로 이는 목통의 약 효에 영향을 미칠 가능성이 있다고 판단하였다. 또한 HPLC-UV 분석법 개발을 통하여 25분이라는 빠른 시간 내에 2가지 페놀성 성분을 분석할 수 있도록 하였으며 그 결과 목통의 함량 및 대표 성분에 대한 fingerprint를 제시하였다. 확 립된 HPLC-UV 분석법으로 현재 국내에서 유통되고 있는 30품 목의 목통을 분석하여 2가지 페놀성 성분의 함량 분석을 수행한 결과, 지역별로 확연한 차이는 보이지 않았으나 충북지역 시료 (2, 14, 21, 27)는 5-O-caffeoylquinicacid의 함량이 높은 것으로 나타났으며 경남지역 시료(4, 26, 28)는 2-(3,4-dihydroxy phenyl)- ethyl-β-D-glucopyranoside의 함량이 낮은 것으로 나타났다.
- 목통(Akebiae caulis)를 70% methanol로 추출하여 chloroform 으로 탈지한 후 precipitate(PPT)층과 water층을 얻었다. water 층은 Diaion HP-20로 open column chromatography를 실시하여 water 분획, 30% methanol 분획, 60% methanol 분획, 100% methanol을 얻었다.
- 본 실험에 사용하기 위하여 stock solution을 methanol로 희석하여 UV/Vis spectrophotometer 732 nm에서 흡광도가 1.2 이하가 되도록 맞춘 후 농도별 시료의 stock solution 50 μl와 희석 된 ABTS+ 양이온 radical solution 950 μl을 혼합하여 실온에서 20분 차광 방치 하였다.
- 본 실험에서는 시료를 각 농도별로 조제한 용액 20 μl(control: 95.5% ethanol)에 0.1 mM DPPH 용 액(99.5% ethanol) 180 μl을 첨가하여, tecan austriagmbh(의료용 면역흡광 측정기, sunrise)로 10초 진탕하여 37o C에서 20분 동 안 incubation시킨 후 tecan austria gmbh(ELISA reader, BIORAD, US)를 이용하여 517 nm에서 흡광도를 측정 하였다.
- 본 연구에서는 saponin의 활성 및 성분 구조규명에 관한 연구 에만 국한되어 있는 목통에 대하여 항산화활성 및 phenolic 성 분 분리를 실시 각종기기분석을 통하여 2-(3,4-dihydroxyphenyl)- ethyl-β-D-glucopyranoside, 5-O-caffeoylquinic acid, syringoylglycerol 2-O-β-D-glucoside으로 동정하였다.
- 최종적으로 UV/Vis spectrophotometer를 이용하여 732 nm에서 시료의 흡 광도를 측정하였다. 양성 대조군으로서는 trolox를 이용하였고, 시료의 free radical scavenging activity을 비교 분석하였다. 각 시료의 IC50을 비교 검토하였다.
- 2 μm membrane filter로 여과한 후 HPLC 분석에 사용하였다. 이를 이용하여 검 량선을 작성하였으며, 검량선의 직선성은 상관계수(R2 )를 구하여 확인하였다. 고정상은 Kromasil 100-5C18(4.
- 3). 획득한 크로마토그램들로부터 각 성분들의 피크 면적을 구하고, 이를 미리 작성한 검량선에 대입하여 각 성분의 함량을 구하였다. 총 30품목의 목통 시료의 크로마토그램을 비교해본 결 과 2가지 페놀성 성분이 지역별로 확연한 차이를 보이지는 않았 으나, 충북지역 시료(2, 14, 21, 27)는 5-O-caffeoylquinic acid의 함량(w/w, %)이 각각 0.
대상 데이터
- Column Chromatography의 충진제로는 Diaion HP-20(Nippon Rensui Co., Japan), Silica gel(70-230 mesh, Merck, Germany), Sephadex LH-20(25~100 μm, Pharmacia, Sweden), ODS gel (400~500 mesh, Waters, U.S.A.)을 사용하였다.
- 각 시료의 IC50을 비교 검토하였다. HPLC 분석을 위한 전처리 및 분석조건 국내에 현재 유통되거나 자생하는 목통을 각 지역별로 30품목 을 수집하였다(Table I). 수집한 샘플을 분쇄기로 균질하게 분쇄 하여 50호 체로 친후 0.
