[논문]항비만소재의 lipoprotein lipase 억제 작용 연구

이성미; 강윤환; 김경곤; 김태우; 최면

doi:10.9721/kjfst.2015.47.2.246

항비만소재의 lipoprotein lipase 억제 작용 연구
Study of Lipoprotein Lipase Inhibitory Activity of Anti-obesity Herb Extracts 원문보기

한국식품과학회지 = Korean journal of food science and technology, v.47 no.2, 2015년, pp.246 - 253

이성미 (강원대학교 생명건강공학과) , 강윤환 (강원대학교 강원웰빙특산물산업화지역혁신센터) , 김경곤 (강원대학교 생명건강공학과) , 김태우 (강원대학교 강원웰빙특산물산업화지역혁신센터) , 최면 (강원대학교 생명건강공학과)

초록
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본 연구에는 항비만소재로 연구되어진 11종의 소재를 대상으로 lipoprotein lipase (LPL)의 억제효능을 확인하고자 배양배지내 LPL의 함량과 LPL 효소활성을 측정하였다. 그 결과 3T3-L1 adipocyte에서 LPL의 분비를 억제하는 소재로 능이추출물(NE)을 선택할 수 있었다. 선택된 NE의 폴리페놀과 플라보노이드 함량을 측정한 결과 $16.61{\pm}0.44mg/g$과 $6.58{\pm}0.01mg/g$이 각각 확인되었다. NE의 LPL 분비억제기작을 확인하기위해 먼저 세포내 LPL단백질의 함량과 mRNA 발현을 확인하였다. 그 결과 함량이 감소했던 배양배지와는 다르게 NE를 처리한 3T3-L1 adipocyte의 세포내 LPL은 유의하게 증가한 것을 확인할 수 있었으며 mRNA의 발현에는 영향이 없음을 관찰할 수 있었다. 이를 바탕으로 생성된 LPL 단백질의 exocytosis에 문제가 발생했을 것으로 유추하고 다양한 단백질 이동 관련 유전자의 발현을 확인하였다. 그 결과 LPL의 이동과 분해에 관여하여 세포내 LPL의 활성을 조절하는 것으로 알려진 SorLA의 발현이 증가하는 것을 확인하고 이를 조절하는 transcription factor의 발현과 nuclear로의 이동에 NE가 미치는 영향을 검토하였다. 그 결과 NE를 처리함으로써 SorLA promoter에 작용하는 $C/EBP{\beta}$의 단백질 발현이 nuclear에서 증가하는 것을 확인할 수 있었다. 본 연구를 통해 NE가 SorLA 유전자의 transcription factor인 $C/EBP{\beta}$의 단백질 발현을 nuclear에서 증가시킴으로서 결과적으로 LPL의 분비억제가 가능함을 확인할 수 있었으며 이는 NE의 항비만 효과기전을 설명하는 기초자료를 제공하는 것이라 사료된다.

Abstract ▼ AI-Helper

In this study, we evaluated the lipoprotein lipase (LPL) inhibitory activity of 11 water extracts derived from Cinnamomum cassia Blume, Sarcodon aspratus, Cordyceps militaris, Crataegus pinnatifida Bunge, Corni fructus, Allium cepa, Coix lacryma-jobi, Plantago asiatica L., Lentinus edodes, Rosa rugosa, and Foeniculum fructus. The results of the LPL secretion and activity assay showed Sarcodon aspratus (NE) extract have an LPL secretion inhibitory acitivity. The cause of reduction in LPL secretion after NE treatment was investigated using molecular biology methods. NE treatment affected the LPL content in cells, but did not affect LPL mRNA expression. It also increased the mRNA expression level of sortilin-related receptor LDLR class A (SorLA), a receptor that induces endocytosis and intracellular trafficking of LPL. Finally, cell fractionation revealed that NE treatment induced the expression of CCAAT-enhancer-binding protein beta ($C/EBP{\beta}$), a SorLA transcription factor, in the nuclei of 3T3-L1 adipocytes. These results show that NE's anti-obesity effect involves inhibition of LPL secretion through $C/EBP{\beta}$-mediated induction of SorLA expression.

