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문제 정의
- 본 연구에서는 고추씨, 녹차씨, 들깨, 땅콩, 목화씨, 참깨, 호두, 홍화씨를 건강기능식품의 기능성 원료 분리 및 식용유지류 추출의 목적에 일반적으로 허용되는 헥산을 이용하여 기름을 추출한 후 구성 성분을 분석하고 3T3-L1 지방세포의 생리활성에 미치는 영향을 연구함으로써 식물성 유지를 이용한 기능성 식용유의 개발 및 산업화에 기초자료를 제공하고자 한다.
제안 방법
- 4 mg/mL 농도까지 유의한 수준의 독성이 관찰되지 않았다. 3T3-L1 세포를 이용하여 수행한 세포독성 시험을 바탕으로 모든 종실유에서 공통으로 세포독성이 관찰되지 않는 0.2 mg/mL 농도 이하에서 향후의 모든 실험을 수행하였다.
- Fatty acid 구성, 일반성분 및 품질측정이 완료된 8종의 종실유를 이용하여 3T3-L1 세포에 대한 세포독성을 cell counting kit(CCK)-8를 이용하여 시험하였다. 3T3-L1 세포에 종실유 및 용매인 dimethyl sulfoxide (DMSO)를 처리하지 않은 상태를 control로 하였으며, 종실유의 처리농도 증가에 따라 용매인 DMSO의 처리량이 증가하므로 대조군으로 종실유처리에 따라 증가된 DMSO의 함량만큼 세포에 DMSO만 처리한 군을 설정하였다. 이와 비교하여 종실유 8종을 각각 농도별로 처리한 실험군을 이용하여 독성시험을 수행한 결과는 Fig.
- 3T3-L1 지방전구세포의 지방 세포로의 분화를 위해 6 well plate에 5×105cell/well의 세포를 분주하여 세포가 완전히 밀집되게 배양하고, 2일을 더 배양한 후 MDI (0.5 mM 3-isobutyl-1-methylxanthine (IBMX), 0.5 µM dexamethasone, 10 µg/mL insulin) solution, 및 10% FBS 을 포함하는 DMEM 배지에서 2일 동안 배양함으로써 분화를 개시하였다.
- Fatty acid 구성, 일반성분 및 품질측정이 완료된 8종의 종실유를 이용하여 3T3-L1 세포에 대한 세포독성을 cell counting kit(CCK)-8를 이용하여 시험하였다. 3T3-L1 세포에 종실유 및 용매인 dimethyl sulfoxide (DMSO)를 처리하지 않은 상태를 control로 하였으며, 종실유의 처리농도 증가에 따라 용매인 DMSO의 처리량이 증가하므로 대조군으로 종실유처리에 따라 증가된 DMSO의 함량만큼 세포에 DMSO만 처리한 군을 설정하였다.
- 가열된 시료를 30-40°C의 수욕상에서 1-2분간 냉각하고 냉각된 시료에 촉매역할을 위해 14% BF-methanol (Supelco Inc, Bellefonte, PA, USA) 2 mL을 가한 뒤 충분히 vortex한 뒤 약 100°C 히팅블록에서 약 2분간 가열하였다.
- 그 다음 10 µg/mL insulin 및 10% FBS를 포함하는 DMEM 배지로 교환하여 3일 동안 분화를 진행시켰다.
- 24시간 후 배양 중인 배지(100 µL)에 CCK-8 reagent를 10 µL씩 가해주고 3시간 동안 37°C에서 배양한 후 microplate reader (EL808, BioTek, Winooski, USA)로 450 nm에서 흡광도를 측정하였다. 대조군(control)의 흡광도 값을 기준으로 세포독성을 비교하였다.
- Leptin은 지방세포로부터 분비되는 호르몬으로 혈중 leptin 농도는 체지방량에 비례하여 증가하며, 에너지 대사를 증가시키고 식이섭취량을 감소시켜 체중을 조절하는 것으로 알려져 있다(37). 본 실험에서는 3T3-L1세포를 이용하여 고추씨기름, 녹차씨기름, 들깨기름, 땅콩기름, 목화씨기름, 참깨기름, 호두기름, 홍화씨기름을 각각 0.05, 0.1 mg/mL를 처리한 후 방출되는 leptin의 함량을 배지에서 측정하였으며 그 결과는 Fig. 3와 같다. 종실유 0.
