[논문]감귤피 효소적 추출물의 지방세포에서의 항비만 효과

장예빈; 강희주; 김주상; 이승홍

doi:10.9721/kjfst.2021.53.2.149

감귤피 효소적 추출물의 지방세포에서의 항비만 효과
Anti-obesity effects of an enzymatic extract of mandarin (Citrus unshiu) peel in 3T3-L1 adipocytes 원문보기

한국식품과학회지 = Korean journal of food science and technology, v.53 no.2, 2021년, pp.149 - 153

장예빈 (순천향대학교 의료과학과) , 강희주 ((주)일해) , 김주상 ((주)일해) , 이승홍 (순천향대학교 의료과학과)

초록
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본 연구는 감귤 가공공정 중에 발생하는 가공부산물인 감귤피의 산업적 이용성 및 유용성을 증대시키고자 효소적 추출법을 적용하여 추출물을 제조하고 항비만 활성을 측정하였다. 감귤피 효소적 추출물(MPCE)의 폴리페놀 함량은 이전의 연구에서 보고한 유기용매 추출물보다 높은 함량을 나타내었다. MPCE의 항비만 활성을 알아보기 위해 지방세포 분화억제에 미치는 영향을 확인한 결과 MPCE는 농도 의존적으로 지방세포의 분화 및 지방축적을 감소시켰으며 이는 세포독성에 의한 것이 아님을 세포생존율 측정을 통해 확인하였다. 또한 MPCE는 adipogenesis 관련 전사인자인 C/EBPα, SREBP-1, PPARγ, FABP4의 단백질 발현을 감소시켰다. 이러한 결과들을 통해 MPCE는 adipogenesis 관련 전사인자의 단백질 발현 억제하여 지방세포의 분화 및 지방축적을 억제하였으며, 이를 통해 항비만 효과를 나타낸다는 것을 확인하였다. 따라서 MPCE는 비만 예방 효능을 가진 기능성 식품 소재로서의 활용 가치가 있는 것으로 판단되며, 보다 명확한 항비만 효능을 확인하기 위해 추후 동물 실험 등에 대한 연구가 필요할 것으로 생각된다.

Abstract ▼ AI-Helper

Mandarin peel (MP) is a by-product of the processing of citrus juice or other products. This study aimed to investigate the potential anti-obesity effect of an enzymatic extract of MP on the inhibition of adipogenesis in 3T3-L1 adipocytes. The enzymatic extract (MPCE) was prepared using the commercial food-grade carbohydrase Celluclast. Lipid accumulation and triglyceride levels were significantly lower in MPCE-treated cells than in untreated cells. In addition, MPCE treatment reduced the protein expression levels of peroxisome proliferator-activated receptor-γ, CCAAT/enhancer-binding protein α, sterol regulatory element-binding protein 1, and fatty acid-binding protein 4. These results suggest that MPCE inhibits adipogenesis by downregulating the expression levels of adipogenesis-related proteins. Therefore, the current findings demonstrate that MPCE possesses potent anti-obesity properties and could be a potential ingredient in functional food industries.

주제어

표/그림 (3)

그림 Fig. 1. Effect of MPCE on cell viability of 3T3-L1 preadipocytes treated for 48 h. The cell viability was measured using an MTT assay. The values are expressed as the mean±SD in triplicate experiments.
그림 Fig. 2. The effect of MPCE on intracellular lipid accumulation in 3T3-L1 adipocytes. Lipid accumulation was determined by the measurement of Oil Red O staining (A) and triglyceride levels (B). The values are expressed as the mean±SD in triplicate experiments. Significant differences from the untreated group were identified at *p<0.05 and **p<0.01.
그림 Fig. 3. The effect of MPCE treatment on the expression of adipogenesis-specific proteins in 3T3-L1 adipocytes. The 3T3-L1 preadipocytes were incubated in differentiation medium with or without the indicated concentrations of MPCE for 8 days (from day 0 to day 8). Values are expressed as the mean±SD in triplicate experiments. Significant differences from the untreated group were identified at *p<0.05 and **p<0.01.

