국내에서는 최초로 황해쑥의 변종인 섬애(Seomae)쑥이란 품종명으로 산림청 품종보호등록(산림청 품종보호 제 42호, 2013.09.27.)된 고부가가치 식품 자원의 산업 활용도를 높이기 위하여 섬애쑥(Artemisia argyi H.) 60% 에탄올 추출물의 TMT 유도성 인지 결함에 대한 학습 및 기억 능력 개선 효과를 연구하였다. 뇌 신경세포 사멸을 유도하여 뇌 기능의 억제를 유발하는 TMT에 의한 인지기능 장애에 있어서 in vivo 학습 및 기억 능력을 평가하기 위해 Y-maze 및 passive avoidance test를 실시한 결과 TMT에 의해 유도된 인지기능 장애는 섬애쑥 에탄올 추출물에 의해 일정 수준에서 회복 되는 것으로 나타났다. 이들 in vivo 실험 결과의 원인 규명을 위해 동물실험이 종료된 후 mouse의 뇌 조직을 적출하여 AChE 활성 및 뇌 신경세포의 과산화 정도로써 MDA 함량을 측정한 결과, 섬애쑥 60% 에탄올 추출물을 섭취한 mouse의 경우 AChE 활성을 억제할 수 있으며 MDA 함량 역시 저해 시키는 것으로 나타났다. 특히 퇴행성 뇌신경 질환에서 중요한 발병 원인으로 알려진 산화적 스트레스에 대한 검증을 위해 섬애쑥 60% 에탄올 추출물을 이용하여 과산화수소에 의해 유발되는 in vitro 산화적 스트레스에 대한 PC12 세포에 대한 신경세포 보호효과를 확인한 결과, 60% 에탄올 추출물을 처리한 그룹은 비교적 농도 의존적으로 $H_2O_2$로 유도된 산화적 스트레스에 대한 신경세포 보호효과가 나타남을 확인할 수 있었다. 섬애쑥 에탄올 추출물에 존재하는 페놀 화합물을 HPLC로 분석한 결과 항산화 활성이 있는 eupatilin과 jaceosidin이 함유된 것으로 분석되었다. 본 연구 결과를 종합해 볼 때, TMT에 의해 유도된 학습 및 기억능력 감소 효과에 대한 섬애쑥 60% 에탄올 추출물의 개선 효과는 eupatilin과 jaceosidin 등의 페놀 화합물에서 기인되는 항산화 효과들과 이로 인한 뇌 신경세포 보호효과 그리고 일정 수준에서의 AChE 억제 효과 등에 의한 것으로 판단된다.
국내에서는 최초로 황해쑥의 변종인 섬애(Seomae)쑥이란 품종명으로 산림청 품종보호등록(산림청 품종보호 제 42호, 2013.09.27.)된 고부가가치 식품 자원의 산업 활용도를 높이기 위하여 섬애쑥(Artemisia argyi H.) 60% 에탄올 추출물의 TMT 유도성 인지 결함에 대한 학습 및 기억 능력 개선 효과를 연구하였다. 뇌 신경세포 사멸을 유도하여 뇌 기능의 억제를 유발하는 TMT에 의한 인지기능 장애에 있어서 in vivo 학습 및 기억 능력을 평가하기 위해 Y-maze 및 passive avoidance test를 실시한 결과 TMT에 의해 유도된 인지기능 장애는 섬애쑥 에탄올 추출물에 의해 일정 수준에서 회복 되는 것으로 나타났다. 이들 in vivo 실험 결과의 원인 규명을 위해 동물실험이 종료된 후 mouse의 뇌 조직을 적출하여 AChE 활성 및 뇌 신경세포의 과산화 정도로써 MDA 함량을 측정한 결과, 섬애쑥 60% 에탄올 추출물을 섭취한 mouse의 경우 AChE 활성을 억제할 수 있으며 MDA 함량 역시 저해 시키는 것으로 나타났다. 특히 퇴행성 뇌신경 질환에서 중요한 발병 원인으로 알려진 산화적 스트레스에 대한 검증을 위해 섬애쑥 60% 에탄올 추출물을 이용하여 과산화수소에 의해 유발되는 in vitro 산화적 스트레스에 대한 PC12 세포에 대한 신경세포 보호효과를 확인한 결과, 60% 에탄올 추출물을 처리한 그룹은 비교적 농도 의존적으로 $H_2O_2$로 유도된 산화적 스트레스에 대한 신경세포 보호효과가 나타남을 확인할 수 있었다. 섬애쑥 에탄올 추출물에 존재하는 페놀 화합물을 HPLC로 분석한 결과 항산화 활성이 있는 eupatilin과 jaceosidin이 함유된 것으로 분석되었다. 본 연구 결과를 종합해 볼 때, TMT에 의해 유도된 학습 및 기억능력 감소 효과에 대한 섬애쑥 60% 에탄올 추출물의 개선 효과는 eupatilin과 jaceosidin 등의 페놀 화합물에서 기인되는 항산화 효과들과 이로 인한 뇌 신경세포 보호효과 그리고 일정 수준에서의 AChE 억제 효과 등에 의한 것으로 판단된다.
