어성초, 자소엽, 녹차 식물 추출 혼합물의 항산화 및 Tyrosinase 저해 효과에 관한 연구 Antioxidant and Tyrosinase Inhibitory Effects of the Extract Mixtures of Perilla frutescens, Houttuynia cordata and Camellia sinensis원문보기
본 연구에서는 항산화 기능을 가진 자소엽, 어성초 그리고 녹차 추출물들과 이들 추출물의 혼합물을 사용하여 항산화, 미백, 세포독성실험을 진행하였다. 자소엽, 어성초와 녹차의 추출물을 동일 양으로 혼합하였을 때 처리농도가 증가함에 따라 농도 의존적으로 DPPH와 ABTS 라디칼 소거활성이 높아졌으며, 추출물을 혼합한 경우 낮은 농도인 $10{\mu}g/mL$에서도 80.2%, 98.0%의 DPPH와 ABTS 라디칼을 소거시키는 우수한 항산화 효과를 나타내었다. 미백효과의 정도를 조사하기 위하여 tyrosinase 저해효과를 조사한 결과 자소엽과 녹차추출물 그리고 각 추출물의 혼합물이 농도 의존적으로 tyrosinase 저해효과가 증가되었다. HaCaT 세포를 사용한 세포독성실험의 경우 자소엽, 어성초 추출물의 경우 세포생존율이 무처리 대조군과 같거나 높게 나타났으며 특히 어성초추출물의 경우 $100{\mu}g/mL$에서 무처리 대조군 보다 10% 이상의 높은 생존율을 보였다. 녹차와 각 식물 추출물 혼합물의 경우 $500{\mu}g/mL$ 이상에서는 무처리 대조군에 비하여 세포생존율이 감소하였다. 그러므로 세 가지 식물의 추출물 혼합물이 $100{\mu}g/mL$ 농도일 때 세포에 안전하며 높은 항산화 활성과 함께 tyrosinase 저해 효과가 있었다.
본 연구에서는 항산화 기능을 가진 자소엽, 어성초 그리고 녹차 추출물들과 이들 추출물의 혼합물을 사용하여 항산화, 미백, 세포독성실험을 진행하였다. 자소엽, 어성초와 녹차의 추출물을 동일 양으로 혼합하였을 때 처리농도가 증가함에 따라 농도 의존적으로 DPPH와 ABTS 라디칼 소거활성이 높아졌으며, 추출물을 혼합한 경우 낮은 농도인 $10{\mu}g/mL$에서도 80.2%, 98.0%의 DPPH와 ABTS 라디칼을 소거시키는 우수한 항산화 효과를 나타내었다. 미백효과의 정도를 조사하기 위하여 tyrosinase 저해효과를 조사한 결과 자소엽과 녹차추출물 그리고 각 추출물의 혼합물이 농도 의존적으로 tyrosinase 저해효과가 증가되었다. HaCaT 세포를 사용한 세포독성실험의 경우 자소엽, 어성초 추출물의 경우 세포생존율이 무처리 대조군과 같거나 높게 나타났으며 특히 어성초추출물의 경우 $100{\mu}g/mL$에서 무처리 대조군 보다 10% 이상의 높은 생존율을 보였다. 녹차와 각 식물 추출물 혼합물의 경우 $500{\mu}g/mL$ 이상에서는 무처리 대조군에 비하여 세포생존율이 감소하였다. 그러므로 세 가지 식물의 추출물 혼합물이 $100{\mu}g/mL$ 농도일 때 세포에 안전하며 높은 항산화 활성과 함께 tyrosinase 저해 효과가 있었다.
In the present study, antioxidant activities and tyrosinase inhibition of Perilla frutescens, Houttuynia cordata and Camellia sinensis extracts and the extract mixtures (PHC) were investigated. PHC showed 80.2% and 98.0% of free radical scavenging activity in DPPH and ABTS analysis, respectively, an...