- 산화안정도를 측정하기 위하여 873 Biodiesel Rancimat (Metrohm, AG, Herisau, Switzerland)의 공기주입량을 20 L/h로 조정한 후 유지시료 3g을 reactive vessel에 취하여 100, 110, 120°C에서 공기를 주입하면서 산화시키고 이때 생성되는 산화물을 포집병에 증류수 60 mL를 넣고 흡수시켜 이의 conductivity를 자동 기록한 곡선으로부터 유도시간을 각각 측정하여 표시하였다.
- 유지 안전성 측정을 위한 active oxygen method (AOM)는 AOCS(American Oil Chemists’ Society)방법(21)을 응용하여 수행하였다.
- 1 건조감량법”에 기초하여 측정하였다(20). 적외선 수분 측정기(Hansung, Seoul, Korea)를 사용하여 분쇄된 원료 1-2 g을 칭량접시에 채취한 후 원료의 수분을 증발시켜 처음 시료와 건조 후 시료의 무게차를 측정하여 수분함량을 계산하였다.
- 종실유 8종의 fatty acid 구성을 GC/MS를 이용하여 37종의 fatty acid standard 혼합물의 pattern과 비교하여 확인하였다. 확인된 fatty acid들의 함량은 undecanoic acid의 양을 기준으로 계산한 후 상대적인 함량 비를 퍼센트로 환산하여 Table 1에 정리하였다.
- 지방산 표준용액은 지방산멜틸에스터 혼합(37종) 표준품 FAME Mix C4-C24 (Supelco Inc, Bellefonte, PA, USA) 100 mg을 isooctane 1 mL에 녹여 조제하였다. 지방산의 정량을 위해 gas chromatography (Agilent 6890N GC/FID, Agilent Technologies, Beijing, China)를 이용하였으며 지방산 37종의 머무름 순서를 확인하기 위해 GC/MSD (Agilent 5975C, Agilent Technologies, Santa Clara, CA, USA)를 이용하였다. 분석조건은 Table 1과 같다.
- 14%)이 월등히 높은 것으로 측정되었다. 추출된 종실유의 품질확인을 위해 AOM, 산가, 과산화물가, 검화가를 측정하였다. 일반성분과 함께 종실유의 품질 측정 결과는 Table 2에 정리된 바와 같다.
대상 데이터
- 고추씨는 충북 음성, 녹차씨는 경남 하동, 들깨와 참깨는 강원 홍천, 땅콩은 서울 경동시장, 목화씨는 강원 원주, 호두는 충북 영동, 홍화씨는 경남 함양에서 2013년 구매하였으며, 각각의 종실유는 550 g의 씨앗에 n-hexane 700 mL을 혼합 후 상온에서 30분 동안 초음파 추출기(5510E-DTH, Bransonic, Shelton, USA)를 이용하여 초음파 추출한 다음 그대로 24시간 침지 시킨 후 0.45 µm filter로 여과하고, Heidolph사(Schwabach, Germany)의 WB2000과 VU2000 모델 감압농축기를 이용하여 감압 농축함으로써 준비하였다.
- 45 µm filter로 여과하고, Heidolph사(Schwabach, Germany)의 WB2000과 VU2000 모델 감압농축기를 이용하여 감압 농축함으로써 준비하였다. 분리된 종실유의 추출율(%)은 씨앗 550 g 대비 고추씨기름 13.9%, 녹차씨기름 3.8%, 들깨기름 39%, 땅콩기름 63.2%, 면실유 17.1%, 참깨기름 25.2%, 호두기름 46.2%, 홍화씨기름 17.7%로 확인되었으며 dimethyl sulfoxide (DMSO)를 용매로 사용하여 20 mg/mL 농도로 stock solution을 제조한 후 실험에 사용하였다.
데이터처리
- Different superscripts in the same column (a-h) indicate significant differences (P<0.05) by Duncan’s multiple range test.
- 실험에서 얻어진 결과의 통계적 유의성은 SPSS (Statitical Package for Social Sciences) program을 이용하여 mean±SD로 표시하였고, One-way ANOVA test 후 Duncan’s multiple range test에 의해 p<0.05 수준에서 각 실험군 간의 유의성을 검증하였다.
이론/모형
- GC 분석을 위한 샘플의 fatty acid methyl ester화는 Watkins 등(19)의 방법을 이용하였다. 샘플 25 mg을 cap tube에 칭량하고 0.