주제어

AI 본문요약
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문제 정의

1에서 보여준 LPL의 분비량 감소와 다른 결과이며, 세포 내 생성된 LPL이 분비되지 못하고 세포내에 축적된 것임을 유추할 수 있다. 따라서 세포 내 LPL 단백질의 축적원인을 찾고자 다음 실험을 수행하였다.
본 연구에는 항비만소재로 연구되어진 11종의 소재를 대상으로 lipoprotein lipase (LPL)의 억제효능을 확인하고자 배양배지내 LPL의 함량과 LPL 효소활성을 측정하였다. 그 결과 3T3-L1 adipocyte에서 LPL의 분비를 억제하는 소재로 능이 추출물(NE)을 선택할 수 있었다.
본 연구에서는 항비만효능이 알려진 계피, 능이, 동충하초, 산사, 산수유, 양파, 율무, 차전자, 탱자, 표고버섯, 해당근, 회향종자를 이용하여 LPL 억제효능을 평가하고 효과적인 LPL억제제를선별하여 항비만 기능성 식품개발의 기초자료를 제공하고자 한다.

제안 방법

3T3-L1 세포의 분화유도는 Oh 둥(23)의 방법을 응용하여 수행하였다. 3T3-L1 세포는 10% calf serum을 포함하는 Dulbeccos modified Eagles medium (DMEM) 배지에 100 U/mL penicillin과 100 _μg/mL streptomycin을 첨가하여 5% CO 37oC에서 배양, 유지하였다.
3T3-L1 지방세포의 lipoprotein lipase (LPL) 단백질 함량은 Feng 둥(24)의 연구를 참고하여 mouse LPL ELISA kit (Cusabio, Wuhan, China)를 이용하였으며 각 추출소재 0.25mg/mL을 24시간 처리한 지방세포의 배양배지와 단백질 추출액에서 측정하였다. 배양배지는 3T3-L1 지방세포를 분화완료한 후 10% FBS가함유된 DMEM 배지에서 소재를 24시간 처리한 후 배지만 회수하여 4oC, 12,000xg에서 10분간 원심분리하여 상등액만 사용하였으며, 3T3-L1 지방세포 단백질 추출물은 소재를 24시간 처리한후 cooling된 PBS로 3회 세척하고 세포를 회수한 후 4oC, 1, 000xg에서 5분간 원심분리하고 PBS를 제거한 후 RIPA buffer (50 mM Tris (pH 8.
3T3-L1 지방세포의 분획단백질은 소재처리가 완료된 세포를 cooling된 PBS로 3회 세척하고 trypsinize한 후 튜브로 세포를 옮기고 PBS로 추가 1회 세척한 후 원심분리(500xg, 5min)를 통해세포를 모은 후 cell fractionation kit (Cell signaling technology, Tokyo, Japan)의 사용방법에 따라 세포 분획을 진행하였다. 즉, 세포가 담긴 tube에 250 pL의 cytoplasm isolation buffer롤 넣고 5초동안 vortexing한 후 ice에 5분 동안 정치하였다.
3T3-L1 세포는 10% calf serum을 포함하는 Dulbeccos modified Eagles medium (DMEM) 배지에 100 U/mL penicillin과 100 _μg/mL streptomycin을 첨가하여 5% CO 37oC에서 배양, 유지하였다. 3T3-L1 지방전구세포의 지방세포로의 분화를 위해 6 well plate에 5x105 cell/well의 세포를 분주하여 세포가 완전히 밀집되게 배양하고, 2일을 더 배양한 후 MDI (0.5mM 3-isobutyl- 1 -methylxanthine (IBMX), 1 _μM dexamethasone, 10 _μg/mL insulin) solution, 및 10% fetal bovine serum (FBS)을 포함하는 DMEM배지에서 2 일 동안 배양함으로써 분화를 개시하였다. 그 다음 10 _μg/mL insulin 및 10% FBS를 포함하는 DMEM 배지로 교환하여 3일 동안 분화를 진행시켰다.
Fig. 1의 결과를 통해 LPL의 분비량이 NE에 의해 감소되는 것을 확인한 바 있어 그 원인이 mRNA 발현 조절에 있는지 확인하기 위해 세포 내 LPL mRNA 발현을 RT-PCR을 통해 확인하였다. 그 결과 Fig.
1% diethylpyrocarbornate (DEPC) water를 995 pL를 첨가하여 260nm에서 흡광도를 측정하여 total RNA양을 정량하였다. First strand cDNA를 합성하기 위하여 AmfiRiert Platinum cDNA snythesis Master Mix (GenDEPOT, Barker, TX,USA)를 이용하였으며 제공된 방법에 따라 추출한 RNA (2 pg)와 RNase fee water로 9 pL을 맞추고 70oC에서 5분간 반응시 킨 후 2x cDNA synthesis buffer 10 pL, cDNA synthsis Enzyme Mix 1 pL를 섞어 11 pL씩 각 PCR tube에 더한 후 25oC에서 5분, 42oC에서 60분, 70oC에서 15분간 반응시켜 cDNA를 합성하였다. 중합효소연쇄반응(polymerase 사lain reaction, PCR)은 Go Tag Green Master (Promega, Madison, WI, USA) 10 pL, forward primer (10 pmole) 와 reverse primer (10 pmole)를 각각 1 pL, nuclease free water 7 pL, 합성한 first-stand cDNA 1 pL를 첨가하여 잘 섞은 후 실행하였으며 각각의 primer는 Table 2와 같다.