In the present study, antioxidant activities and tyrosinase inhibition of Perilla frutescens, Houttuynia cordata and Camellia sinensis extracts and the extract mixtures (PHC) were investigated. PHC showed 80.2% and 98.0% of free radical scavenging activity in DPPH and ABTS analysis, respectively, and 50% tyrosinase inhibition in $1000{\mu}g/mL$ concentration. HaCaT cells did not show cell toxicity in $100{\mu}g/mL$ of the PHC. Furthermore, HaCaT cell viability by co-culture with extract H. cordata was increased more than 10% compared with untreated cells. However, the cell viability was decreased in $500{\mu}g/mL$ of the extract C. sinensis and the PHC. These results suggested that about $100{\mu}g/mL$ concentration of the PHC showed proper tyrosinase inhibitory effect and antioxidant activities. The PHC could be used as multifunctional cosmeceutical agents.
In the present study, antioxidant activities and tyrosinase inhibition of Perilla frutescens, Houttuynia cordata and Camellia sinensis extracts and the extract mixtures (PHC) were investigated. PHC showed 80.2% and 98.0% of free radical scavenging activity in DPPH and ABTS analysis, respectively, and 50% tyrosinase inhibition in $1000{\mu}g/mL$ concentration. HaCaT cells did not show cell toxicity in $100{\mu}g/mL$ of the PHC. Furthermore, HaCaT cell viability by co-culture with extract H. cordata was increased more than 10% compared with untreated cells. However, the cell viability was decreased in $500{\mu}g/mL$ of the extract C. sinensis and the PHC. These results suggested that about $100{\mu}g/mL$ concentration of the PHC showed proper tyrosinase inhibitory effect and antioxidant activities. The PHC could be used as multifunctional cosmeceutical agents.
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문제 정의
최근 어성초, 자소엽과 녹차에 대한 항산화기능을 활용한 안티에이징, 발모방지 등의 기능성 화장품과 식품개발에 관한 연구가 진행되고 있으나 이들을 혼합하였을 때 어떠한 기능을 나타내는지에 관한 연구나 활용에 관한 보고는 없다. 따라서 본 연구에서 자소엽, 어성초, 그리고 녹차의 단일 식물추출물과 이들 각 추출물의 혼합물을 사용하여 항산화 효과, tyrosinase 저해 효과, 세포독성과 세포증식효과를 조사하였다.
본 연구에서는 자소엽, 어성초, 녹차 추출물과 이들각 추출물의 혼합물에 대한 항산화능 및 미백효과를 알아보았으며, 이들 추출물들에 대한 세포독성실험을 관찰하였다. 항산화 실험인 DPPH radical 소거활성능에 대한 측정은 10 µg/mL 농도에서 자소엽, 어성초, 녹차 추출물을 각각 처리했을 때 46, 39, 30%를 나타내었으나 이들 각 추출물을 혼합적으로 처리하였을때 80% 이상의 항산화성을 나타내었으며, ABTS radical 소거활성능은 10 µg/mL 농도에서 단일 식물 추출물은 각각 14, 17, 77%를 나타내었으나, 각 추출물의 혼합물은 98% 이상의 효과를 나타내었다.
본 연구에서는 추출물들의 보다 자세한 항산화능을 조사하기 위하여 ABTS를 이용하여 라디칼 소거활성을 측정하였다. ABTS 라디칼 소거활성 측정의 원리를 간략히 이해하면, 먼저 ABTS가 potassium persulfate에 의해 전자가 산화되어 청록색을 나타내며, 이후 추출물에 포함된 항산화 물질에 의하여 전자공여능이 환원됨에 따라 청록색이 점차 옅어지는 과정을 측정 하는 방법이다.
따라서 활성산소를 보다 안전하게 소거하기 위하여 그에 따른 대안으로 천연 항산화물질에 대한 관심이 높아지고 있으며, 천연 물질이나 식품을 이용한 소재 개발에 대한 연구가 활발하게 이루어지고 있다[10,11]. 본 연구에서는 탁월한 항산화 기능 식물로 알려진 녹차, 어성초, 자소엽을 사용하여 항산화 기능이 우수한 복합물질을 개발하고자 연구를 진행하였다. 녹차(Camellia sinensis)의 카테킨(catechin)과 EGCG는 암 발생 예방, 항산화, 항염증효과가 있다[12-14].