AI 본문요약
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문제 정의

따라서 본 연구에서는 감귤 가공공정 중에 대량 발생하는 가공부산물인 감귤피의 효과적인 산업적 이용 방안을 제시하기 위하여 식품용으로 상업화된 효소를 이용하여 감귤피 효소적 추출물을 제조하고, 이의 항비만 효과를 검증하여 비만예방 기능성 식품소재로서의 활용 가능성을 확인하고자 하였다.
최근 효소를 이용한 효소적 추출법은 천연물 유래 다양한 생리활성 물질을 효율적으로 추출하기 위해 적용되고 있으며 특히 열수 추출 또는 유기용매 추출법에 비해 높은 수율, 친환경적 추출, 생리활성 성분 및 활성 증진 등과 같은 많은 장점을 가진다고 보고되고 있다(Ko 등, 2010; Lee 등, 2012; Lee 등, 2015). 따라서 본연구에서는 감귤피의 산업적 이용성 및 유용성을 증대시키기 위하여 식품용으로 상업화된 효소를 적용하여 감귤피 효소적 추출물을 제조하였다. 감귤피 효소적 추출물의 추출 수율은 30.

제안 방법

배양하였다(Day-2). 2일 후 다음과 같이 8일 동안 2일 간격으로 배지를 교체하면서 분화를 유도하였다. 분화 시작(Day 0) 은분화 유도 배지(MDI: DMEM containing 1% penicillin-streptomy-cin, 10% FBS, 0.
3T3-L1 전구지방세포에서 MPCE가 adipogenesis 억제 활성이 있는지 확인하기 위하여 세포 내 지방 방울을 선택적으로 염색하는 ORO 염색을 실시하였으며 lipid accumulation (%)로 나타내었다. 분화가 완료된 3T3-L1 지방세포의 배지를 제거한 후 PBS 로 세척하고 10% formalin를 첨가하여 1시간 동안 세포를 고정하였다.
3T3-L1 전구지방세포에서 MPCE의 세포 독성과 실험에 사용할 적정 농도를 결정하기 위해 MTT assay를 실시하였다. 100-400 μg/mL의 농도로 MPCE를 처리한 후 48시간 후에 세포 생존율을 측정한 결과, 모든 처리 농도에서 세포 독성을 나타내지 않았다(Fig.
다시 10% FBS-DMEM 배지로 2일 간격으로 교체하여 4일동안 배양하여 지방전구세포 분화를 유도하였다(Day 8). MPCE의 지방전구세포 분화 억제 효과를 측정하기 위해 분화 유도 기간 동안(Day 0-6) 2일 간격으로 분화 유도 배지 교체와 함께 4회 농도별로 처리하였다.
상층액 TM의 단백질 농도를 Pierce BCA protein assay kit (Thermo Fisher Scientific, MD, USA)로 정량하여 30μg의 단백질을 10%의 sodium dodesyl sulfate polyacrylamide gel electrophoresis (SDS-PAGE)로 분리하고, nitrocellulose (NC) membrane으로 이동시켰다. NC membranee 5% nonfat dry milk 함유 TBS-T (25mM Tris-HCl, 137mM NaCl, 2.65mM KCl, 0.05% Tween 20, pH 7.4) 로 상온에서 2시간 동안 반응하여 비특이적인 단백질들에 대한 blocking을 실시하였다. 그 후, 1차 antibody (SREBP-1, FABP4,C/EBPα, PPARγ)를 blocking buffer 에 희석하여 4 C에서 TBS-T로 20분간 3회 세척한 후 2차 antibody를 blocking buffer에 희석하여 실온에서 반응시켰다. TBS-T로 20분간 3회 세척하고 ECL 용액(Amersham, Arlington Heights, Ⅱ., USA)에 반응시켜 단백질의 발현 정도를 FusionCaptAdvance FX7 program (Vilber Lourmat, Austraila) 분석하였다.
The effect of MPCE treatment on the expression of adipogenesis-specific proteins in 3T3-L1 adipocytes. The 3T3-L1 preadipocytes were incubated in differentiation medium with or without the indicated concentrations of MPCE for 8 days (from day 0 to day 8). Values are expressed as the mean±SD in triplicate experiments.