세척 후 well 당 50 pL의 lipase assay buffer을 첨가하여 반응에 필요한 volume을 맞춘 후 lipase activity assay kit제조사에서 제공하는 방법에 따라 실험을 수행하였다. Lipase activity는 milliunit/mL 단위로 계산한 후 활성 비교를 위해 대조군을 기준으로 백분율(%)로 계산하였다.
Lipase 활성은 mouse LPL antibody가 pre-coating된 96 well plate와 lipase activity assay kit (Sigma-aldrich, St. Louis, MO,USA)를 이용하여 측정하였다. 실험에 사용된 단백질 추출액은, 5일 동안 3T3-L1 지방세포 분화를 유도하고 DMEM배지에서 추가 2일간 배양한 세포를 PBS로 2회 세척 후 activity assay kit 제품에서 제공하는 ice-cold lipase assay buffer를 4 volume 가하여 4oC에서 homogenizing한 후 4oC, 13, 000xg에서 10분 동안 원심분리하고 상층액을 분리하여 준비하였다.
01 mgg 이 각각 확인되었다. Ng LPL 분비억제기작을 확인하기위해 먼저 세포 내 LPL 단백질의 함량과 mRNA 발현을 확인하였다. 그 결과 함량이 감소했던 배양배지와는 다르게 NE를 처리한 3T3-L1 adipocyte의 세포 내 LPLe 유의하게 증가한 것을 확인할 수 있었으며 mRNA 의 발현에는 영향이 없음을 관찰할 수 있었다.
중합효소연쇄반응(polymerase 사lain reaction, PCR)은 Go Tag Green Master (Promega, Madison, WI, USA) 10 pL, forward primer (10 pmole) 와 reverse primer (10 pmole)를 각각 1 pL, nuclease free water 7 pL, 합성한 first-stand cDNA 1 pL를 첨가하여 잘 섞은 후 실행하였으며 각각의 primer는 Table 2와 같다. PCR 산물은 0.002% ethidium bromide가 첨가한 1% agarose gel에 100 V에서 20분간 전기영동 후 UV 광으로 유전자 발현 정도를 알아보았다. 그 밴드의 강도는 imageJ (National Institutes of Health, Bethesda, MD, USA) 소프트웨어를 이용하여 분석 정량하였다.
SorLA의 발현에 NE가 미치는 영향을 확인하기 위해 SorLA의 promoter 정보를 검토하였다. 그 결과 Hirayama 등(41)의 연구에서 transcription factor인 activator protein 1 (AP-1), CCAAT- enhancer-binding proteins (C/EBP)p, Hepatocyte nuclear factor (HNF)-5가 SorLA promoter에 작용할 수 있음을 확인할 수 있었다.
이를 바탕으로 생성된 LPL 단백질의 exocytosis에 문제가 발생했을 것으로 유추하고 다양한 단백질 이동 관련 유전자의 발현을 확인하였다. 그 결과 LPL의 이동과 분해에 관여하여 세포 내 LPL의 활성을 조절하는 것으로 알려진 SorLA의 발현이 증가하는 것을 확인하고 이를 조절하는 transcription factor의 발현과 nuclear로의 이동에 NE 가 미치는 영향을 검토하였다. 그 결과 NE를 처리함으로써 SorLA promoter에 작용하는 C/EBPp의 단백질 발현이 nuclear에서 증가하는 것을 확인할 수 있었다.
그 결과 Hirayama 등(41)의 연구에서 transcription factor인 activator protein 1 (AP-1), CCAAT- enhancer-binding proteins (C/EBP)p, Hepatocyte nuclear factor (HNF)-5가 SorLA promoter에 작용할 수 있음을 확인할 수 있었다. 그 중 간세포에서 작용하는 HNF-5를 제외한 PEA-1, C/EBPp 의 mRNA발현을 RT-PCR을 통해 확인하였다(data not shown). 그결과 Fig.