제안 방법
ABTS [2, 2’-azinobis(3-ethylbenzothiazoline-6-sulfonic acid) diammonium salt] 라디칼 소거활성 측정은 Re 등의 방법[30]을 변형하여 측정하였다.
Tyrosinase의 활성을 저해하는 정도를 측정하기 위하여 in vitro Tyrosinase inhibition assay를 실시하였다. in vitro Tyrosinase inhibition assay는 Mason 등의 방법[43]을 변형하여 측정하였다.
Tyrosinase의 활성을 저해하는 정도를 측정하기 위하여 in vitro Tyrosinase inhibition assay를 실시하였다. in vitro Tyrosinase inhibition assay는 Mason 등의 방법[43]을 변형하여 측정하였다. 실험방법은 0.
2)로 여과한 후 회전감압농축기(N-1000, Eyela, Japan)를 이용하여 농축하고 건조한 후 중량법으로 수율을 계산하였다. 각 식물 추출물 혼합물의 처방은 자소엽, 어성초, 녹차 각각의 질량비를 1 : 1 : 1로 조합하여 준비하였다. 모든 실험 재료는 사용 전까지 4 ℃에 보관하였다.
건조된 시료는 흐르는 물에 세척한 후 수분을 제거하고 칭량하여 파쇄한 한 분말을 사용하였다. 각 실험재료는 시료 무게의 10배에 해당하는 멸균된 순수정제수를 첨가하여 80 ℃에서 24 h 중탕하였으며, 3회 반복 추출하였다. 추출 후 여과지(Advantec No.
단일 식물 추출물과 각 식물 추출물 혼합물(1 : 1 : 1) 을 농도별로 희석한 시료를 96well plate에 5 × 103 cell/ well로 균일하게 분주한 다음 24 h 후 각 추출물을 농도별로 처리하여 72 h 동안 배양하였다.
2 mM DPPH 용액 250 µL를 진탕기로 잘 혼합하여 실온에서 30 min 동안 반응시킨 후 UV/VIS spectrophotometer (Optizen 2120 UV, Mecasys, Korea)를 이용하여 517 nm에서 흡광도를 측정하였다. 대조군으로 DPPH 대신 에탄올을 처리하였다. DPPH의 활성 저해율을 다음의 식에 따라 계산하였다.
5)을 사용하였다. 또한 양성 대조군은 알부틴을 사용하였다. Tyrosinase 활성 저해율은 다음의 식에 따라 계산하였다.
배양 후 배지를 모두 제거하고 DMEM 배지 100 µL와 3-(4,5-dimethylthia zol-2-yl)-5-(3-carboxymethoxyphenyl)-2-(4-sulfophenyl)-2H-tetrazolium inner salt (MTS) solution 20 µL를 첨가 하여 5%, CO2, 37 ℃ 암상태 조건에서 3 h 반응시킨후 ELISA reader (Infinite™ F200, TECAN, Switzerland)를 이용하여 490 nm에서 흡광도를 측정하였다.
본 연구에서 자소엽, 어성초 그리고 녹차의 추출물 들과 이들을 혼합한 물질이 나타내는 미백효과를 in vitro tyrosinase 저해정도(tyrosinase inhibition assay)를 통하여 조사하였다(Figure 3). 단일 식물추출물인 경우 어성초는 매우 낮은 tyrosinase 저해를 나타내었으나 녹차추출물의 경우 매우 높은 tyrosinase 저해 정도를 나타내었다.
본 연구에서는 DPPH를 이용하여 단일 식물 추출물과각 추출물 혼합물의 라디칼 소거활성을 측정하였다. 단일 식물 추출물의 DPPH 자유라디칼 소거활성능을 조사하기 위하여 자소엽, 어성초 그리고 녹차의 추출물 각각의 단일 물질과 이들 추출물을 1 : 1 : 1로 혼합한 혼합물의 항산화 기능성을 측정한 결과 대부분 단일 식물추출물의 경우 농도가 높아질수록 농도 의존적으로 자유라디칼 소거활성능이 높아졌으나, 추출물을 혼합한 경우 가장 낮은 농도인 10 µg/mL에서 80% 이상의 높은 라디칼 소거활성을 나타내었다(Figure 1).
