[논문]미성숙 진귤 과피 추출물이 신경세포 사멸에 미치는 영향

고운철; 이선령

doi:10.7783/kjmcs.2015.23.2.144

미성숙 진귤 과피 추출물이 신경세포 사멸에 미치는 영향
Effect of Immature Citrus sunki Peel Extract on Neuronal Cell Death 원문보기

韓國藥用作物學會誌 = Korean journal of medicinal crop science, v.23 no.2, 2015년, pp.144 - 149

Abstract ▼ AI-Helper

The peel of Citrus sunki exhibits multiple biological activities such as anti-oxidant, anti-inflammation and anti-obesity, but little is known about neurodegeneration-related activities. In this study, we investigated the protective effect of ethanolic extract from both immature and mature Citrus sunki peel on neuronal cell death. Treatment of the neuroblastoma cell line SH-SY5Y with $MPP^+$, an inducer of Parkinson disease model, increased cell death in a dose dependent manner. Increased levels of active caspase-3 and cleaved PARP were detected. Treatment with immature Citrus sunki peel extract significantly reduced $MPP^+$-induced neurotoxicity. Cytoprotection with immature Citrus sunki peel extract was associated with a decrease in caspase-3 activation and PARP cleavage. In contrast, mature Citrus sunki peel extract had no significant effects. These data suggest that immature Citrus sunki peel extract may exert anti-apoptotic effect through the inhibition of caspase-3 signaling pathway on $MPP^+$-induced neuronal cell death.

주제어

AI 본문요약
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문제 정의

파킨슨병과 연관된 세포사멸 기전을 연구하기 위해서 주로 사용하는 약물 은 MPP +로 이는 신경독성물질인 MPTP가 뇌혈관장벽을 통과해 세포에서 MPP +라는 대사물질로 바뀌어 신경세포에 독성을 유도하는 것으로 알려져 있기 때문이다. 따라서 본 실험에서 도 파킨슨병을 유발하기 위해 인간 신경세포인 SH-SY5Y 세에 MPP +를 사용하여 신경 세포 사멸에 미치는 영향을 알아 보고자 trypan blue exclusion 분석을 통해 생존율을 측정하였다. 다양한 농도(1-500 µM)의 MPP +를 신경세포에 24시간 동안 처리한 결과, 1-50 µM 농도에서는 세포 사멸 효과가 거의 나타나지 않았고 100 µM 처리군에서는 57%의 생존율을 보여 유의적으로 세포 생존율이 감소하기 시작하였으며 500 µM 농도에서는 40%의 낮은 생존율을 나타내었다 (Fig.
, 2011). 따라서 본 연구는 성숙과 미성숙에 따른 진귤 과피 추출물이 신경성 뇌질환에 미치는 효능을 확인하고자 수행되었다. 신경성 뇌질환 중의 하나인 파킨슨병을 유발하는 MPP+ 를 처리하여 신경세포의 손상을 유도한 후 성숙 과피와 미성숙 과피의 에탄올 추출물이 어떠한 영향을 미치는지 살펴보았다.
그러나, 진귤과 뇌혈관질환성 신경손상과의 관련 성 및 진귤의 성숙되는 정도에 따른 효능에 대해서는 거의 알려져 있지 않다. 따라서 예로부터 약재로 계속하여 사용하고 있는 진귤 과피의 성숙 정도가 신경손상 회복에 어떠한 영향을 미치는지 알아보고자 미성숙 진귤 과피와 성숙 진귤 과피 추출물을 이용하여 신경세포 손상에 대한 보호효능을 조사하였다. 먼저 80% 에탄올을 이용하여 추출한 미성숙 과피 추출 물과 성숙 과피 추출물의 독성을 확인하기 위해 SH-SY5Y 신 경세포에 각각의 추출물을 10 ㎍/㎖에서 200 ㎍/㎖까지의 농도로 처리하였다.
뇌졸중, 알츠하이머, 파킨슨병과 같이 신경세포의 사멸로 인해 신경손상이 심각할 경우 완전한 회복이 어려워 이를 예방 및 극복하기 위한 많은 방안들을 모색하기 위해 노력하고 있다. 본 연구에서는 신경 손상을 보호하기 위한 기능성 소재를 찾아보고자 진귤 과피 추출물의 신경세포 사멸 보호 효과를 조사하였다. 파킨슨병과 연관된 세포사멸 기전을 연구하기 위해서 주로 사용하는 약물 은 MPP +로 이는 신경독성물질인 MPTP가 뇌혈관장벽을 통과해 세포에서 MPP +라는 대사물질로 바뀌어 신경세포에 독성을 유도하는 것으로 알려져 있기 때문이다.