1% Tween 20과 5% skim milk를 함유한 Tris-buffered saline (TBS)에 2시간 동안 blocking 하였다. 그 후 C/EBPp (500:1) 1차 antibody (Santa Cruz Biotechnology, Santa Cruz, CA, USA)가 첨가된 buffer에서 1 시간 동안 반응하고 TBS-T (TBS containing 0.1% tween-20)로 5분 단위로 3차례에 걸쳐 세척하였다. 그런 다음 membranee 2차 anti-rabbit IgG conjugates horseradish peroxidase antibody (Santa Cruz Biotechnology, Santa Cruz, CA, USA)가 첨가된 buffer (2,000:1)를 넣고 상온에서 1시간 동안 반응한 후 다시 5분단위로 3차례에 걸쳐 세척하였다.
주요 기능을 하는 것으로 알려져 있다(26). 그러므로 LPL 의 억제를 통해 항비만 효과를 나타내는 천연소재를 탐색하고자 11종의 항비만 소재를 연구논문을 바탕으로 선별하고 그 중 LPL 의 분비 및 활성 조절에 영향을 미치는 소재의 선별을 위해 스크린을 수행하였다. 3T3-L1 세포를 분화하여 adipocyte를 생성한 후 11종의 소재를 각각 처리하였을 때 배양배지에 분비되는 LPL 의 함량을 ELISA방법을 이용하여 측정하였다.
25mg/mL을 24시간 처리한 지방세포의 배양배지와 단백질 추출액에서 측정하였다. 배양배지는 3T3-L1 지방세포를 분화완료한 후 10% FBS가함유된 DMEM 배지에서 소재를 24시간 처리한 후 배지만 회수하여 4oC, 12,000xg에서 10분간 원심분리하여 상등액만 사용하였으며, 3T3-L1 지방세포 단백질 추출물은 소재를 24시간 처리한후 cooling된 PBS로 3회 세척하고 세포를 회수한 후 4oC, 1, 000xg에서 5분간 원심분리하고 PBS를 제거한 후 RIPA buffer (50 mM Tris (pH 8.0), 150 mM NaCl, 0.1% SDS (m/v), 0.5% deoxycholic acid (m/v), 1% Triton X-100 (v/v), 1 mM PMSF, protease inhibitor coctail)를 가하여 4oC, 30분간 반응시킨 후 2분동안 vortexing하고 4oC, 15,000xg에서 15분 동안 원심분리하여상등액을 새 튜브로 옮겨 준비하였다. LPL ELISA assay 방법은 commercial ki에서 제공하는 ELISA protoc이을 따랐다.
61%)의 경우 adipo- cyte군에 비해 높은 증가량을 나타내었다. 배지에 분비된 LPL의 함량은 활성을 측정하기에는 미량이어서 3T3-L1 adipocyte 추출단백질을 이용하여 활성을 측정하였다. 동일 양의 LPL 단백질이 결합된 plate에 각각의 소재를 30분간 처리한 후 활성의 변화를 측정한 결과, Fig.
분화 완료한 3T3-L1 지방세포에 6시간, 12시간 동안 0.05, 0.1,0.25 mg/mL 농도의 소재를 처리한 후 배양배지를 제거하고 QIAzollysis buffer (Qiagen, MD, USA)를 이용하여 제조사에서 제공하는 방법에 따라 total RNA를 분리하였다. Nuclease free water에 녹인 후 RNA 5 pL에 0.
그 다음 10 _μg/mL insulin 및 10% FBS를 포함하는 DMEM 배지로 교환하여 3일 동안 분화를 진행시켰다. 소재는 분화가 완료된 5일째부터 24시간동안 처리하였다.
41%)는 활성증가효과를 나타내었다. 실험결과를 바탕으로 LPL의 함량 또는 활성을 증가시키거나 영향을 미치지 않는 소재는 탈락시키고, LPL저해 소재로 분비억제기능이 우수하지만 효소활성에는 영향을 미치지 못한 NE를 선택하였다. 해당근 (HDG)은 효소활성 억제기능은 우수하였으나 분비량을 증가시키는 것이 관찰되어 소재로 선택하지 않았다.
또한 SorLA의 발현이 LPL의 세포 내 분포를 변화시키고, lysosome 으로 운반하여 분해함으로써 LPL의 활성을 조절한다고 보고되어있다(40). 이러한 연구결과들을 바탕으로 vSNARE, Rab3A, Sortilin 및 SorLA의 발현변화에 NE/가 미치는 영향을 RT-PCR을 통해 확인하였다. 그 결과 Fig.
그 결과 함량이 감소했던 배양배지와는 다르게 NE를 처리한 3T3-L1 adipocyte의 세포 내 LPLe 유의하게 증가한 것을 확인할 수 있었으며 mRNA 의 발현에는 영향이 없음을 관찰할 수 있었다. 이를 바탕으로 생성된 LPL 단백질의 exocytosis에 문제가 발생했을 것으로 유추하고 다양한 단백질 이동 관련 유전자의 발현을 확인하였다. 그 결과 LPL의 이동과 분해에 관여하여 세포 내 LPL의 활성을 조절하는 것으로 알려진 SorLA의 발현이 증가하는 것을 확인하고 이를 조절하는 transcription factor의 발현과 nuclear로의 이동에 NE 가 미치는 영향을 검토하였다.
항산화활성을 확인하기 위해 2, 2-diphenyl-1-picrylhydrazyl (DPPH) 라디칼 소거능, 2, 2'-azino-bis (3-ethylbenzthiazoline-6-sulfonic acid) diammonium (ABTS) 라디칼 소거능, 환원력, superoxide dismutase (SOD) 유사활성을 측정하였다. 그 결과는 Table 3에 정리된바와 같이 2.