The anti-amnesic effect of Artemisia argyi H against trimethyltin (TMT)-induced learning and memory impairment and its neuroprotective effect against $H_2O_2$-inducedoxidative stress were investigated. Cognitive behavior was examined by Y-maze and passive avoidance test for 4 weeks, which...
The anti-amnesic effect of Artemisia argyi H against trimethyltin (TMT)-induced learning and memory impairment and its neuroprotective effect against $H_2O_2$-inducedoxidative stress were investigated. Cognitive behavior was examined by Y-maze and passive avoidance test for 4 weeks, which showed improved cognitive functions in mice treated with the extract. In vitro neuroprotective effects against $H_2O_2$-induced oxidative stress were examined using 3-(4,5-dimethylthiazol-2-yl)-2,5-diphenyl-tetrazolium-bromide and lactate dehydrogenase (LDH) assays. A. argyi H. extract showed protective effects against $H_2O_2$-induced neurotoxicity; moreover, LDH release into the medium was inhibited. Finally, high-performance liquid chromatography (HPLC) analysis showed that eupatilin and jaceosidin were the major phenolic compounds in A. argyi H. extract. These results suggest that A. argyi H. could be a good source of functional substances to prevent neurodegenerative diseases.
The anti-amnesic effect of Artemisia argyi H against trimethyltin (TMT)-induced learning and memory impairment and its neuroprotective effect against $H_2O_2$-inducedoxidative stress were investigated. Cognitive behavior was examined by Y-maze and passive avoidance test for 4 weeks, which showed improved cognitive functions in mice treated with the extract. In vitro neuroprotective effects against $H_2O_2$-induced oxidative stress were examined using 3-(4,5-dimethylthiazol-2-yl)-2,5-diphenyl-tetrazolium-bromide and lactate dehydrogenase (LDH) assays. A. argyi H. extract showed protective effects against $H_2O_2$-induced neurotoxicity; moreover, LDH release into the medium was inhibited. Finally, high-performance liquid chromatography (HPLC) analysis showed that eupatilin and jaceosidin were the major phenolic compounds in A. argyi H. extract. These results suggest that A. argyi H. could be a good source of functional substances to prevent neurodegenerative diseases.
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문제 정의
그러므로 국내 고유 자원으로서 섬애쑥의 유효 생리활성 효과 및 산업적 활용 가능성을 위한 다양한 연구가 필요한 실정이다. 따라서 본 연구에서는 고부가가치 식품 소재의 활용도 제고를 위하여 섬애쑥 추출물의 in vitro 신경세포 보호능력 및 TMT 유도성 뇌 신경세포 결함에 대한 in vivo 개선 효과를 연구하고자 하였다.
제안 방법
AD로부터 유발되는 학습 및 기억 능력 저하 등 각종 인지장애는 주로 대뇌 기저부의 콜린성 신경세포의 손상으로 기인된다는 기존 보고(6)를 바탕으로 본 연구에서는 섬애쑥 에탄올 추출물의 AChE 활성을 측정 하였다(7). Mouse의 뇌 조직을 적출하여 AChE 활성을 측정한 결과는 Fig.
ICR mouse 뇌 조직에서 MDA 분석을 통해 뇌 신경세포 보호 효과를 측정하였고, 섬애쑥 에탄올 추출물의 신경세포 보호효과를 보다 구체적으로 확인하기 위해 in vitro 세포주에서 DCF-DA, MTT, 그리고 LDH 분석을 실시하였다(Fig. 3).
