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문제 정의
- 본 연구에서는 대황 추출액을 이용한 부가가치가 높은 식품소재의 개발을 위하여 유산균을 이용한 발효공정의 적용 가능성을 검토하였다. 그 결과, 세포 독성에 영향을 미치지 않으면서대황의 항산화 활성뿐만 아니라 항염증 활성을 증가시킬 수 있는 우수한 유산균주 P pentosaceus MBP-34 를 확보하였다.
- (2011) 이 발효에 의한 대황 추출액의 폴리페놀 함량 증가와 2, 2'-diphenyl-1-picrylhydzyl (DPPH) radical 및 hydroxyl radical 소거활성에 대한 단편적인 연구 결과만 보고하였다. 이에 본 연구에서는 우수한 생리활성을 가지고 있는 것으로 알려져 있음에도 불구하고 상대적으로 상업적 적용에 대한 연구가 미진한 대황의 활용도를 높이기 위하여 미생물 발효에 의한 대황 발효액의 항산화 활성 및 항염증 활성 변화를 비교하였다. 본 연구에서 얻어진 결과는 향후발효공정을 이용한 다양한 해조류발효 제품개발에 연결될 것으로 기대된다.
- 것을 확인할 수 있었다. 이에 유산균 발효에 의해서 세포 독성이 생성되지 않는다면 천연 항산화제로써의 이용 가능성이 높을 것으로 판단되어 이후 MTT assay 를 이용한 세포 독성에 관한 연구를 진행하였다.
제안 방법
- 96-well plate 에 Raw 264.7 cell 1 x 105 개를 분주하고, 4시간 뒤에 새 배지로 교체 후 일정농도 (0.5 mg/mL) 의 대황 추출액 및 유산균 대황 발효액을 24시간 동안 처리하였다. 이후, 3- (4, 5-dimethylthiazol-2-ly)-2, 5-diphenyltetrazolium bromide (0.
- 대황의 염을 제거하기 위해 물로 3회 세척한 후 일광건조하였다. 건조된 대황은 분쇄기 (HMF -1000A; Hanil Electronics, Seoul, Korea) 를 통해 분말화한 후 -70 ℃ 냉동고에 보관 후, Eom et al. (2011)이 보고한 방법에 따라 건조된 대황 분쇄물에 20배의 물 (w/v) 을 첨가하고 121C에서 15분간 열수 추출하였다.
- 구입하여 사용하였다. 대황의 염을 제거하기 위해 물로 3회 세척한 후 일광건조하였다. 건조된 대황은 분쇄기 (HMF -1000A; Hanil Electronics, Seoul, Korea) 를 통해 분말화한 후 -70 ℃ 냉동고에 보관 후, Eom et al.
- , 2008). 본 실험에 사용된 10종의 균주들 중에서 대황 발효에 유용한 균주를 탐색하기 위해 대황 발효 추출액의 페놀 함량을 측정하였다. 대황 발효에 대한 이전 연구에서 Eom et al.
- 5 mg/mL) 의 대황 추출액 및 유산균 대황 발효액을 1시간 동안 전처리 후 lipopolysaccharide (LPS) 를 1 μ g/mL 로 24시간 동안 처리하였다. 세포배양 상층액 50(1L를 96 well 에 덜어 놓고 Griess 용액 (1% sulfa- nilamide/0.1% N-(1-naphthyl)-ethylenediamine dihydrochlo- ride/2.5% H3PO4) 50 叫를 첨가하고 5분 후 ELISA reader (Wallac 1420; Perkin Elmer, Turku, Finland) 를 통해 540 nm 에서 흡광도를 측정하였으며, 3 반복을 원칙으로 하여 평균값을 구하였다.
- 5 mg/mL 에서 유산균 대황 발효액의 항염증 활성을 조사하였다. 유산균 대황 발효액의 항염증 효과를 조사하기 위하여 세포 내 염증의 지표인 NO 생성을 LPS 로 유도하였고 유산균 대황 발효액의 세포보호효과(cell protective effect) 를 NO 생성 억제활성으로 측정하였다.