실험방법은 0.1 M 인산염완충액(pH 6.5) 250 µL와 각 농도별로 희석된 시료 225 µL, mushroom Tyrosinase (2000 U/mL)(Sigma, USA) 25 µL와 1.5 mM Tyrosine 225 µL를 순서대로 첨가한 후 37 ℃에서 10 ~ 15 min 동안 반응시켰다.
실험방법은 각 농도별로 희석된 시료 500 µL에 에탄올로 용해시킨 0.2 mM DPPH 용액 250 µL를 진탕기로 잘 혼합하여 실온에서 30 min 동안 반응시킨 후 UV/VIS spectrophotometer (Optizen 2120 UV, Mecasys, Korea)를 이용하여 517 nm에서 흡광도를 측정하였다.
인간각질세포(human keratinocyte cell line, HaCaT) 세포를 Dulbecco’s Modified Eagle Medium (DMEM, Thermo, USA) 배지에 10% fetal bovine serum (FBS)과 penicillin (100 units/mL) / streptomycin (100 µg/mL)을 첨가하여 CO2세포배양기(NU-4750G, NuAire, USA)에서 5% CO2 공급 하에 배양하였으며, 2 - 3일 간격으로 계대 배양을 시행하였다.
각 실험재료는 시료 무게의 10배에 해당하는 멸균된 순수정제수를 첨가하여 80 ℃에서 24 h 중탕하였으며, 3회 반복 추출하였다. 추출 후 여과지(Advantec No. 2)로 여과한 후 회전감압농축기(N-1000, Eyela, Japan)를 이용하여 농축하고 건조한 후 중량법으로 수율을 계산하였다. 각 식물 추출물 혼합물의 처방은 자소엽, 어성초, 녹차 각각의 질량비를 1 : 1 : 1로 조합하여 준비하였다.
DPPH 라디칼 소거활성능을 이용한 항산화력은 Blois의 방법[29]을 변형하여 측정하였으며 항산화능을 측정하는 방법 중에 하나로 많이 사용되고 있는 방법이다. 추출물의 1,1-diphenyl-2-picrylhydrazyl (DPPH) radical (Sigma, USA)은 라디칼 소거능은 DPPH 자유 환원력을 측정하였다. 실험방법은 각 농도별로 희석된 시료 500 µL에 에탄올로 용해시킨 0.
대상 데이터
실험재료인 자소엽(Perilla frutescens), 어성초(Houttuynia cordata), 녹차엽(Camellia sinensis)은 경북 경산시 소재 약재상에서 구입하여 사용하였다. 건조된 시료는 흐르는 물에 세척한 후 수분을 제거하고 칭량하여 파쇄한 한 분말을 사용하였다. 각 실험재료는 시료 무게의 10배에 해당하는 멸균된 순수정제수를 첨가하여 80 ℃에서 24 h 중탕하였으며, 3회 반복 추출하였다.
실험재료인 자소엽(Perilla frutescens), 어성초(Houttuynia cordata), 녹차엽(Camellia sinensis)은 경북 경산시 소재 약재상에서 구입하여 사용하였다. 건조된 시료는 흐르는 물에 세척한 후 수분을 제거하고 칭량하여 파쇄한 한 분말을 사용하였다.
데이터처리
모든 실험은 3회 반복 실시하였고 통계분석은 평균 ±표준편차로 나타내었으며, Student’s t-test법을 이용하여 p-value가 0.05 미만인 경우 통계적으로 유의성이 있는 것으로 판정하였다.
성능/효과
그러므로 본 연구에서는 DPPH를 이용하여 항산화능을 조사한 결과 자소엽, 어성초 그리고 녹차 각 단일 추출물보다 이들 추출물을 혼합한 경우 10 µg/mL의 적은 양에서도 80% 이상의 자유라디칼 소거능을 보였다.