- 경상북도 영천 목통 3 kg을 분쇄기를 사용하여 분쇄하고 70% methanol 10 l를 넣고 24시간 추출하여 여과하였으며 이를 4회 반복 후 감압농축 하여 총 382 g의 추출물을 얻었다. 수층을 분 취한 후 chloroform을 이용하여 진탕 반복추출을 하고, 분획하여 chloroform층 분획 13 g과 water 분획 368 g, precipitate 1 g을 얻었다.
- 고정상은 Kromasil 100-5C18(4.6×250 mm, 5 μm particle size) 컬럼을 사용하였으며, 이동상은 0.1% phosphoric acid와 Acetonitrile을 사용하였다.
- 본 실험에서 사용한 목통(Akebiae caulis)은 경상북도 영천산 목통으로 중앙대학교 약품자원식물학실험실에서 식물의 기원 및 형태학적 감정을 거친 후 3 kg을 연구의 재료로 사용하였다. 또 한 모니터링 및 함량분석을 실시하기 위해 국내에서 유통 중인 목통 29품목, 경상남도 진주에서 채집한 목통 1품목을 수집하여 감정을 통한 기원확인 후 분석에 사용하였다.
- 본 실험에서 사용한 목통(Akebiae caulis)은 경상북도 영천산 목통으로 중앙대학교 약품자원식물학실험실에서 식물의 기원 및 형태학적 감정을 거친 후 3 kg을 연구의 재료로 사용하였다. 또 한 모니터링 및 함량분석을 실시하기 위해 국내에서 유통 중인 목통 29품목, 경상남도 진주에서 채집한 목통 1품목을 수집하여 감정을 통한 기원확인 후 분석에 사용하였다.
- 본 연구에 사용한 기기로는 Balance(Metter Toledo ML204, Switzerland), Shaking water bath(Daihan - Sci LSB-045S, Korea), Vortex mixer(Thermolyne type 37600 mixer, U.S.A.), UV/VIS spectrophotometer(Human TU-1800PC, Korea, Optizen 2120 UV, Korea), TLC Adsorbent(Kiesel gel60 F254, Germany) 등이 있으며, 추출 및 분획과정에서 사용된 용매는 Methanol, Ethanol, Acetonitrile, Chloroform, Water, Formic acid, Acetic acid(J.T. Baker, HPLC grade, U.S.A.) 등을 사용하였다. Column Chromatography의 충진제로는 Diaion HP-20(Nippon Rensui Co.
이론/모형
- 각 표준물질 혼합용액은 연속희석법을 이용하여 희석하였으며, 준비된 각 표준액을 0.2 μm membrane filter로 여과한 후 HPLC 분석에 사용하였다.
성능/효과
- DPPH를 이용한 free radical scavenging activity 측정 목통의 70% methanol 추출물과 각 분획에 대하여 4가지의 농 도(200, 100, 50, 25 μg/ml)로 조제하여 실험한 결과, 목통의 추 출, 분획물에 대한 최고농도 200 μg/ml 농도에서 30% methanol 분획층이 81.9±0.1%로서 가장 큰 항산화 활성을 나타내었고, 60% methanol 분획>water 분획>extract>100% methanol 순 으로 DPPH free radical scavenging activity(%)가 증가하는 것 을 확인할 수 있었으며, IC50(μg/ml)을 측정값 또한 양성 대조군 인 ascorbic acid의 IC50(13.9±0.1 μg/ml)과 비교하였을 때 각 분 획물 중 30% methanol 분획(37.4±2.1 μg/ml)이 상대적으로 우 수한 DPPH free radicals scavenging activity를 가지는 것을 확 인하였다.
- Korea 분획층이 98.9±0.1%로서 가장 높은 항산화활성을 나타내었고, 60% methanol 분획>extract>water 분획>100% methanol 분 획 순으로 ABTS free radical scavenging activity(%)가 증가하 는 것을 확인할 수 있었으며, IC50(μg/ml)을 측정값 또한 양성 대 조군인 trolox(99.0±0.1%)과 비교 하였을 때 30% methanol 분 획층이 98.9±0.1%로서 높은 항산화활성을 나타내는 것을 확인 하였다.
- 목통의 높은 항산화 활성을 가지는 30% methanol 분획에서 분리한 3종의 화합물에 대하여 농도별 시료를 조제한 후 최종농 도 200, 100, 50, 25 μM로 하여 DPPH free radical scavenging activity를 측정한 결과 최고 농도 200 μM에서 양성 대조군인 ascorbic acid의 측정치(89.7±0.1%)와 비교적 흡사한 정도를 나 타내었고, IC50(μM)을 측정한 결과 5-O-caffeoylquinic acid>2- (3,4-dihydroxyphenyl)-ethyl-β-D-glucopyranosid>syringoylglycerol 2-O-β-D-glucoside 순으로 확인하였다(Table III).