제안 방법

실험을 위해 세포는 1 × 106 cells/㎖의 농도로 심어 48시간 배양한 후 FBS가 포함되지 않은 배지로 교환하였다. 20시간 안정화시킨 후 최종농도가 1, 10, 100, 500 µM 되도록 MPP+ 를 처리하여 세포사멸 효과를 확인하였고 에탄올에 녹인 미성숙 및 성숙 진귤 과피 추출물은 최종농도가 10, 50, 100, 200 ㎍/㎖ 되도록 처리하여 세포사멸 보호 효과를 관찰하였다
세포 생존율은 trypan-blue를 이용하여 측정하였다. 24 well plate (1 × 105 cells/well)에 분주된 세포에 MPP+ 또는 각각의 추출물을 농도별로 처리하여 24시간 배양한 후 세포를 모두 수거하여 0.4% trypan-blue와 섞어 hemo-cytometer를 이용하여 살아있는 세포수와 죽은 세포수를 계수하였다. 아래의 식을 이용하여 생존율을 산출하였다.
, 2007). MPP +에 의한 세포 사멸이 caspase-3의 활성화를 통해 조절되는지 확인하기 위해 사멸 관련 단백질들의 발현을 분석하였다. 그 결과, 대조군에 비해 100 µM과 500 µM의 농도로 처리된 MPP + 처리군에서 핵 내에 존재하는 PARP의 분절현상이 관찰되었고 caspase-3의 경우 불활성화 상태에서 사멸이 진행될수록 분절화된 형태로 바뀌게 되어 cleaved 형태의 활성형이 증가되는 것을 확인할 수 있었다 (Fig.
따라서 예로부터 약재로 계속하여 사용하고 있는 진귤 과피의 성숙 정도가 신경손상 회복에 어떠한 영향을 미치는지 알아보고자 미성숙 진귤 과피와 성숙 진귤 과피 추출물을 이용하여 신경세포 손상에 대한 보호효능을 조사하였다. 먼저 80% 에탄올을 이용하여 추출한 미성숙 과피 추출 물과 성숙 과피 추출물의 독성을 확인하기 위해 SH-SY5Y 신 경세포에 각각의 추출물을 10 ㎍/㎖에서 200 ㎍/㎖까지의 농도로 처리하였다. 그 결과, 미성숙 및 성숙 진귤 과피 추출물 을 처리한 실험군 모두에서 대조군과 유사한 생존율을 나타내는 것으로 보아 세포 독성에는 아무런 영향을 미치지 않았다 (Fig.
Louis, MO, USA) 분석법을 수행하였다. 미성숙 및 성숙 진귤 과피 추출물을 농도별로 처리하여 24시간 배양한 세포 (1 × 105 cells/ well)에 MTT용액 (0.2 ㎎/㎖)을 첨가하여 3시간 반응시킨 후 배지를 모두 제거하였다. 생성된 formazan을 dimethyl sulfoxide (DMSO)로 녹여 540 ㎚에서 흡광도를 측정하였다.
2A). 미성숙 및 성숙 진귤 과피 추출물의 신경세포 보호 효과를 살펴보기 위해 신경세포에 각각의 추출물을 농도별로 30분 전처리한 후 250 µM의 MPP +를 처리하였고 24시간동안 배양한 후 이들의 생존율을 trypan blue exclusion 으로 측정하였다. 성숙 진귤 과피 추출물을 처리한 경우,10 ㎍/㎖ 농도에서는 50%의 생존율을, 200 ㎍/㎖의 농도에서 는 58%의 생존율을 나타내었다.
Phosphate buffered saline (PBS) 수세 후 수확한 세포에 protease inhibitor가 포함된 lysis buffer (20 mM Tris, 150 mM NaCl, 1 mM EDTA, 1 mM EGTA, 1% Triton X100)를 넣어 30분간 반응한 후 14,000 rpm에서 15분간 원심 분리하여 얻어진 30 ㎍의 단백질을 10% polyacrylamide gel에서 전기영동하였다. 분리된 단백질은 nitrocellulose membrane 에 전이시킨 후 단백질 발현 분석을 위해 anti-mouse PARP (Santa Cruz Biotech, Dallas, TA, USA), anti-rabbit cleaved caspase-3 (Cell signaling, Danvers, MA, USA), anti-mouse beta-actin (Sigma, St. Louis, MO, USA) 항체를 이용하여 반응하였고 enhanced chemiluminescence kit (ECL) 방법으로 확인하였다
따라서 본 연구는 성숙과 미성숙에 따른 진귤 과피 추출물이 신경성 뇌질환에 미치는 효능을 확인하고자 수행되었다. 신경성 뇌질환 중의 하나인 파킨슨병을 유발하는 MPP+ 를 처리하여 신경세포의 손상을 유도한 후 성숙 과피와 미성숙 과피의 에탄올 추출물이 어떠한 영향을 미치는지 살펴보았다.
진귤 과피 추출물의 세포손상 보호 효과를 검증하기 위해 세포 사멸 관련 단백질들의 발현양상을 분석하였다. 성숙 과피 추출물 처리군의 경우, MPP +처리군과 마찬가지로 PARP의 분 절현상과 활성화되는 cleaved caspase-3의 발현양이 증가되는 것을 확인할 수 있었다.