대상 데이터

본 실험에 사용된 약용식물은 Table 1과 같다. 11종의 소재들은 춘천시 소재 건재상에서 국내산 재료로 구입하여 수세한 후 10배 증류수를 가하여 60oC에서 24시간 교반하여 추출하였다. 추출한 소재는 3, 000xg에서 30분간 원심분리하여 상층액을 여과한 후 실온에서 방냉한 뒤, 감압농축기 (Eyela SB-1000, Tokyo, Japan) 로 농축하고 동결건조기 (FD 8508, Ilshin, Ulsan, Korea)를 이용하여 건조한 후 필요한 농도로 증류수에 희석하여 실험에 사용하였다.
Louis, MO,USA)를 이용하여 측정하였다. 실험에 사용된 단백질 추출액은, 5일 동안 3T3-L1 지방세포 분화를 유도하고 DMEM배지에서 추가 2일간 배양한 세포를 PBS로 2회 세척 후 activity assay kit 제품에서 제공하는 ice-cold lipase assay buffer를 4 volume 가하여 4oC에서 homogenizing한 후 4oC, 13, 000xg에서 10분 동안 원심분리하고 상층액을 분리하여 준비하였다. 준비된 단백질 sample을 LPL antibody가 pre-coating된 96 well plate에 100 pL씩 분주한 후 3시간동안 정치하였다.

데이터처리

002% ethidium bromide가 첨가한 1% agarose gel에 100 V에서 20분간 전기영동 후 UV 광으로 유전자 발현 정도를 알아보았다. 그 밴드의 강도는 imageJ (National Institutes of Health, Bethesda, MD, USA) 소프트웨어를 이용하여 분석 정량하였다.
발색은 enhanced chemiluminescence method를 이용하여 x-ray 필름에 감광시켰다. 그 밴드의 강도는 imageJ (National institutes of health, Bethesda, MD, USA)소프트웨어를 이용하여 분석 정량하였다.
실험에서 얻어진 결과의 통계적 유의성은 SPSS (Statitical Package for Social Sciences) program을 이용하여 mean士SD로 표시하였고, one-way ANOVA test 후 Duncans multiple range test에의해 p<0.05 수준에서 각 실험군 간의 유의성을 검증하였다.