- 목통의 높은 항산화활성을 나타낸 30% methanol 분획에서 분 리한 3종의 화합물에 대하여 농도별 시료를 조제한 후 최종농도 100, 50, 25, 12.5 μM로 하여 ABTS free radical scavenging activity를 측정한 결과 최고 농도 100 μM에서 이 86.0±0.3%로 서 양성 대조군인 trolox 의 측정치(99.7±0.1%)와 비교적 흡사 한 정도를 나타내었고, IC50(μM)을 측정한 결과 syringoylglycerol 2-O-β-D-glucoside>5-O-caffeoylquinic acid>2-(3,4-dihydroxy phenyl)-ethyl-β-D-glucopyranoside 순으로 확인하였다(Table IV).
- 본 연구에서는 saponin의 활성 및 성분 구조규명에 관한 연구 에만 국한되어 있는 목통에 대하여 항산화활성 및 phenolic 성 분 분리를 실시 각종기기분석을 통하여 2-(3,4-dihydroxyphenyl)- ethyl-β-D-glucopyranoside, 5-O-caffeoylquinic acid, syringoylglycerol 2-O-β-D-glucoside으로 동정하였다. 분리된 3종의 phenolic 성분을 대상으로 antioxidant assay인 DPPH, ABTS를 실시하였고, 양성 대조약물과 비교한 결과 3종 의 화합물 모두 우수한 항산화활성을 보였으므로 이는 목통의 약 효에 영향을 미칠 가능성이 있다고 판단하였다. 또한 HPLC-UV 분석법 개발을 통하여 25분이라는 빠른 시간 내에 2가지 페놀성 성분을 분석할 수 있도록 하였으며 그 결과 목통의 함량 및 대표 성분에 대한 fingerprint를 제시하였다.
- 얻어 진 화합물은 물리 화학적 성상과 문헌조사 및 각종 기기분석( 1 HNMR, 13C-NMR, Mass Spectrometer)을 통하여 2-(3,4-dihydroxy phenyl)-ethyl-β-D-glucopyranoside, 5-O-caffeoylquinic acid, syringoylglycerol2-O-β-D-glucoside로 최종 구조 동정하였 다(Fig. 1).
- 총 30품목의 목통 시료의 크로마토그램을 비교해본 결 과 2가지 페놀성 성분이 지역별로 확연한 차이를 보이지는 않았 으나, 충북지역 시료(2, 14, 21, 27)는 5-O-caffeoylquinic acid의 함량(w/w, %)이 각각 0.0859±0.49, 0.0844±0.26, 0.0571± 0.92, 0.0278±3.47으로 높은 반면 경남지역 시료(4, 26, 28)는 2- (3,4-dihydroxy phenyl)-ethyl-β-D-glucopyranoside의 함량(w/w, %)이 0.0107±1.11, 0.0037±4.55, 0.0122±1.24로 낮았으며, 진 주에서 채집한 시료 4번은 5-O-caffeoylquinicacid의 함량(w/w, %)이 0.1061±1.62로 다소 높은 것으로 나타났다(Table V).
- 최 종적으로 목통의 함량기준을 2-(3,4-dihydroxyphenyl)-ethyl-β-Dglucopyranoside은 0.009% 이상, 5-O-caffeoylquinicacid는 0.036% 이상으로 제안하였고, 이를 통해 목통의 품질관리를 위한 객관 적이고 과학적인 근거를 제시하여 향후 국내에서 유통되는 목통 의 품질을 평가하는 방향을 제시하는데 큰 의의를 가질 것으로 사료된다.
- 확 립된 HPLC-UV 분석법으로 현재 국내에서 유통되고 있는 30품 목의 목통을 분석하여 2가지 페놀성 성분의 함량 분석을 수행한 결과, 지역별로 확연한 차이는 보이지 않았으나 충북지역 시료 (2, 14, 21, 27)는 5-O-caffeoylquinicacid의 함량이 높은 것으로 나타났으며 경남지역 시료(4, 26, 28)는 2-(3,4-dihydroxy phenyl)- ethyl-β-D-glucopyranoside의 함량이 낮은 것으로 나타났다.
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