분화가 완료된 3T3-L1 지방세포의 배지를 제거한 후 PBS 로 세척하고 10% formalin를 첨가하여 1시간 동안 세포를 고정하였다. 고정한 세포를 증류수로 3회 세척 후 마지막으로 60% isopropanol로 세척하고 well을 완전히 건조시킨 후 ORO 용액(0.5 g in 100mL isopropanol)으로 2시간 동안 염색을 실시하였다. 이후 염색 용액을 완전히 제거하고 증류수로 4회 세척한 후 광학현미경(Olympus D970; Olympus Optical Co.
분화 시작 2일 후, insulin을 포함한 10% FBS-DMEM 배지로 교체(Day 2)하여 2일간 더 배양하였다. 다시 10% FBS-DMEM 배지로 2일 간격으로 교체하여 4일동안 배양하여 지방전구세포 분화를 유도하였다(Day 8). MPCE의 지방전구세포 분화 억제 효과를 측정하기 위해 분화 유도 기간 동안(Day 0-6) 2일 간격으로 분화 유도 배지 교체와 함께 4회 농도별로 처리하였다.
Oil red O 염색은 지방세포 내 축적된 지방을 붉은색으로의 염색을 통하여 지방의 축적 정도를 확인할 수 있다. 따라서 3T3-L1 전구지방세포에서 MPCE가 지방세포 분화 억제에 미치는 영향을 알아보기 위해 Oil red O 염색을 통해 확인하였다. Fig.
1). 따라서 본 실험에서는 세포 독성을 보이지 않은 400μg/mL 농도까지를 실험조건으로 설정하여 이후의 실험을 진행하였다.
5, 55 C)에서 24시간 동안 반응시켰다. 반응이 끝난 후 3, 000×g에서 20분간 원심분리하여 잔사를 제거한 상층액을 취한 후 감압여과하였고, 여과된 효소적 추출물은 100 C의 항온수조에서 10분간 가열하여 효소 반응 불활성화를 진행하였다. 이후 효소적 추출물은 동결건조 후 분말화하여 실험에 사용하였다.
25μM dexamethasone, 5μg/ mL insulin)로 교체한 후 2일 동안 배양하였다. 분화 시작 2일 후, insulin을 포함한 10% FBS-DMEM 배지로 교체(Day 2)하여 2일간 더 배양하였다. 다시 10% FBS-DMEM 배지로 2일 간격으로 교체하여 4일동안 배양하여 지방전구세포 분화를 유도하였다(Day 8).
세포 내 생성된 중성지방 함량은 commercial triglyceride colorimetric assay kit (Item No. 10010303, Cayman Chemical, MI, USA)를 이용하여 제조사에 매뉴얼에 따라 측정하였다.
열풍건조된 감귤피 분말 시료를 증류수에 넣고 시료 대비 효소 비율을 1%로 하여 상업용 당분해효소인 Celluclast (Novozyme Nordisk, Bagasvaerd, Denmark)를 첨가하여 효소의 반응 최적 조건(pH 4.5, 55 C)에서 24시간 동안 반응시켰다. 반응이 끝난 후 3, 000×g에서 20분간 원심분리하여 잔사를 제거한 상층액을 취한 후 감압여과하였고, 여과된 효소적 추출물은 100 C의 항온수조에서 10분간 가열하여 효소 반응 불활성화를 진행하였다.
5 g in 100mL isopropanol)으로 2시간 동안 염색을 실시하였다. 이후 염색 용액을 완전히 제거하고 증류수로 4회 세척한 후 광학현미경(Olympus D970; Olympus Optical Co., Tokyo, Japan)을통해 지방 생성 및 염색 정도를 확인하였다. 정량적 분석을 위하여 100% isopropanol을 가하여 염색된 Oil red O를 완전히 용해시킨 후 ELISA reader (Sunrise TW, Tecan Trading AG, Männe-dorf, Switzerland)를 이용하여 520nm에서 흡광도를 측정하였다.
, Tokyo, Japan)을통해 지방 생성 및 염색 정도를 확인하였다. 정량적 분석을 위하여 100% isopropanol을 가하여 염색된 Oil red O를 완전히 용해시킨 후 ELISA reader (Sunrise TW, Tecan Trading AG, Männe-dorf, Switzerland)를 이용하여 520nm에서 흡광도를 측정하였다.