이론/모형

그러므로 LPL 의 억제를 통해 항비만 효과를 나타내는 천연소재를 탐색하고자 11종의 항비만 소재를 연구논문을 바탕으로 선별하고 그 중 LPL 의 분비 및 활성 조절에 영향을 미치는 소재의 선별을 위해 스크린을 수행하였다. 3T3-L1 세포를 분화하여 adipocyte를 생성한 후 11종의 소재를 각각 처리하였을 때 배양배지에 분비되는 LPL 의 함량을 ELISA방법을 이용하여 측정하였다. 그 결과 Fig.
5% deoxycholic acid (m/v), 1% Triton X-100 (v/v), 1 mM PMSF, protease inhibitor coctail)를 가하여 4oC, 30분간 반응시킨 후 2분동안 vortexing하고 4oC, 15,000xg에서 15분 동안 원심분리하여상등액을 새 튜브로 옮겨 준비하였다. LPL ELISA assay 방법은 commercial ki에서 제공하는 ELISA protoc이을 따랐다. 즉, mouse LPL antibody가 pre-coating처리된 96 well plate에 배지 sample 100또는 추출단백질 sample 50 _μg/100 을 넣어 2시간동안정치하였다.
그런 다음 membranee 2차 anti-rabbit IgG conjugates horseradish peroxidase antibody (Santa Cruz Biotechnology, Santa Cruz, CA, USA)가 첨가된 buffer (2,000:1)를 넣고 상온에서 1시간 동안 반응한 후 다시 5분단위로 3차례에 걸쳐 세척하였다. 발색은 enhanced chemiluminescence method를 이용하여 x-ray 필름에 감광시켰다. 그 밴드의 강도는 imageJ (National institutes of health, Bethesda, MD, USA)소프트웨어를 이용하여 분석 정량하였다.
25mg/mL)를 30분간 상온에서 반응시 킨 후 washing buffer (200 pL)로 3회 세척 하였다. 세척 후 well 당 50 pL의 lipase assay buffer을 첨가하여 반응에 필요한 volume을 맞춘 후 lipase activity assay kit제조사에서 제공하는 방법에 따라 실험을 수행하였다. Lipase activity는 milliunit/mL 단위로 계산한 후 활성 비교를 위해 대조군을 기준으로 백분율(%)로 계산하였다.
소재의 항산화활성은 Lee 둥(25)이 사용한 동일한 조건과 방법으로 수행하였다.
종 polyphenol 및 flavonoid의 함량은 Lee 둥(25)이 사용한 동일한 조건에서 수행하였다.

