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문제 정의
- 본 연구의 목적은 고삼에 함유되어 있는 isoflavones 화합물의 일종인 genistein을 초임계 유체를 이용하여 분리를 위한 최적 운전조건을 제시하고자 한다.
제안 방법
- 고삼의 분말시료 5 g을 50% 메탄올 수용액에 용해하여 30 ℃에서 20분간 Sonicator를 이용하여 추출한 genistein의 농도는 0.1188 µg/ 20µl이었으며, 이 값을 기준으로 초임계 유체를 이용하여 genistein의 회수율을 산출하였다.
- )를 사용하였다. 추출장치는 추출기(300 mL), 재순환 냉각장치(MC-11, Jeio Tech), 액체펌프(5,500 psi, 100 mL/min, Il Shin autoclave)로 구성되어 있으며, 추출압력은 유압조절밸브(6000 psi, TESCOM)를 사용하여 조절하였다. 이산화탄소의 유량은 Dry Test Gas Meter(DC-5, Shinagawa)를 사용하여 측정하였고, 공용매는 액체펌프(500 kgf/cm2G, IlShin autoclave Co,)를 이용하여 주입하였다.
- 추출된 시료는 회전식 증발기(EYELA, Rotary Evaporator, N-1000)를 사용하여 농축하였으며, 시료의 분석을 위해 Solvent Deliver Pump(M930, 영린기기), Absorbance Detector(M 720, 영린기기), Syringe Loading Sample Injector(7725i, Rheodyne co.)로 구성된 HPLC를 사용하였다. 이동상으로 water/acetonitrile을 70/30(v/v%)의비율로 사용하였고, 유속은 1.
- ) 컬럼을 사용하였다. 전자공여능(Electron donating activity, EDA)에 의한 항산화 활성도의 측정에서는 Blois 등[19-21]의방법을 변형하여 사용하였으며 DPPH(1.1-Diphenyl-2-picrylhydrazyl) 분말을 에탄올 100 mL에 0.2 mM 농도로 용해하여 사용하였다. HPLC 분석에 사용한 추출시료 1 mL을 DPPH 용액 4 mL에 첨가하여 10분간 반응 후 UV 흡광도 측정장치(UV-2401PC, Shimadzu Co.
- 5 mg/ml, 1 mg/ml로 제조하여 검량선용 표준용액으로 하였다. HPLC를 각각의 표준용액을 취하여 HPLC chromatogram을 얻고 이로부터 농도와 peak 간의 검량선을 작성하였다.
- 추출기 압력이 대기압으로 돌아오면 분리기에 추출된 용액을 밸브를 열어 채취한다. 위의 과정을 측정압력과 온도, 공용매, 공용매의 농도를 변화시키면서 반복적으로 실험을 수행하였다.
- 온도와 압력을 각각 300 bar와 45 ℃로 고정하고 에탄올과 메탄올을 공용매로 사용하여 초임계 유체를 이용한 추출실험을 수행하였다. 각각 순도 70%의 에탄올과 메탄올 수용액을 공용매로 사용한 결과를 공용매를 첨가하지 않은 순수한 이산화탄소만을 용매로 사용하여 추출한 결과와 비교하였다.
- 온도와 압력을 각각 300 bar와 45 ℃로 고정하고 에탄올과 메탄올을 공용매로 사용하여 초임계 유체를 이용한 추출실험을 수행하였다. 각각 순도 70%의 에탄올과 메탄올 수용액을 공용매로 사용한 결과를 공용매를 첨가하지 않은 순수한 이산화탄소만을 용매로 사용하여 추출한 결과와 비교하였다. 공용매의 유량은 1.
- 온도와 압력을 각각 250 bar와 45 ℃로 고정하고 22%, 50%, 70%의 순도를 갖는 메탄올 수용액을 공용매로 사용하여 추출실험을 수행하였다.
- 실험온도는 45 ℃로 고정하였으며 압력은 각각 200 bar, 250 bar, 300 bar로 변화시켜가며 추출하였다 가장 높은 추출효율을 보인 70% 메탄올을 공용매로 사용하였으며, 공용매의 유량은 1.0 ml/min으로 고정하고 용매의 주입시간은 추출시간과 동일한 165분으로 하였다. 200 bar, 250 bar, 300 bar의 압력에서 추출한 genistein의 회수율은 낮은 압력부터 각각 12.
- 가장 높은 추출효율을 보인 순도 70% 메탄올을 공용매로 하여 일정한 압력에서 온도를 변화시켜 추출하였다. 공용매의 유량은 1.
- 공용매로 70% 메탄올과 70% 에탄올을 사용하여 300 bar에서 추출한 시료와 50% 메탄올을 사용하여 용매 추출한 시료를 대상으로 하여 항산화 활성 실험을 수행하였다. 70% 메탄올을 사용한 시료는 35 ℃, 45 ℃, 55 ℃에서 추출한 시료를 사용하였으며 70% 에탄올을사용한 시료는 45 ℃에서 추출한 시료를 사용하였다.