- 방법은 commercial kit(Quantikine & Immunoassay Kit, R&D System, Minneapolis, MN, USA)에서 제공하는 ELISA protocol을 따랐다.
- 시료 중 지방산의 분석은 식품공전의 일반분석법 중 “1.1.5.4 지방산”에 기초한 gas chromatography법을 이용하여 지방산을 분석하였다(20).
- 원료 중 수분함량은 식품공전의 제9 일반시험법 중 “1.1.1.1 건조감량법”에 기초하여 측정하였다(20).
- 원료 중 조지방함량은 식품공전의 제9 일반시험법 중 “1.1.5.1.1 에테르추출법”에 기초하여 측정하였다(20).
- 일반시험법 중 “1.1.5.3.1 산가”에 기초하여 측정하였다(20).
- 일반시험법 중 “1.1.5.3.2 비누화가”에 기초하여 측정하였다(20).
- 일반시험법 중 “1.1.5.3.5 과산화물가”에 기초하여 측정하였다(20).
- 종실유 8종의 세포독성은 cell counting kit (CCK)-8 assay를 통해 확인하였다(22). 3T3-L1 세포를 96 well에 1.
- 지방세포에서 분비되어 배지에 함유된 leptin의 양은 ELISA assay 방법을 이용하여 측정하였다(24). 방법은 commercial kit(Quantikine & Immunoassay Kit, R&D System, Minneapolis, MN, USA)에서 제공하는 ELISA protocol을 따랐다.
성능/효과
- 2에 정리한 바와 같다. Adipocyte로 분화가 완료된 세포의 지방축적량을 나타내는 control 그룹과 adipocyte에 고추씨기름, 녹차씨기름, 들깨기름, 땅콩기름, 목화씨기름, 참깨기름, 호두기름, 홍화씨기름을 각각 0.05 mg/mL와 0.1 mg/mL를 처리한 그룹들을 비교한 결과 control (100%) 대비 고추씨 기름은 각각 약 67, 85%, 녹차씨기름은 79, 94%, 들깨기름은 63, 72%, 땅콩기름은 58, 68%, 목화씨기름은 89, 113%, 참깨기름은 93, 112%, 호두기름은 77, 79%, 홍화씨기름은 80, 78%까지 지방 적의 형성의 변화가 관찰되었다. 그중 고추씨기름 0.
- 8과(34) 유사한 값으로 그 값이 크면 지방산 사슬이 짧고 작으면 사슬이 길다는 것을 의미하지만 본 실험에 사용된 종실유 간에는 의미있는 차이가 없는 것으로 판단된다. 각 종실유에 따라 AOM, 산가, 과산화물가, 검화가의 차이가 관찰되지만 식품 및 식품가공에 잠재적으로 적합한 것을 확인할 수 있었다. 그러나 향후 지방정제 공정을 거친 후에도 화학적 시험분석 결과가 식품공전의 규격에 적합한지 여부는 추가시험 및 공정연구가 필요할 것이다.
- 고추씨, 녹차씨, 들깨, 땅콩, 목화씨, 참깨, 호두, 홍화씨의 수분 및 조지방을 측정한 결과 수분은 2.19-6.23%의 범위에서 측정되었고, 조지방은 13.66-62.14%의 범위에서 확인되었다. 수분은 목화씨에서 가장 높게 측정되었으며, 조지방은 호두씨에서 가장 높게 측정되었다.
- 1에 정리된 바와 같다. 고추씨기름, 녹차씨기름, 들깨기름, 땅콩기름, 목화씨기름, 참깨기름, 호두 기름 및 홍화씨기름을 각각 0.01, 0.05, 0.1, 0.2 mg/mL 그리고 0.4 mg/mL씩 처리하여 세포독성을 확인한 결과, 녹차씨기름, 땅콩기름, 목화씨기름, 참깨기름에서 최고농도인 0.4 mg/mL에서만 독성이 관찰되었다. 그러나 이 농도는 DMSO 대조군 시험의 함량별 세포독성과 동일한 형태를 보여, 종실유에 의한 독성보다 DMSO의 함량증가에 의한 독성으로 판단된다.