대상 데이터

3T3-L1 지방전구세포를 배양하기 위해 사용된 Dulbecco’s modified Eagle’s medium (DMEM), penicillin-strepto-mycin, phosphate-buffered saline (PBS), bovine calf serum (BCS), fetal bovine serum (FBS)은 Gibco BRL. (Grand Island, NY, USA)에서 구입하여 사용하였다. Oil Red O (ORO), 3-isobu-tyl1-methylxanthine (IBMX), dexamethasone, insulin, 3-(4, 5-dimeth-ylthiazol-2-yl)-2, 5-diphenyltetrazolium bromide (MTT), formaldehyde 는 Bio Basic Inc.
(Markham, ON, Canada)에서 구입하여 사용하였다. Dimethyl sulfoxide (DMSO), isopropanole Junsei (Tokyo, Japan)에서 구입하여 사용하였다. 또한 Western blot assay를 위해 1차 항체로 사용된 PPARγ, fatty acid binding-protein 4 (FABP4), C/EBPα는 Cell Signaling Technology (Beverly, MA, USA) 에서구입하여 사용하였다.
(Grand Island, NY, USA)에서 구입하여 사용하였다. Oil Red O (ORO), 3-isobu-tyl1-methylxanthine (IBMX), dexamethasone, insulin, 3-(4, 5-dimeth-ylthiazol-2-yl)-2, 5-diphenyltetrazolium bromide (MTT), formaldehyde 는 Bio Basic Inc. (Markham, ON, Canada)에서 구입하여 사용하였다. Dimethyl sulfoxide (DMSO), isopropanole Junsei (Tokyo, Japan)에서 구입하여 사용하였다.
또한 Western blot assay를 위해 1차 항체로 사용된 PPARγ, fatty acid binding-protein 4 (FABP4), C/EBPα는 Cell Signaling Technology (Beverly, MA, USA) 에서구입하여 사용하였다. SREBP-1과 GAPDH는 Santa Cruz Biotechnology Inc. (Santa Cruz, CA, USA)에서 구입하였다.
Dimethyl sulfoxide (DMSO), isopropanole Junsei (Tokyo, Japan)에서 구입하여 사용하였다. 또한 Western blot assay를 위해 1차 항체로 사용된 PPARγ, fatty acid binding-protein 4 (FABP4), C/EBPα는 Cell Signaling Technology (Beverly, MA, USA) 에서구입하여 사용하였다. SREBP-1과 GAPDH는 Santa Cruz Biotechnology Inc.
본 실험에 사용된 감귤피는 제주도에 소재한 (주)일해에서 감귤 착즙액 제조공정에서 회수 후 열풍건조된 분말 시료를 제공받아 사용하였다. 3T3-L1 지방전구세포를 배양하기 위해 사용된 Dulbecco’s modified Eagle’s medium (DMEM), penicillin-strepto-mycin, phosphate-buffered saline (PBS), bovine calf serum (BCS), fetal bovine serum (FBS)은 Gibco BRL.
실험에 사용된 3T3-L1 전구지방세포는 American Type Culture Collection (ATCC, MD, USA)에서 분양 받았으며, 10% Bovine Calf Serum (BCS)과 1% antibiotics가 포함된 DMEM (Dul-becco’s Modified Eagle Medium)를 사용하여 5% CO₂, 37 C 조건의 인큐베이터에서 배양하였다.

데이터처리

데이터의 통계분석은 SPSS (SPSS Inc., Chicago, IL, USA) program을 이용하여 평균±표준편차로 나타내었고, 실험군 간의 평균값의 통계적 유의성은 p<0.05 수준에서 Duncan’s multiple range test에 의해 검정을 실시하였다.