Passive avoidance test는 dark chamber와 조명이 있는 light chamber 2개의 구역으로 구분되어 있으며 바닥은 stainless 철망으로 이루어져 있다. TMT 주사를 통한 Y-maze test 후 passive avoidance 학습 시험(training trial)을 실시하였다. 각 mouse는 조명이 있는 light chanber에서 조명을 켜지 않은 채 1분 동안 우선 적응시켰다.
뇌 신경세포막의 과산화 정도를 측정하기 위해 섬애쑥 에탄올 추출물을 섭취한 mouse의 뇌 조직에 존재하는 지질과산화 중간 생성물인 MDA의 함량을 측정하였다(Fig. 2(B)).
뇌 조직의 대부분을 구성하는 신경세포의 경우 그 기능적 특성 상 상대적으로 많은 지질 성분을 함유하고 있어 산화적 스트레스에 매우 취약한 구조로 신경세포 보호효과와 신경세포막과의 관계를 알아보고자 LDH 분석을 진행하였다. 과산화수소에 의해 유도된 PC12 세포막 손상에 대한 섬애쑥 에탄올 추출물의 보호효과를 확인하기 위해 신경세포 세포질 성분인 LDH 방출량을 측정한 결과는 Fig.
본 연구에서는 뇌 조직의 해마부위 등에 비가역적인 손상을 일으키는 TMT를 이용하여 기억력 및 학습능력이 감퇴된 ICR mouse 모델을 대상으로 Y-maze test와 passive avoidance test 실시하였고 그 결과는 Fig. 1과 같다.
섬애쑥 에탄올 추출물 중의 주요 페놀 화합물을 분석하기 위해 HPLC (Ultra mate 3000, Dionex, CA, USA) 분석을 실시하였다. 분석조건 중 컬럼은 C 18 컬럼(4.
상기의 in vivo 실험에서 섬애쑥 60% 에탄올 추출물을 일정 수준 이상의 농도로 섭취시켰을 때 TMT-induced 뇌 기능 저하 효과가 대조 그룹 수준으로 회복되는 것을 확인하였다. 이는 섬애쑥 에탄올 추출물이 TMT 에 의한 뇌 신경세포 독성을 부분적으로 masking하여 뇌 신경세포 기능을 회복시키는 것으로 판단되며, 이에 직·간접적으로 영향을 주는 주요 생물학적 지표를 확인하기 위해 뇌 조직 중의 AChE와 MDA 함량을 측정하였다.
퇴행성 뇌 신경질환에서 Aβ가 신경세포 내에서의 산화적 스트레스 수준 등을 증가시킴으로서 뇌 신경세포 사멸이 가속화된 다는 보고(15,17)를 근거로 MTT reduction 분석(22)를 통해 섬애쑥 에탄올 추출물의 과산화수소에 의해 유도된 신경독성에 대한 보호효과를 살펴보았다(Fig. 3(B)).
대상 데이터
PC12 세포(KCLB 21721, Korean Cell Line Bank, Seoul, Korea)는 신경세포의 특성을 나타내는 세포주(cell line)로 rat의 pheochromocytoma로부터 유도된 것을 사용하였다. PC12 세포를 25 mM HEPES, 10% fetal bovine serum, 25 mM sodium bicarbonate, 50 units/mL penicillin 및 100 mg/mL streptomycin이 포함된 RPMI 1640배지에 37℃, 5% CO2 조건에서 배양하였다.
본 실험에서 사용된 시료는 경남 남해군 남해섬애약쑥 영농조합법인에서 재배한 섬애쑥(Artemisia argyi H.)은 음건, 세절 및 분쇄하여 4℃에서 냉장보관 한 후 사용하였다. 섬애쑥 분말은 시료 50 g에 60% 에탄올을 1,000 mL 첨가하여 환류 냉각 하여 2시간 동안 추출하였으며, 이 추출과정을 3회 실시하여 여액을 농축한 후 동결건조 하여 실험에 사용하였다.