- 확인된 fatty acid들의 함량은 undecanoic acid의 양을 기준으로 계산한 후 상대적인 함량 비를 퍼센트로 환산하여 Table 1에 정리하였다. 그 결과, 종실유들의 주요 성분으로 palmitic acid, oleic acid 및 linoleic acid가 확인되었으며 함량에서도 과반을 차지하는 것이 관찰되었다. 특이하게 들깨기름에서는 linolenic acid (57.
- 1 mg/mL를 처리한 그룹들을 비교한 결과 control (100%) 대비 고추씨 기름은 각각 약 67, 85%, 녹차씨기름은 79, 94%, 들깨기름은 63, 72%, 땅콩기름은 58, 68%, 목화씨기름은 89, 113%, 참깨기름은 93, 112%, 호두기름은 77, 79%, 홍화씨기름은 80, 78%까지 지방 적의 형성의 변화가 관찰되었다. 그중 고추씨기름 0.05 mg/mL, 들깨기름 0.05, 0.1 mg/mL, 땅콩기름 0.05, 0.1 mg/mL을 처리하였을 때 control 대비 유의한 수준으로 지방구의 형성을 억제하는 것이 관찰되었다. 이는 Sessler 등(35)이 발표한 polyunsaturated fatty acid (arachidonic acid, linoleic acid 및 linolenic acid)에 의한 지방산합성효소인 stearoyl-CoA desaturase 1 유전자의 안정성 저해가 원인이 되어 triacylglycerol의 축적이 저해되기 때문으로 유추된다(36).
- 그러나 종실유에 의한 stearoyl-CoA desaturase 1 유전자 발현 및 안정성에 관한 연구가 필요할 뿐만 아니라 실험에 사용된 모든 소재가 linoleic acid를 다량 함유하고 있어 stearoyl-CoA desaturase 1 유전자의 안정성 저해 한가지만이 원인은 아닌 것으로 판단된다. 또한 농도의존적인 지방축적 억제효과는 관찰 되지 않았으며 오히려 농도가 증가할수록 지방축적 억제효과가 감소하는 것이 관찰되고 있어, 이는 유효 성분이 포함되어 있지만 종실유의 과량 섭취는 지방세포의 비대화를 유도할 수 있음을 보여준다.
- 14%의 범위에서 확인되었다. 수분은 목화씨에서 가장 높게 측정되었으며, 조지방은 호두씨에서 가장 높게 측정되었다. 측정된 값들은 Ku 등(30), Rah 등(31), Ji와 Jeong(32), 및 Lee와 Kim(33)의 결과에서 보고된 고추씨의 수분함량 2.
- 1 mg/mL을 처리한 결과, adipocyte control (100%) 대비 각각 고추씨기름 102, 119%, 녹차씨기름 107% 99%, 들깨기름 119, 110%, 땅콩기름 122, 136%, 목화씨기름 103, 106%, 참깨기름 139, 147%, 호두기름 111, 115%, 홍화씨기름 93, 114%를 확인할 수 있었다. 이 결과를 통해 고추씨기름, 들깨기름, 땅콩기름, 참깨기름, 호두기름, 홍화씨기름에서 control 대비 유의한 leptin 분비증가를 확인할 수 있었으며, 녹차씨기름과 목화씨기름에서는 leptin의 유의한 증가를 확인할 수 없었다. 지방축적을 억제한 고추씨기름, 들깨기름, 땅콩기름과 지방축적 감소경향을 보인 호두기름과 홍화씨기름에서의 leptin 분비량 증가는 식욕억제와 에너지대사 촉진을 통한 비만억제의 효과를 유추할 수 있는 결과로 판단되며, 참깨기름에서의 leptin 분비량 증가는 통계적으로 유의한 수준은 아니지만 지방세포가 지방을 축적하면서 비대해진 영향으로 leptin의 분비량이 증가한 것(38)으로 유추할 수 있다.
- 3와 같다. 종실유 0.05 mg/mL과 0.1 mg/mL을 처리한 결과, adipocyte control (100%) 대비 각각 고추씨기름 102, 119%, 녹차씨기름 107% 99%, 들깨기름 119, 110%, 땅콩기름 122, 136%, 목화씨기름 103, 106%, 참깨기름 139, 147%, 호두기름 111, 115%, 홍화씨기름 93, 114%를 확인할 수 있었다. 이 결과를 통해 고추씨기름, 들깨기름, 땅콩기름, 참깨기름, 호두기름, 홍화씨기름에서 control 대비 유의한 leptin 분비증가를 확인할 수 있었으며, 녹차씨기름과 목화씨기름에서는 leptin의 유의한 증가를 확인할 수 없었다.