- 70% 메탄올을 사용한 시료는 35 ℃, 45 ℃, 55 ℃에서 추출한 시료를 사용하였으며 70% 에탄올을사용한 시료는 45 ℃에서 추출한 시료를 사용하였다. 전자공여능은 대조군으로 시료 무첨가 용액을 사용하였으며 첨가군과 무첨가군의 흡광도 차이를 백분율(%)로 하여 나타내었다. 각각의 조건에서 측정한 EDA를 Table 2에 나타내었으며 전자공여능을 측정한 추출시 료에서 모두 전자공여능 활성을 나타내었다.
- 0 ml/min으로 고정하였으며 용매의 주입시간은 추출시간과 동일한 165분으로 하였다. 실험압력은 300 bar로 고정하였고 온도는 각각 35 ℃, 45 ℃, 55 ℃로 변화시켜가며 추출하였다. 35 ℃, 45 ℃, 55 ℃의 온도에서 추출한 genistein의 회수율은 낮은 압력부터 각각 21.
대상 데이터
- 실험에 사용된 고삼(苦蔘)은 광주(대인시장) 민간약초상회에서 구입하였으며 물로 세척한 후에 진공동결건조기(SDFSF 24, 삼원 냉열엔지니어링)를 이용하여 영하 73℃, 60 µtorr에서 10시간 동안 동결 건조하였다. 건조된 시료를 볼밀로 세말하고 채 거름(mesh no.18)을 하여 시료로 사용하였다.
- 초임계 유체 용매로는 이산화탄소(99.99%, 대창가스)를 재순환 냉각장치(MC-11, JEIO TECH)로 -10℃까지 냉각하여 사용하였다. 대상물질의 추출효율을 위한 공용매 효과분석을 위해서 에탄올(99.
- 99%, 대창가스)를 재순환 냉각장치(MC-11, JEIO TECH)로 -10℃까지 냉각하여 사용하였다. 대상물질의 추출효율을 위한 공용매 효과분석을 위해서 에탄올(99.9%, 대정화금)과 메탄올(99.9%, 대정화금)을 증류수(덕산화학) 와 혼합하여 사용하였다. 검액의 조제에 genistein(98% HPLC grade, SIGMA-ALDRICH Co.
- 9%, 대정화금)을 증류수(덕산화학) 와 혼합하여 사용하였다. 검액의 조제에 genistein(98% HPLC grade, SIGMA-ALDRICH Co.)과 chloroform(98%, Junsei Chemical Co., Ltd.), 메탄올(99.9% 대정화금)을 사용하였고 HPLC 이동상 용액으로 acetonitrile(99.9%, 덕산화학)과 증류수를 혼합하여 사용하였다. 항산화 활성 측정에 사용한 DPPH(1.
- 9%, 덕산화학)과 증류수를 혼합하여 사용하였다. 항산화 활성 측정에 사용한 DPPH(1.1-Diphenyl-2-picrylhydrazyl)은 대정화금에서 구입하여 사용하였다.
- 고삼으로부터 genistein를 추출하기 위해 Fig. 1에 제시된 초임계 유체 추출장치(IlShin autoclave Co.)를 사용하였다. 추출장치는 추출기(300 mL), 재순환 냉각장치(MC-11, Jeio Tech), 액체펌프(5,500 psi, 100 mL/min, Il Shin autoclave)로 구성되어 있으며, 추출압력은 유압조절밸브(6000 psi, TESCOM)를 사용하여 조절하였다.
- 추출장치는 추출기(300 mL), 재순환 냉각장치(MC-11, Jeio Tech), 액체펌프(5,500 psi, 100 mL/min, Il Shin autoclave)로 구성되어 있으며, 추출압력은 유압조절밸브(6000 psi, TESCOM)를 사용하여 조절하였다. 이산화탄소의 유량은 Dry Test Gas Meter(DC-5, Shinagawa)를 사용하여 측정하였고, 공용매는 액체펌프(500 kgf/cm2G, IlShin autoclave Co,)를 이용하여 주입하였다. 사용한 추출기의 온도와 압력의 정확도는 각각 ±1℃, ±10 kgf/cm2 이었다.
- 실험에서 추출한 고삼의 genistein 함량을 비교하기 위해 검액을 제조하였다. 건조된 고삼 분말 5.
- 공용매로 70% 메탄올과 70% 에탄올을 사용하여 300 bar에서 추출한 시료와 50% 메탄올을 사용하여 용매 추출한 시료를 대상으로 하여 항산화 활성 실험을 수행하였다. 70% 메탄올을 사용한 시료는 35 ℃, 45 ℃, 55 ℃에서 추출한 시료를 사용하였으며 70% 에탄올을사용한 시료는 45 ℃에서 추출한 시료를 사용하였다. 전자공여능은 대조군으로 시료 무첨가 용액을 사용하였으며 첨가군과 무첨가군의 흡광도 차이를 백분율(%)로 하여 나타내었다.
- 초임계 이산화탄소를 이용하여 고삼으로부터 유용성분인 genistein를 추출하였으며 공용매로는 에탄올과 메탄올 수용액을 사용하였다. 본 연구를 통하여 다음과 같은 결론을 도출하였다.