실험동물공급업체(Samtako, Osan, Korea)로부터 4주령의 ICR (Institute of Cancer Research) male mouse를 구입하여 5일간의 환경 적응 기간을 두었다. 모든 실험동물은 2마리/cage로 나누어 항온(20±2℃)과 상대습도(50-55%)가 유지되며, 12시간 간격으로 낮과 밤을 교대시키는 실험 실 환경에서 사육하였고, 충분한 양의 식수와 사료를 공급하였다.
TMT 주사 2일 후 Y-maze 실험을 실시하였다. 실험에 사용되는 Y-maze는 검은색 플라스틱 재질로 3개의 arm으로 구성하였으며, 각 arm의 길이, 높이, 너비는 각각 33, 15, 10 cm로 구성되어 있다. 각 arm을 A, B, C로 정한 후 한쪽 arm에 mouse를 놓고 8 분 동안 마우스가 들어간 arm의 이동경로를 기록하였다.
(Grand Island, NY, USA)에서 구입하였으며, penicillin, streptomycin, sodium bicarbonate와 HEPES 및 나머지 시약은 Sigma-Aldrich Chemical Co. 제품을 구입하여 사용하였다. 그 외 사용된 용매 및 시약은 모두 일급 이상의 등급을 사용하였다.
데이터처리
실험의 결과는 평균과 표준편차(mean±SD)로 나타내었고, 실험군 간 차이의 통계적 유의성은 SAS version 9.1 (SAS Institute Inc., Cary, NC, USA)를 이용하여 ANOVA 분산분석과 Duncan’s multiple range test로 유의성 검정을 시행하였다(p<0.05).
이론/모형
PC12 세포에서의 산화적 스트레스 생성 정도를 측정하기 위하여 DCF-DA (2'7'-dichlorodihydroflu-orescein diacetate) 분석을 이용하였다. 산화적 스트레스로 인해 세포 내 형성 된 ROS는 비 형광성을 나타내는 DCF-DA를 산화시켜 형광물질인 DCF로 전환시키는데 이렇게 전환된 형광물질의 양을 측정하여 세포 내 형성된 ROS 즉 산화적 스트레스를 측정하는 방법이다.
과산화수소에 의해 유도된 PC12 세포에 대한 신경세포 보호 효과는 MTT reduction assay로 측정하였다. 추출물을 이용하여 농도별로 PC12 세포에 처리하여 24시간 동안 예비배양 하였고, 그 후 과산화수소는 200 µM의 농도로 증류수에 녹여 첨가한 후 3 시간 동안 배양하였다.
성능/효과
1과 같다. 8분 동안 Y-maze에서의 mouse의 행동을 관찰한 결과로, TMT 그룹은 대조 그룹(100%) 대비 86.4%로 기억력 저하(13.6% 감소) 효과가 나타났다. 이에 반해 섬애쑥 에탄올 추출물을 함께 투여한 시료 그룹(S5, S10 및 S20 그룹)은 각각 약 100.
5초)에 비하여 전날 학습에 대한 기억 능력이 현저히 감소하였다. TMT 그룹과 비교하였을 때 시료 그룹(S5, S10, and S20 그룹)은 섭취량이 증가함에 따라 학습에 대한 기억 능력이 점진적으로 회복되는 것으로 나타났다. 특히, S20 그룹은 247.
1(C)와 같다. TMT 그룹의 latency time은 53.0초로 대조 그룹(279.5초)에 비하여 전날 학습에 대한 기억 능력이 현저히 감소하였다. TMT 그룹과 비교하였을 때 시료 그룹(S5, S10, and S20 그룹)은 섭취량이 증가함에 따라 학습에 대한 기억 능력이 점진적으로 회복되는 것으로 나타났다.
8% 정도 감소하는 것으로 나타났다. 결국 in vivo 실험에서 TMT에 의해 저하된 학습 및 기억 능력 등 mouse의 뇌 기능이 뇌 조직 중에 존재하는 AChE의 활성 억제와 뇌신경세포막의 과산화 방지 등에 의해 부분적으로 뇌 신경세포가 보호되면서 개선된 것으로 판단된다.
결국 본 연구에서 섬애쑥 에탄올 추출물의 항산화 활성은 eupatilin 및 jaceosidin과 같은 플라보노이드 함유와 높은 상관관계가 있을 것으로 판단된다. 더불어 이들 플라보노이드에서 기인되는 항산화 활성에 의한 신경세포 보호효과로부터 TMT에 의해 유도된 학습 및 기억능력 감소 효과가 ICR mouse model에서 개선되는 것으로 판단된다.