- 일반성분과 함께 종실유의 품질 측정 결과는 Table 2에 정리된 바와 같다. 종실유 8종의 AOM에 의한 유지의 안정성을 평가한 결과 0.42-53시간의 범위에서 관찰되었으며 목화씨 기름이 0.42시간으로 가장 짧아 안정성이 떨어지는 것으로 측정되었으며 녹차씨기름이 53시간으로 가장 길게 관찰되어 안정성이 가장 좋은 것을 확인할 수 있었다. 산가는 0.
- 수분은 목화씨에서 가장 높게 측정되었으며, 조지방은 호두씨에서 가장 높게 측정되었다. 측정된 값들은 Ku 등(30), Rah 등(31), Ji와 Jeong(32), 및 Lee와 Kim(33)의 결과에서 보고된 고추씨의 수분함량 2.71-6.73%, 조지방 18.05-29.27%, 녹차씨의 수분함량 6.3%, 조지방 34.6%, 들깨의 수분함량 6.6%, 조지방 51.62%, 땅콩의 수분함량 4.0%, 조지방 42.8%, 목화씨의 수분함량 7.3%, 조지방 22.2% 참깨의 수분함량 4.78%, 조지방 45.41%, 홍화씨의 수분함량 7.2%, 조지방 34.8% 보다 수분함량과 조지방함량이 약간씩 낮은 것은 수확시기와 저장방법의 차이에 의해 충분히 발생할 수 있는 수준으로 판단된다. 호두의 수분과 조지방함량에 대한 측정 자료는 아직 논문에 보고된 바가 없으며 본 실험에 사용된 소재들 가운데 조지방의 함량(62.
- 8% 보다 수분함량과 조지방함량이 약간씩 낮은 것은 수확시기와 저장방법의 차이에 의해 충분히 발생할 수 있는 수준으로 판단된다. 호두의 수분과 조지방함량에 대한 측정 자료는 아직 논문에 보고된 바가 없으며 본 실험에 사용된 소재들 가운데 조지방의 함량(62.14%)이 월등히 높은 것으로 측정되었다. 추출된 종실유의 품질확인을 위해 AOM, 산가, 과산화물가, 검화가를 측정하였다.
후속연구
- 지방축적을 억제한 고추씨기름, 들깨기름, 땅콩기름과 지방축적 감소경향을 보인 호두기름과 홍화씨기름에서의 leptin 분비량 증가는 식욕억제와 에너지대사 촉진을 통한 비만억제의 효과를 유추할 수 있는 결과로 판단되며, 참깨기름에서의 leptin 분비량 증가는 통계적으로 유의한 수준은 아니지만 지방세포가 지방을 축적하면서 비대해진 영향으로 leptin의 분비량이 증가한 것(38)으로 유추할 수 있다. 그러나 참깨기름의 지방세포비대에 미치는 영향에서 유의성을 관찰하지 못한 만큼 leptin 분비에 관한 추가 연구가 필요할 것으로 판단된다. 식물성기름의 식욕억제에 관한 연구는 Pasman 등(39)과 Hughes 등(40)이 사람을 대상으로 잣기름의 섭취가 endogenous cholecystokinin과 glucagon like peptide-1의 증가를 유도하여 식욕을 억제할 수 있음을 보고한 바 있다.
- 각 종실유에 따라 AOM, 산가, 과산화물가, 검화가의 차이가 관찰되지만 식품 및 식품가공에 잠재적으로 적합한 것을 확인할 수 있었다. 그러나 향후 지방정제 공정을 거친 후에도 화학적 시험분석 결과가 식품공전의 규격에 적합한지 여부는 추가시험 및 공정연구가 필요할 것이다.
- 식물성기름의 식욕억제에 관한 연구는 Pasman 등(39)과 Hughes 등(40)이 사람을 대상으로 잣기름의 섭취가 endogenous cholecystokinin과 glucagon like peptide-1의 증가를 유도하여 식욕을 억제할 수 있음을 보고한 바 있다. 이는 종실유의 식욕억제 기능의 가능성과 함께 endogenous cholecystokinin과 glucagon like peptide-1의 증가에 미치는 영향 및 leptin의 분비유도에 대한 추가적인 연구가 필요함을 의미한다.
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