성능/효과

Galic acid와 quercetin을 폴리페놀과 플라보노이드의 표준물질로 각각 사용하여 NE의 총 폴리페놀과 총 플라보노이드의 함량을 측정한 결과 16.61, 6.58mg/g의 함량이 각각 확인되었다. 이 결과는 Lee 등(32)이 보고한 폴리페놀함량(16.
함량과 LPL 효소활성을 측정하였다. 그 결과 3T3-L1 adipocyte에서 LPL의 분비를 억제하는 소재로 능이 추출물(NE)을 선택할 수 있었다. 선택된 NE의 폴리페놀과 플라보노이드 함량을 측정한 결과 16.
3T3-L1 세포를 분화하여 adipocyte를 생성한 후 11종의 소재를 각각 처리하였을 때 배양배지에 분비되는 LPL 의 함량을 ELISA방법을 이용하여 측정하였다. 그 결과 Fig. 1A 에 정리된 바와 같이 0.25 mg/mL 능이추출물(NE)을 24시간 처리한 군(58.34%)에서 소재를 처리하지 않은 adipocyte 군(100%)과 비교하였을 때 유의한 수준으로 감소하는 것을 확인할 수 있었다. 반면 해당근(HDG, 192%)과 계피(GP, 243.
이러한 연구결과들을 바탕으로 vSNARE, Rab3A, Sortilin 및 SorLA의 발현변화에 NE/가 미치는 영향을 RT-PCR을 통해 확인하였다. 그 결과 Fig. 3A에 정리된 바와 같이 vSNARE, Rab3A, Sortilin는 NE의 농도별, 시간별 처리에 따라 변화가 관찰되지 않은 반면 SorLA는 Ng 처리농도 및 시간에 따라 발현이 변화하는 것을 관찰할 수 있었다. 즉, 소재를 처리하지 않은 adipocyte 군(1 fold)과 비교하였을 때 6시간 처리군에서 0.
그 결과 LPL의 이동과 분해에 관여하여 세포 내 LPL의 활성을 조절하는 것으로 알려진 SorLA의 발현이 증가하는 것을 확인하고 이를 조절하는 transcription factor의 발현과 nuclear로의 이동에 NE 가 미치는 영향을 검토하였다. 그 결과 NE를 처리함으로써 SorLA promoter에 작용하는 C/EBPp의 단백질 발현이 nuclear에서 증가하는 것을 확인할 수 있었다. 본 연구를 통해 NE가 SorLA 유전자의 transcription factor인 C/EBPp의 단백질 발현을 nuclear에서 증가시킴으로서 결과적으로 LPL의 분비억제가 가능함을 확인할 수 있었으며 이는 NE의 항비만 효과기전을 설명하는 기초자료를 제공하는 것이라 사료된다.
Ng LPL 분비억제기작을 확인하기위해 먼저 세포 내 LPL 단백질의 함량과 mRNA 발현을 확인하였다. 그 결과 함량이 감소했던 배양배지와는 다르게 NE를 처리한 3T3-L1 adipocyte의 세포 내 LPLe 유의하게 증가한 것을 확인할 수 있었으며 mRNA 의 발현에는 영향이 없음을 관찰할 수 있었다. 이를 바탕으로 생성된 LPL 단백질의 exocytosis에 문제가 발생했을 것으로 유추하고 다양한 단백질 이동 관련 유전자의 발현을 확인하였다.
(SOD) 유사활성을 측정하였다. 그 결과는 Table 3에 정리된바와 같이 2.86, 4.09, 3.73, 11.39 mg/mL의 IC₅₍값을 구할 수 있 _었으며 이는 controls _사용된ascorbic acid_{의 약}1/50-1/100_{에 해}당하는 값으로 비교적 낮은 항산화 활성을 확인할 수 있었다. 항산화 활성은 비만에 의해 유도된 활성산소종과 산화스트레스를감소시키는 것으로 잘 보고되어 있지만(4) 본 실험의 NE는 항산화활성이 낮아 비만에 의한 활성산소종 및 산화스트레스 감소에는 효과가 적을 것으로 판단된다.
그 중 간세포에서 작용하는 HNF-5를 제외한 PEA-1, C/EBPp 의 mRNA발현을 RT-PCR을 통해 확인하였다(data not shown). 그결과 Fig. 4A에 정리한 바와 같이 C/EBPp만이 NE 처리에 의해 발현이 변화되는 것을 확인할 수 있었다. 이를 바탕으로 C/EBPp 단백질 발현을 확인한 결과 Fig.
배지에 분비된 LPL의 함량은 활성을 측정하기에는 미량이어서 3T3-L1 adipocyte 추출단백질을 이용하여 활성을 측정하였다. 동일 양의 LPL 단백질이 결합된 plate에 각각의 소재를 30분간 처리한 후 활성의 변화를 측정한 결과, Fig. 1B에 정리된 바와 같이 해당근(HDG, 77.71%) 은 adipocyte군(100%)와 비교하여 유의한 수준의 활성 억제 효과를 나타내었으며 차전자(CJJ, 120.73%), 산수유(SSY, 123%), 계피 (GP, 135.30%), 산사(SS, 140.41%)는 활성증가효과를 나타내었다. 실험결과를 바탕으로 LPL의 함량 또는 활성을 증가시키거나 영향을 미치지 않는 소재는 탈락시키고, LPL저해 소재로 분비억제기능이 우수하지만 효소활성에는 영향을 미치지 못한 NE를 선택하였다.
이를 통해 처리된 NE는 LPL의 유전자 발현에는 영향을 미치지 못하는 것을 확인할 수 있었다. 또한 세포 내 LPL 단백질의 함량을 ELISA assay 를 통해 확인한 결과 preadipocyte군에 함유된 LPL 단백질 (59.62%)이 adipocyte군(100%)에서 유의하게 증가한 것을 확인할 수 있었으며 또한 0.25 mg/mL의 NE를 처리한 3T3-L1 adipocyte (119.33%)에서 소재를 처리하지 않은 adipocyte군보다 유의하게 LPL단백질이 증가한 것이 관찰되었다. 이는 Fig.