단일 식물 추출물의 DPPH 자유라디칼 소거활성능을 조사하기 위하여 자소엽, 어성초 그리고 녹차의 추출물 각각의 단일 물질과 이들 추출물을 1 : 1 : 1로 혼합한 혼합물의 항산화 기능성을 측정한 결과 대부분 단일 식물추출물의 경우 농도가 높아질수록 농도 의존적으로 자유라디칼 소거활성능이 높아졌으나, 추출물을 혼합한 경우 가장 낮은 농도인 10 µg/mL에서 80% 이상의 높은 라디칼 소거활성을 나타내었다(Figure 1).
또한 100 µg/mL 농도의 경우 항산화 작용이 매우 높았으며 tyrosinase 저해 효과 또한 알부틴의 tyrosinase 저해 효과와 비슷한 수치를 나타내었다.
단일 식물추출물인 경우 어성초는 매우 낮은 tyrosinase 저해를 나타내었으나 녹차추출물의 경우 매우 높은 tyrosinase 저해 정도를 나타내었다. 또한 tyrosinase의 저해 효과는 자소엽과 녹차 추출물은 대조구로 사용한 알부틴과 같이 농도의존적으로 증가하였다. 단일 식물 추출물 중 녹차의 경우 높은 tyrosinase 저해 효과를 보였다(Figure 3).
항산화 실험인 DPPH radical 소거활성능에 대한 측정은 10 µg/mL 농도에서 자소엽, 어성초, 녹차 추출물을 각각 처리했을 때 46, 39, 30%를 나타내었으나 이들 각 추출물을 혼합적으로 처리하였을때 80% 이상의 항산화성을 나타내었으며, ABTS radical 소거활성능은 10 µg/mL 농도에서 단일 식물 추출물은 각각 14, 17, 77%를 나타내었으나, 각 추출물의 혼합물은 98% 이상의 효과를 나타내었다. 또한 미백 효과를 알아보기 위해 알부틴을 대조군으로 비교한결과 단일 식물 추출물에서는 자소엽과 녹차 추출물이 농도 의존적으로 미백효과를 나타내었으며, 특히 녹차 추출물의 경우는 이들의 각 추출물 혼합물과 비교하였을 때 비슷하게 tyrosinase 활성 저해효과를 나타내었다. 또한 세포 독성실험에서 자소엽 추출물은 대조군에 비해 세포생존능이 거의 같거나 조금 높았으며, 어성초 추출물은 세포생존율이 100 µg/mL에서 대조군과 비교하여 10% 이상 높았다.
또한 세포 독성실험에서 자소엽 추출물은 대조군에 비해 세포생존능이 거의 같거나 조금 높았으며, 어성초 추출물은 세포생존율이 100 µg/mL에서 대조군과 비교하여 10% 이상 높았다.
어성초추출물의 경우 대조군보다 세포생존율이 높거나 비슷하게 나타났으며, 특히 100µg/mL에서 높게 나타났다.
단일 식물 추출물과 각 추출물의 혼합물을 농도별로 세포독성을 측정한 결과는 Figure 4와 같다. 자소엽 추출물은 농도가 증가할수록 대조군보다 세포생존율이 높게 나타났다. 어성초추출물의 경우 대조군보다 세포생존율이 높거나 비슷하게 나타났으며, 특히 100µg/mL에서 높게 나타났다.
자소엽과 어성초 각 단일 추출물을 농도별로 처리한 시험군은 농도 의존적으로 라디칼 소거활성이 증가하기는 하였으나, 낮은 농도인 10 µg/mL에서는 라디칼소거능이 매우 낮았다.
항산화 실험인 DPPH radical 소거활성능에 대한 측정은 10 µg/mL 농도에서 자소엽, 어성초, 녹차 추출물을 각각 처리했을 때 46, 39, 30%를 나타내었으나 이들 각 추출물을 혼합적으로 처리하였을때 80% 이상의 항산화성을 나타내었으며, ABTS radical 소거활성능은 10 µg/mL 농도에서 단일 식물 추출물은 각각 14, 17, 77%를 나타내었으나, 각 추출물의 혼합물은 98% 이상의 효과를 나타내었다.