3(A)와 같다. 과산화수소를 단독 처리한 그룹에서는 118.4%로 대조 그룹 100% 대비 약 18.4%의 형광강도 증가를 보인 반면, 섬애쑥 추출물을 처리한 시료 그룹에서는 산화적 스트레스에 대한 신경세포 보호효과를 나타냈다. 특히 최고 농도 50 µg/mL에서는 110.
결국 본 연구에서 섬애쑥 에탄올 추출물의 항산화 활성은 eupatilin 및 jaceosidin과 같은 플라보노이드 함유와 높은 상관관계가 있을 것으로 판단된다. 더불어 이들 플라보노이드에서 기인되는 항산화 활성에 의한 신경세포 보호효과로부터 TMT에 의해 유도된 학습 및 기억능력 감소 효과가 ICR mouse model에서 개선되는 것으로 판단된다. 그러므로 2013년 9월 새로이 품종 등록된 섬애쑥의 고부가가치 식품 소재로서의 산업적 활용 가능성을 확인하였지만, 섬애쑥 에탄올 추출물 중에 상대적으로 미량 존재할 수 있는 eupatilin과 jaceosidin만의 개선 효과라고 단정할 수는 없으므로 향후 상기 물질을 분리·동정하여 물질 수준에서의 실질적인 효능 평가 및 비교가 필요할 것으로 판단된다.
섬애쑥 에탄올 추출물에 존재하는 페놀 화합물을 HPLC로 분석한 결과 항산화 활성이 있는 eupatilin과 jaceosidin이 함유된 것으로 분석되었다. 본 연구 결과를 종합해 볼 때, TMT에 의해 유도된 학습 및 기억능력 감소 효과에 대한 섬애쑥 60% 에탄올 추출물의 개선 효과는 eupatilin과 jaceosidin 등의 페놀 화합물에서 기인되는 항산화 효과들과 이로 인한 뇌 신경세포 보호효과 그리고 일정 수준에서의 AChE 억제 효과 등에 의한 것으로 판단된다.
3(B)). 본 연구에서는 과산화수소에 의해 유도된 산화적 스트레스 상태에서 과산화수소 그룹은 대조그룹 100% 대비 52.6%의 세포 생존율을 보였고, 과산화수소와 vitamin C (positive 대조 그룹)를 동시에 처리한 그룹에서는 84.2% 의 신경세포 생존율을 나타내어 과산화수소 처리구 대비 약 31.6% 의 신경세포 보호효과를 보였다. 섬애쑥 에탄올 추출물을 처리한 그룹에서는 농도 의존적으로 PC12 세포 생존율이 증가하는 것으로 나타났고, 특히 50 µg/mL에서는 positive 대조구로 사용된 vitamin C 200 µM 보다도 약 5.
1(C)). 상기의 in vivo 실험에서 섬애쑥 60% 에탄올 추출물을 일정 수준 이상의 농도로 섭취시켰을 때 TMT-induced 뇌 기능 저하 효과가 대조 그룹 수준으로 회복되는 것을 확인하였다. 이는 섬애쑥 에탄올 추출물이 TMT 에 의한 뇌 신경세포 독성을 부분적으로 masking하여 뇌 신경세포 기능을 회복시키는 것으로 판단되며, 이에 직·간접적으로 영향을 주는 주요 생물학적 지표를 확인하기 위해 뇌 조직 중의 AChE와 MDA 함량을 측정하였다.
6% 의 신경세포 보호효과를 보였다. 섬애쑥 에탄올 추출물을 처리한 그룹에서는 농도 의존적으로 PC12 세포 생존율이 증가하는 것으로 나타났고, 특히 50 µg/mL에서는 positive 대조구로 사용된 vitamin C 200 µM 보다도 약 5.5%정도 세포생존율이 증가하는 것으로 나타났다.
이상의 결과로 미루어볼 때, ICR mouse model에서 나타난 TMT 유도성 학습 및 기억 능력 저하에 대한 뇌 기능의 개선 효과는 섬애쑥(Artemisia argyi H.) 60% 에탄올 추출물이 갖는 항산화 활성에서 기인되는 뇌 신경세포 보호효과와 함께 뇌 조직 중에 존재하는 AChE에 대한 일정 수준에서의 저해 효과 등에 의해 기인되는 것으로 판단된다.