- (2011)은 대황의 페놀 함량은 발효 24시간에 최대치를 기록하였다가 그 이후에는 감소하는 경향을 보인다고 보고하였다. 이에 본 실험에서는 이전 결과를 토대로 발효 12시간과 24 시간 후의 유산균 대황 발효액에서 페놀 화합물의 변화를 측정하였다 (Table 1). 유산균 발효에 의해 대황 발효액의 페놀 함량이 증가하는 경향을 확인할 수 있었다.
- 2 mL 씩 옮긴 후 GENios® microplate reader (Tecan Austria GmbH, Grodig, Austria) 를 사용하여 765 nm 에서 흡광도 값을 측정하였다. 추출물 안의 total phenolic content의 농도는 표준물질로 galic acid를 이용한 다음 선형 방정식을 사용하여 나타내었다.
대상 데이터
- 대황 추출액의 발효를 위하여 사용된 균주는 전통 발효식품에서 분리하여 부경대학교 식품공학과 식품미생물학 연구실에서 보관 중인 유산균들을 사용하였다. MRS 배지 (Difco; Sparks, MD) 에 발효균주를 24시간 배양 후, 배양액 10%를 대황 추출액에 접종하고 30C에서 진탕 배양(120 rpm) 하였다.
- 마우스의 대식세포주인 Raw 264.7 celle 한국세포주은행 (KCLB) 에서 분양 받았으며, 세포 배양을 위해 10% fetal bovine serum (FBS) 과 1% penicillin-streptomycin을 포함하는 Dulbecco’s Modified Eagle Medium (DMEM) 배지를 사용하였다. 세포는 37C, 5% CO2 조건에서 배양하였다.
- 본 연구에 사용된 대황(E bicyclis) 은 2014년 8월에 채취한 울릉도산을 구입하여 사용하였다. 대황의 염을 제거하기 위해 물로 3회 세척한 후 일광건조하였다.
이론/모형
- Alkyl radical (peroxyl radical)은 Hiramoto et al. (1993) 의 방법에 따라 다음과 같이 측정하였다. 10 pL 의 시료에 각각 10 pL 의 phosphate buffered saline (PBS), 40 mM AAPH [2, 2-azobis-(2-amidinopropane)-dihydrochloride], 40 mM POBN a-(4-pyridyl-1- oxide)-N-tert-butylnitrone을 첨가한다.
- DPPH radical 소거능은 Qureshi et al. (2010) 의 방법으로 분석하였다. 시료 100 pL 에 150 pM DPPH 용액 100 pL 를 혼합후 반응액을 96 well plate 에 옮겨 암실에서 30분간 방치 후 GENios® microplate reader (Tecan Austria GmbH, Grodig, Austria) 를 통해 517 nm 에서 흡광도를 측정하였다.
- Folin-Ciocalteu 법 (Waterman and Mole, 1994)을 수정한 Kim at al. (2006) 의 방법에 따라 phenolic compound를 정량하였다. 먼저 시료를 spectrophometer의 측정범위까지 희석을하고 희석된 시료 80 piL 와 1 N Folin-Ciocalteu reagent 0.
- Hydroxyl radical 소거능은 Rosen and Rauckman (1984)의 방법으로 분석하였다. 시료 20 pL 에 0.
성능/효과
- 4). MTT assay 에 의한 세포 독성 실험 결과, Raw 264.7 cell 생존율은 positive contr이인 ascorbic acid는 70.02% 의 세포 생존율을, 대황 추출액의 경우에는 57.70%를 나타내었다. 유산균에 의한 대황 추출물의 발효액은 대부분 발효 시간에 관계없이 대조구보다 높은 세포 생존율을 나타내었다 (Fig.