이론/모형

따라서 이러한 adipogenic transcription factor의 발현 조절을 통해 지방 전구세포의 분화를 억제하는 것은 항비만 연구에서 중요한 작용기전으로 여겨진다(Wang과 Hai, 2015). MPCE가 adipogenesis 과정에 관여하는 전사인자들의 발현에 어떠한 영향을 미치는지 확인하기 위해 Western blot assay를 실시하였고 그 결과를 Fig. 3에 나타내었다. MDI를 처리하여 분화를 유도하였을 때, adipogenic transcription factor인 C/EBPα, PPARγ, SREBP-1, FABP4의 발현이 현저하게 증가하는 것으로 나타났으나, 분화 유도 과정 중에 MPCE를 처리하였을 때는 농도 의존적으로 전사인자들의 발현을 유의적으로 감소시킴을 확인하였다.
MPCE가 adipogenic transcription factor의 발현에 영향을 미치는지 알아보기 위해 Western blot assay를 실시하였다. 동일한 방법으로 준비된 세포를 ice cold-PBS로 2회 세척한 후 lysis buffer (20mM Tris, 5mM EDTA, 10mM Na⁴P²O⁷, 100mM NaF, 2 mM Na³VO⁴, 1% NP-40, 10mg/mL Aprotinin, 10mg/mL Leu-peptin, 1mM PMSF)로 1시간 동안 4 C에서 균질화하고 14, 000×g,4 C에서 20분 동안 원심분리 하여 상층액을 분리하였다.
MPCE의 세포독성 측정과 더불어 실험에 사용될 농도를 결정하기 위하여 Lim 등(2014)의 방법에 따라 MTT assay를 실시하였다. 24-well plate에 3T3-L1 지방전구세포를 분주하고 confluent 상태까지 배양한 후 MPCE를 농도별로 처리하였다.
Effect of MPCE on cell viability of 3T3-L1 preadipocytes treated for 48 h. The cell viability was measured using an MTT assay. The values are expressed as the mean±SD in triplicate experiments.
다음 양을 %로 계산하였다. 감귤피 효소적 추출물의 총 폴리페놀 함량 측정은 Meda 등(2005)의 방법을 약간 변형한 Folins-Ciocalteus 방법에 준하여 수행하였다. 추출물 1mL에 95% 에탄올 용액을 1mL와 증류수 5mL을 넣어 혼합한 후 50% Folin-Ciocalteu reagent (Sigma Chemical, St.
감귤피의 효소적 추출은 Lee 등(2012)의 방법에 따라 추출하였다. 열풍건조된 감귤피 분말 시료를 증류수에 넣고 시료 대비 효소 비율을 1%로 하여 상업용 당분해효소인 Celluclast (Novozyme Nordisk, Bagasvaerd, Denmark)를 첨가하여 효소의 반응 최적 조건(pH 4.