그 결과 NE를 처리함으로써 SorLA promoter에 작용하는 C/EBPp의 단백질 발현이 nuclear에서 증가하는 것을 확인할 수 있었다. 본 연구를 통해 NE가 SorLA 유전자의 transcription factor인 C/EBPp의 단백질 발현을 nuclear에서 증가시킴으로서 결과적으로 LPL의 분비억제가 가능함을 확인할 수 있었으며 이는 NE의 항비만 효과기전을 설명하는 기초자료를 제공하는 것이라 사료된다.
그 결과 3T3-L1 adipocyte에서 LPL의 분비를 억제하는 소재로 능이 추출물(NE)을 선택할 수 있었다. 선택된 NE의 폴리페놀과 플라보노이드 함량을 측정한 결과 16.61±0.44 mg/g과 6.58±0.01 mgg 이 각각 확인되었다. Ng LPL 분비억제기작을 확인하기위해 먼저 세포 내 LPL 단백질의 함량과 mRNA 발현을 확인하였다.
4A에 정리한 바와 같이 C/EBPp만이 NE 처리에 의해 발현이 변화되는 것을 확인할 수 있었다. 이를 바탕으로 C/EBPp 단백질 발현을 확인한 결과 Fig. 4B에 정리된 바와 같이 NE 처리 전에 cytos이에 더 많은 양이 존재하던 C/EBPp 단백질이 NE 0.25 mg/mL을 6시간 처리한 후 nuclear에 더 많이 분포하는 것을 확인할 수 있었다. 이를 통해 Ng 처리가 SorLA promoter에 작용이 가능한 C/EBPp 단백질을 nuclear로 유도하여 SorLA의 mRNA 발현을 유도함으로써 증가된 SorLA가 LPL과 결합하여 endocytic activity증가 또는 lysosome으로 운반하여 LPL을 분해함으로써 LPL의 분비 및 활성감소를 유도하는 것으로 유추할 수 있었다.
1 fold) 농도의 NE 처리가 더욱 높은 SorLA mRNA 발현을 유도하는 것이 관찰되었다. 이를 통해 NE의 처리가 SorLA의 발현을 유도하여 endocytic activity 증가를 통한 LPL의 분비감소와 세포 내 LPL의 분해에 관여함을 유추할 수 있었다. 그러나 구체적인 SorLA 단백질과 LPL의 결합과 이동에 NE가 미치는 영향에 대한 연구가 추가적으로 진행되어야 할 것으로 판단된다.
25 mg/mL을 6시간 처리한 후 nuclear에 더 많이 분포하는 것을 확인할 수 있었다. 이를 통해 Ng 처리가 SorLA promoter에 작용이 가능한 C/EBPp 단백질을 nuclear로 유도하여 SorLA의 mRNA 발현을 유도함으로써 증가된 SorLA가 LPL과 결합하여 endocytic activity증가 또는 lysosome으로 운반하여 LPL을 분해함으로써 LPL의 분비 및 활성감소를 유도하는 것으로 유추할 수 있었다. 그러나 구체적인 promoter 조절기전에 대한 실험이 추가되어야 할 것으로 판단된다.
2A에서 보는 바와 같이 소재의 농도별, 시간별 처리에 따른 발현의 차이는 관찰되지 않았다. 이를 통해 처리된 NE는 LPL의 유전자 발현에는 영향을 미치지 못하는 것을 확인할 수 있었다. 또한 세포 내 LPL 단백질의 함량을 ELISA assay 를 통해 확인한 결과 preadipocyte군에 함유된 LPL 단백질 (59.
3A에 정리된 바와 같이 vSNARE, Rab3A, Sortilin는 NE의 농도별, 시간별 처리에 따라 변화가 관찰되지 않은 반면 SorLA는 Ng 처리농도 및 시간에 따라 발현이 변화하는 것을 관찰할 수 있었다. 즉, 소재를 처리하지 않은 adipocyte 군(1 fold)과 비교하였을 때 6시간 처리군에서 0.1 mg/mL (1.5 fold)과 0.25 mg/mL (1.5 fold) 농도의 NE 처리가 유의한 SorLA mRNA의 발현을 유도하였으며 , 12시간 처 리군에서 0.25 mg/mL (2.1 fold) 농도의 NE 처리가 더욱 높은 SorLA mRNA 발현을 유도하는 것이 관찰되었다. 이를 통해 NE의 처리가 SorLA의 발현을 유도하여 endocytic activity 증가를 통한 LPL의 분비감소와 세포 내 LPL의 분해에 관여함을 유추할 수 있었다.
39 mg/mL의 IC₅₍값을 구할 수 있 _었으며 이는 controls _사용된ascorbic acid_{의 약}1/50-1/100_{에 해}당하는 값으로 비교적 낮은 항산화 활성을 확인할 수 있었다. 항산화 활성은 비만에 의해 유도된 활성산소종과 산화스트레스를감소시키는 것으로 잘 보고되어 있지만(4) 본 실험의 NE는 항산화활성이 낮아 비만에 의한 활성산소종 및 산화스트레스 감소에는 효과가 적을 것으로 판단된다.

후속연구

이를 통해 NE의 처리가 SorLA의 발현을 유도하여 endocytic activity 증가를 통한 LPL의 분비감소와 세포 내 LPL의 분해에 관여함을 유추할 수 있었다. 그러나 구체적인 SorLA 단백질과 LPL의 결합과 이동에 NE가 미치는 영향에 대한 연구가 추가적으로 진행되어야 할 것으로 판단된다.

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표제어: PCR

동의어: Packet Collision Rate

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용어 설명: PCR은 세균 특이성이 있는 primer를 이용하여 적은 수의 세균이 있을지라도 쉽게 검출할 수 있는 유용한 방법이며, 이를 이용하여 구강 내 치면세균막이나 타액에서 직접 세균을 검출할 수 있게 되었다[8].

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