- 5). P. pentosaceus MBP-34 균주에 의한 대황 발효 추출액의 NO 생성 억제 활성이 positive con- tr이인 ascorbic acid (69.84%) 보다는 떨어지지만 발효액이 정제된 화합물이 아닌 점을 고려한다면 뛰어난 NO 생성 억제효과를 가진 것으로 판단된다. 또한 이러한 결과는 다른 해조류 추출액이 미생물 발효에 의해서 항염증 활성이 증가한다는 다른보고들과도 일치하였다 (Eom et al.
- 3과 같다. Positive contr이인 ascorbic acid는 73.81%의 활성을 나타내었고, 대황 추출액의경우에는 67.27%, 유산균 대황 발효액은 대부분 유산균 발효에 의해 대조구인 대황 추출액의 alkyl radical 소거 활성보다소폭 증진되는 것으로 나타났다. 또한 천연 항산화제 중 alkyl radical 소거능이 매우 우수한 것으로 알려진 ascorbic acid와비교 시 동일농도에서 대등한 alkyl radical 소거능을 나타내었으며 alkyl radical 의 소거활성이 뛰어나다고 알려진 chitooligo- saccharides (25%)보다 월등한 소거활성을 나타내었다 (Ngo et al.
- 유산균 발효에 의해 대황 발효액의 페놀 함량이 증가하는 경향을 확인할 수 있었다. 가장 높은 페놀 함량은 Lactobacillus plantarum AML-15에 의한 발효 24시간 후 [48.86 mg galic acid (GAE)/g] 에 관찰되었고, 다음은 Pedio- coccus pentosaceus MBP-10 에 의한 발효 24시간 후 (47.07 mg GAE/g)로 나타났다(Table 1). 그 이외에, L.
- 검토하였다. 그 결과, 세포 독성에 영향을 미치지 않으면서대황의 항산화 활성뿐만 아니라 항염증 활성을 증가시킬 수 있는 우수한 유산균주 P pentosaceus MBP-34 를 확보하였다. 또한 이 균주의 경우 효모와 곰팡이와 같은 진균류에 비해 상대적으로 단시간 발효에 의해 항산화 및 항염증 활성 증가가 가능하다는 점 등에 있어서 향후 기능성이 강화된 해조류 발효제품 개발에 연결될 것으로 기대된다.
- 하지만 페놀 화합물의 함량과 DPPH radical 소거능 활성 사이에 유의적인 상관관계는 관찰되지 않았다. 대황 발효에 사용된 유산 균주들 중에서 상대적으로 페놀 화합물 함량이 낮은 P pentosaceus MBP-34 균주를 가지고 12시간 발효한 대황 발효 추출물의 DPPH radical 소거능이 83.75%로 가장 높은 활성을 나타내 었다(Fig. 1). Eom et al.
- 이에 본 실험에서는 이전 결과를 토대로 발효 12시간과 24 시간 후의 유산균 대황 발효액에서 페놀 화합물의 변화를 측정하였다 (Table 1). 유산균 발효에 의해 대황 발효액의 페놀 함량이 증가하는 경향을 확인할 수 있었다. 가장 높은 페놀 함량은 Lactobacillus plantarum AML-15에 의한 발효 24시간 후 [48.
- 70%를 나타내었다. 유산균에 의한 대황 추출물의 발효액은 대부분 발효 시간에 관계없이 대조구보다 높은 세포 생존율을 나타내었다 (Fig. 4). 특히 P.
- 이상의 다양한 radical 에 대한 소거활성에 대한 항산화 실험 결과를 종합하여 보면 대황 추출액은 DPPH radical, hydroxyl radical 및 alkyl radical과 같은 각종 유해 radical 생성을 억제시키는 효과를 가지고 있으며 그 활성은 유산균 발효에 의해서 증가되는 것을 확인할 수 있었다. 이에 유산균 발효에 의해서 세포 독성이 생성되지 않는다면 천연 항산화제로써의 이용 가능성이 높을 것으로 판단되어 이후 MTT assay 를 이용한 세포 독성에 관한 연구를 진행하였다.