후속연구
멜라닌 합성을 조절, 저해하는 알부틴(arbutin), 하이드로퀴논(hydroquinone), 비타민 C 유도체(vitamin C derivative) 등의 물질이 색소 침착을 방지하고 해결하기 위해 개발되었으나 충분한 효과를 나타내지 않거나, 피부에 대한 안전성, 제형 내 안정성 등의 한계로 인하여 화장품 제형을 제작할 때 제한 적으로 처방되어 왔다[41,42]. 그러므로 자소엽, 어성초 그리고 녹차의 추출물들을 혼합한 경우 높은 tyrosinase 활성억제를 보였으므로 보다 안전한 화장품 미백제로 사용이 가능할 것이다.
또한 100 µg/mL 농도의 경우 항산화 작용이 매우 높았으며 tyrosinase 저해 효과 또한 알부틴의 tyrosinase 저해 효과와 비슷한 수치를 나타내었다. 이상의 결과들을 종합해 보면 자소엽, 어성초 그리고 녹차 식물들을 추출물을 단독으로 사용하는 것보다 혼합하여 사용하였을 때 낮은 농도에서 미백 기능성을 나타내었으며 피부세포의 노화를 지연시킬 수 있는 우수한 항산화 소재로서 기초 화장품에 응용될 수 있을 것이라 기대된다.
질의응답
핵심어
질문
논문에서 추출한 답변
활성산소의 제거에 대해 천연 항산화물질이 관심 받고 있는 이유는 무엇인가?
피부세포의 산화적 스트레스를 발생은 햇빛에 포함된 자외선에 장시간 노출되면, 피부 세포 내에 1 O2, ⋅ OH, O2⋅- , H2O2, ROO･, RO･, ROOH 및 HOCl 등의 활성산소종(reactive oxygen species, ROS)이 발생하게 되며 이러한 원인으로 생체 내 DNA를 손상시켜 세포의 노화를 촉진시키거나 암을 유발하게 한다[6,7]. 현재 사용하고 있는 합성 항산화제는 독성에 대한 문제가 제기되고 있다[8,9]. 따라서 활성산소를 보다 안전하게 소거하기 위하여 그에 따른 대안으로 천연 항산화물질에 대한 관심이 높아지고 있으며, 천연 물질이나 식품을 이용한 소재 개발에 대한 연구가 활발하게 이루어지고 있다[10,11].
어성초는 무엇인가?
녹차(Camellia sinensis)의 카테킨(catechin) 과 EGCG는 암 발생 예방, 항산화, 항염증효과가 있다[12-14]. 어성초(Houttuynia cordata)는 삼백초과(Saururaceae) 다년생 초본 식물로서 methyl-n-nonylketon, decanoyl acetaldehyde, α-pinene, linalool, δ-limonen, camphene, quercitrin, quercetin, reynoutrin, isoquercitrin, hyperin 등 다양한 성분들을 함유하고 있으며 항산화, 항균, 항알러지, 면역력 증진 등의 효능이 우수한 것으로 보고된 바 있다[15-20]. 자소엽(Perilla frutescens) 은 꿀풀과(Labiatae)에 속하는 식물로 항산화작용, 항염증, 항균작용, 항알레르기작용 등의 약리작용이 보고되어 있다[21-27].
녹차의 성분인 카테킨과 EGCG는 어떤 활성 효과를 가지는가?
본 연구에서는 탁월한 항산화 기능 식물로 알려진 녹차, 어성초, 자소엽을 사용하여 항산화 기능이 우수한 복합물질을 개발하고자 연구를 진행하였다. 녹차(Camellia sinensis)의 카테킨(catechin) 과 EGCG는 암 발생 예방, 항산화, 항염증효과가 있다[12-14]. 어성초(Houttuynia cordata)는 삼백초과(Saururaceae) 다년생 초본 식물로서 methyl-n-nonylketon, decanoyl acetaldehyde, α-pinene, linalool, δ-limonen, camphene, quercitrin, quercetin, reynoutrin, isoquercitrin, hyperin 등 다양한 성분들을 함유하고 있으며 항산화, 항균, 항알러지, 면역력 증진 등의 효능이 우수한 것으로 보고된 바 있다[15-20].
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