- 실험에 사용된 고삼(苦蔘)은 광주(대인시장) 민간약초상회에서 구입하였으며 물로 세척한 후에 진공동결건조기(SDFSF 24, 삼원 냉열엔지니어링)를 이용하여 영하 73℃, 60 µtorr에서 10시간 동안 동결 건조하였다.
성능/효과
- 0 ml/min으로 고정하였으며 용매의 주입시간은 추출시간과 동일한 165분으로 하였다. 22%, 50%, 70% 메탄올을 공용매의 경우 12.34%, 14.25%, 17.42%의 회수율을 보였으며, 순도가 70%인 경우에서 가장 높은 회수율을 보였다. 공용매의 농도에 의한 의한 회수율의 변화를 Fig.
- 3에 그래프로 나타내었다. 추출대상 성분과 유사한 용해도 계수를 가질수록 추출능이 증가하므로 공용매의 농도가 높을수록 초임계 용매의 용해도 계수가 추출 물질의 용해도 계수와 근접하여 추출효율이 높아졌을 것으로 생각할 수 있다.
- 0 ml/min으로 고정하고 용매의 주입시간은 추출시간과 동일한 165분으로 하였다. 200 bar, 250 bar, 300 bar의 압력에서 추출한 genistein의 회수율은 낮은 압력부터 각각 12.34%, 17.42%, 22.82%의 회수율이 측정되었으며 300 bar에서 가장 높은 회수율을 보였다. 압력에 의한 회수율의 변화를 Fig.
- 실험압력은 300 bar로 고정하였고 온도는 각각 35 ℃, 45 ℃, 55 ℃로 변화시켜가며 추출하였다. 35 ℃, 45 ℃, 55 ℃의 온도에서 추출한 genistein의 회수율은 낮은 압력부터 각각 21.76%, 22.82%, 28.32%의 회수율이 측정되었으며 55℃에서 가장 높은 회수율을 보였다. 추출온도의 경우에도 온도증가에 따른 초임계 유체의 용해도의 증가로 인해 추출 효율도 높아졌을 것으로 생각할 수 있다.
- 그러나, 메탄올과 에탄올을공용매를 사용한 경우 genistein 회수율은 각각 22.82%와 12.67%로서 메탄올이 에탄올보다 우수한 공용매 효과를 보였다.
- 각각의 조건에서 측정한 EDA를 Table 2에 나타내었으며 전자공여능을 측정한 추출시 료에서 모두 전자공여능 활성을 나타내었다. 용매추출과 비교하였을 때 초임계 유체를 이용한 추출방법을 사용한 시료가 상대적으로 높은 활성을 보이거나 비슷한 활성을 나타내었으며 절대값으로 0~10%의 전자공여능 활성도 차이를 나타내었다. 초임계 유체를 이용하여 추출한 시료에서 70% 메탄올을 공용매로 사용하여 300 bar, 55 ℃ 조건에서 추출한 시료가 41.
- 용매추출과 비교하였을 때 초임계 유체를 이용한 추출방법을 사용한 시료가 상대적으로 높은 활성을 보이거나 비슷한 활성을 나타내었으며 절대값으로 0~10%의 전자공여능 활성도 차이를 나타내었다. 초임계 유체를 이용하여 추출한 시료에서 70% 메탄올을 공용매로 사용하여 300 bar, 55 ℃ 조건에서 추출한 시료가 41.53%의 가장 높은 활성을 보였으며, 회수율 또한 가장 높은 28.32%를 나타내는 것으로 나타났다. 이 결과는 초임계 유체를 이용하여 추출한 대상물질이 더 양호한 약리적 특성을 유지하는 것을 나타낸다[22].
- (2) 공용매인 메탄올의 순도가 증가함에 따라 높은 회수율을 보였다. 이 결과는 공용매의 농도가 높을수록 초임계 용매의 용해도 계수가 추출물질의 용해도 계수와 근접하여 추출효율이 높아졌기 때문으로 생각할 수 있다.
- (3) 추출압력이 높을수록 추출효율도 증가하였으며, 이는 압력의 증가에 따른 초임계 유체의 밀도의 증가로 인하여 용해도가 증가했기 때문으로 생각할 수 있다.
- (5) 모든 추출시료에서 전자공여능 활성을 나타내었으며, 특히 순도 70%의 메탄올을 공용매로 사용하여 300 bar, 55 ℃ 조건에서 추출한 시료가 41.53%의 가장 높은 활성을 보였다. 유기용매를 이용한 추출의 경우에 비해 초임계 유체를 이용한 추출의 경우에 대상물질의 약리적 특성이 더욱 잘 유지하는 것을 나타낸다.
- 종합하면, 이 연구의 범위에서는 초임계 이산화탄소를 이용한 고삼으로부터 genistein의 추출에 대한 최적 온도와 압력은 각각 55 ℃, 300 bar이었으며, 공용매는 순도 70% 메탄올이 가장 높은 추출효율을 보였다.
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