- 하지만, 유산균 대황 발효액은 대황 추출액(대조구) 보다 hydroxyl radical 소거 활성이 증가하는 경향을 나타내었다. 특히 P pen- fosace必 MBP-34에 의해 12시간 발효된 것이 50.41%로 가장 높은 활성이 관찰되었다.
- 5). 특히 P pentosaceus MBP-34 균주에서 12시간 발효한 대황 발효 추출액에서 NO 생성(98.66%) 이 대조구(189.60%) 대비 약 2배 이상 낮아 가장 항염증 활성이뛰어난 것으로 나타났다 (Fig. 5). P.
- 4). 특히 P. pentosaceus MBP-34에 의해 12시간 발효된 대황 발효추출물의 경우, 101.76%로 가장 높은 Raw 264.7 cell 생존율을 나타내어 유산균 발효에 의해 세포 독성을 유발하는 물질들이 경감되는 것으로 판단되었다. 다시마 추출액의 경우에도 효모 발효에 의해 세포 생존율이 다소 증가한다고 보고하고 있다.
후속연구
- (2013)은 Cadida utilis를 이용한 대황 발효에서 발효 중에 페놀 화합물 함량의 변화보다는 대황에서 항산화 등의 생리활성에 중요한 지표물질인 eckol, dieckol, dioxinodehydroeckol 및 phlorofucofuroeckol-A 등의 phloro- tannins 화합물의 함량 변화가 더 중요하다고 보고하고 있다. 따라서 본 연구에서 얻어진 페놀 화합물의 함량과 DPPH radical 소거 활성간의 역상관관계를 보다 면밀하게 분석하기 위해서는 페놀 화합물의 함량 측정뿐만 아니라 유산균 발효에 의한 phlo- rotannins 함량의 변화에 대한 연구가 필요할 것으로 판단된다.
- 그 결과, 세포 독성에 영향을 미치지 않으면서대황의 항산화 활성뿐만 아니라 항염증 활성을 증가시킬 수 있는 우수한 유산균주 P pentosaceus MBP-34 를 확보하였다. 또한 이 균주의 경우 효모와 곰팡이와 같은 진균류에 비해 상대적으로 단시간 발효에 의해 항산화 및 항염증 활성 증가가 가능하다는 점 등에 있어서 향후 기능성이 강화된 해조류 발효제품 개발에 연결될 것으로 기대된다.
- , 2011). 또한 이러한 추출방법들은 고비용, 복잡한 공정 및 환경오염 등의 문제뿐만 아니라, 해조류 추출액에 알긴산 등의 점질 다당류와 해조류 특유의 향, 풍미, 조직감 등이 잔존하는 한계점이 있다. (Lim et al.
- 이에 본 연구에서는 우수한 생리활성을 가지고 있는 것으로 알려져 있음에도 불구하고 상대적으로 상업적 적용에 대한 연구가 미진한 대황의 활용도를 높이기 위하여 미생물 발효에 의한 대황 발효액의 항산화 활성 및 항염증 활성 변화를 비교하였다. 본 연구에서 얻어진 결과는 향후발효공정을 이용한 다양한 해조류발효 제품개발에 연결될 것으로 기대된다.
- (2010)도 효모 다시마발효액의 항산화 활성의 증가에 대해 보고하고 있으나 그 활성증가는 대황 추출액과 마찬가지로 radical 의 종류에 따라 차이가 있다. 이는 해조류들 중에 존재하는 항산화 물질의 종류, 함량 및 미생물 발효에 의한 해조류 대사산물 등의 차이에 기인하는 것으로생각되지만현재 이에 대한 연구는 진행되어 있지 않으며 향후 연구가 필요한 것으로 판단된다.
- , 2010). 이러한 결과는 전통 발효식품에서 분리한 유산균 및 효모 등의 발효 미생물이 해조류의 발효 중에 인체에 유해한 독성물질을 생산하지 않는다는 것을 의미하며 향후 전통 발효식품에서 분리된 미생물을 이용한 다양한 해조류 가공기술 개발에 연결될 것으로 기대된다. (Eom et al.
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