성능/효과

적정 농도를 결정하기 위해 MTT assay를 실시하였다. 100-400 μg/mL의 농도로 MPCE를 처리한 후 48시간 후에 세포 생존율을 측정한 결과, 모든 처리 농도에서 세포 독성을 나타내지 않았다(Fig. 1). 따라서 본 실험에서는 세포 독성을 보이지 않은 400μg/mL 농도까지를 실험조건으로 설정하여 이후의 실험을 진행하였다.
3에 나타내었다. MDI를 처리하여 분화를 유도하였을 때, adipogenic transcription factor인 C/EBPα, PPARγ, SREBP-1, FABP4의 발현이 현저하게 증가하는 것으로 나타났으나, 분화 유도 과정 중에 MPCE를 처리하였을 때는 농도 의존적으로 전사인자들의 발현을 유의적으로 감소시킴을 확인하였다. 이와 같은 결과는 MPCE가 SREBP-1의 발현을 억제함으로써 하위인자인 C/EBPα와 PPARγ 의 발현에 영향을 준 것으로 판단된다.
따라서 본연구에서는 감귤피의 산업적 이용성 및 유용성을 증대시키기 위하여 식품용으로 상업화된 효소를 적용하여 감귤피 효소적 추출물을 제조하였다. 감귤피 효소적 추출물의 추출 수율은 30.48% 로 나타났고 총 폴리페놀 함량을 측정한 결과 78.64mg/g으로 나타났다. Hwang 등(2013)의 연구에서 대표적인 감귤류인 영귤, 천혜향, 진귤, 온주밀감 등의 과피를 80% 메탄올로 추출하여 총 폴리페놀 함량을 측정한 결과 20.
6mg/g으로 보고하였는데, 본연구결과와 비교하여 2배 이상 낮은 함량을 나타내었다. 이는 유기용매 추출물에 비해 효소적 추출물이 더 많은 폴리페놀을 함유하고 있다는 것을 의미하며, 감귤피로부터 폴리페놀과 같은 유효성분을 추출하는데 있어 효소적 추출법이 더 유용할 것으로 판단된다.
2B). 이러한 결과는 MPCE가 전구 지방세포에서 지방세포로 분화되는 과정 억제 효과를 통해 중성지방 축적을 효과적으로 감소시킬 수 있음을 나타낸다. 최근 많은 연구에 의하면 식물 유래 폴리페놀 성분이 adipogenesis 과정에 관여하는 핵심 전사인자들의 발현 조절을 통해 지방세포 분화 및 지방축적을 억제한다고 보고하였다(Hsu과 Yen, 2007; Kim 등, 2018; Moon 등, 2007).
이와 같은 결과는 MPCE가 SREBP-1의 발현을 억제함으로써 하위인자인 C/EBPα와 PPARγ 의 발현에 영향을 준 것으로 판단된다. 이러한 모든 결과들을 통해 MPCE는 adipogenic transcription factor의 발현을 효과적으로 억제하여 지방세포 분화 및 지방축적이 감소되는 것을 확인하였다.
MDI를 처리하여 분화를 유도하였을 때, adipogenic transcription factor인 C/EBPα, PPARγ, SREBP-1, FABP4의 발현이 현저하게 증가하는 것으로 나타났으나, 분화 유도 과정 중에 MPCE를 처리하였을 때는 농도 의존적으로 전사인자들의 발현을 유의적으로 감소시킴을 확인하였다. 이와 같은 결과는 MPCE가 SREBP-1의 발현을 억제함으로써 하위인자인 C/EBPα와 PPARγ 의 발현에 영향을 준 것으로 판단된다. 이러한 모든 결과들을 통해 MPCE는 adipogenic transcription factor의 발현을 효과적으로 억제하여 지방세포 분화 및 지방축적이 감소되는 것을 확인하였다.
2A에 나타낸 바와 같이 MPCE 처리하지 않고 분화를 유도하였을 때 지방축적이 현저하게 형성되는 것으로 관찰되었다. 하지만 MPCE 처리군에서 농도 의존적으로 지방 축적이 유의하게 억제되는 것을 확인하였다. 또한 세포 내 중성지방 함량을 측정한 결과 MPCE 처리군에서는 대조군에 비해 세포 내 중성지방의 함량을 감소시켰다(Fig.

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Wang L, Lee WW, Yang HW, Ryu BM, Cui YR, Lee SC, Lee TG, Jeon YJ. Protective effect of water extract of citrus pomace against AAPH-induced oxidative stress in vitro in Vero cells and in vivo in zebrafish. Prev Nutr Food Sci 23: 301-308 (2018)

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World Health Organization (WHO). Obesity. Available from: https://www.who.int/news-room/facts-in-pictures/detail/6-facts-on-obesity. Accessed Feb. 10, 2020.

표제어: PCR

동의어: Packet Collision Rate

용어 설명 출처 목록 (6)

용어 설명: PCR은 세균 특이성이 있는 primer를 이용하여 적은 수의 세균이 있을지라도 쉽게 검출할 수 있는 유용한 방법이며, 이를 이용하여 구강 내 치면세균막이나 타액에서 직접 세균을 검출할 수 있게 되었다[8].

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