6% 감소) 효과가 나타났다. 이에 반해 섬애쑥 에탄올 추출물을 함께 투여한 시료 그룹(S5, S10 및 S20 그룹)은 각각 약 100.3, 101.1, 110.0%로 TMT 그룹과 비교하였을 때 시료 그룹 간 통계적 유의성은 나타나지 않았지만 mouse의 기억 능력 저하를 상대적으로 개선시킬 뿐만 아니라 대조 그룹과 유사한 수준으로 나타났다(Fig. 1(A)).
후속연구
더불어 이들 플라보노이드에서 기인되는 항산화 활성에 의한 신경세포 보호효과로부터 TMT에 의해 유도된 학습 및 기억능력 감소 효과가 ICR mouse model에서 개선되는 것으로 판단된다. 그러므로 2013년 9월 새로이 품종 등록된 섬애쑥의 고부가가치 식품 소재로서의 산업적 활용 가능성을 확인하였지만, 섬애쑥 에탄올 추출물 중에 상대적으로 미량 존재할 수 있는 eupatilin과 jaceosidin만의 개선 효과라고 단정할 수는 없으므로 향후 상기 물질을 분리·동정하여 물질 수준에서의 실질적인 효능 평가 및 비교가 필요할 것으로 판단된다.
질의응답
핵심어
질문
논문에서 추출한 답변
쑥이란 무엇인가?
쑥(Artemisia spp.)은 우리나라에서 자생하고 있는 국화과 다년생 초본 식물로서 우리나라 뿐 만 아니라 중국, 일본 등 아시아 지역과 유럽, 멕시코 및 북미 지역 등 전 세계적으로 약 400여종에 이르는 품종이 다양하게 분포 되어 있다(11). 특히 국내에서는 약 300여 종의 다양한 쑥들이 자생하고 있는 것으로 알려져 있으며 한방에서는 의초, 영고 및 황초 등으로도 불려진다.
알츠하이머성 치매의 병리학적 특징은 무엇인가?
이러한 산화적 스트레스는 지질, 단백질, 세포막 및 DNA 등을 산화시켜 세포의 노화와 변형을 유도함으로써 뇌졸중, 암, 동맥경화, 알츠하이머성 치매(Alzheimer's disease, AD) 및 파킨스 병과 같은 다양한 퇴행성 질환을 유발하게 되며 그 중 AD는 대표적인 퇴행성 뇌질환으로 보고되고 있다(2,3). AD의 병리학적 특징은 40-42개의 아미노산으로 이루어진 amyloid β protein (Aβ)의 과도한 축적으로 인한 산화적 스트레스 증가, 노인성 플라크(senile plaque) 및 신경섬유매듭(neurofibrillary tangle) 등의 형성으로 알려져 있다(4). Aβ에 의한 뇌신경세포독성은 H2O2를 포함하는 활성 산소종(reactive oxygen species; ROS)의 세포 내 증가로 산화적 스트레스와 매우 밀접한 관계가 있는 것으로 알려져 있다(5).
산화적 스트레스가 유발하는 것은?
모든 생명체는 유산소 호흡을 통하여 대사과정에서 라디칼과 활성산소를 생성하는데 활성산소는 불안정하고 산화력이 높아 생체 물질과 쉽게 반응하기 때문에 인체 내에서 제거되지 못하면 산화적 스트레스(oxidative stress)를 생성하게 된다(1). 이러한 산화적 스트레스는 지질, 단백질, 세포막 및 DNA 등을 산화시켜 세포의 노화와 변형을 유도함으로써 뇌졸중, 암, 동맥경화, 알츠하이머성 치매(Alzheimer's disease, AD) 및 파킨스 병과 같은 다양한 퇴행성 질환을 유발하게 되며 그 중 AD는 대표적인 퇴행성 뇌질환으로 보고되고 있다(2,3). AD의 병리학적 특징은 40-42개의 아미노산으로 이루어진 amyloid β protein (Aβ)의 과도한 축적으로 인한 산화적 스트레스 증가, 노인성 플라크(senile plaque) 및 신경섬유매듭(neurofibrillary tangle) 등의 형성으로 알려져 있다(4).
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