대상 데이터

Human neuroblastoma SH-SY5Y 세포는 한국 세포주은행에서 분양 받아 사용하였다. 세포는 10% fetal bovine serum (FBS), 100 unit/㎖ penicillin/ streptomycin, 20 mM HEPES 가 포함된 Dulbecco’s modified eagle’s medium (DMEM, Gibco, Carlsbad, CA, USA) 배지를 사용하여 37℃, 5% CO2 항온기에서 배양하였다.

데이터처리

본 실험의 결과는 3회 반복하여 평균 ± 표준편차로 표시하였다. 통계처리는 Student’s t-test에 의해 수행되었으며 p < 0.
본 실험의 결과는 3회 반복하여 평균 ± 표준편차로 표시하였다. 통계처리는 Student’s t-test에 의해 수행되었으며 p < 0.05인 경우 유의한 것으로 판정하였다.

이론/모형

세포 생존율은 trypan-blue를 이용하여 측정하였다. 24 well plate (1 × 105 cells/well)에 분주된 세포에 MPP+ 또는 각각의 추출물을 농도별로 처리하여 24시간 배양한 후 세포를 모두 수거하여 0.
시료의 독성을 확인하기 위해 3-(4,5-dimethylthiazole-2-yl)- 2,5-diphenyl-terazolium bromide (MTT; Sigma, St. Louis, MO, USA) 분석법을 수행하였다. 미성숙 및 성숙 진귤 과피 추출물을 농도별로 처리하여 24시간 배양한 세포 (1 × 105 cells/ well)에 MTT용액 (0.

성능/효과

MPP +에 의한 세포 사멸이 caspase-3의 활성화를 통해 조절되는지 확인하기 위해 사멸 관련 단백질들의 발현을 분석하였다. 그 결과, 대조군에 비해 100 µM과 500 µM의 농도로 처리된 MPP + 처리군에서 핵 내에 존재하는 PARP의 분절현상이 관찰되었고 caspase-3의 경우 불활성화 상태에서 사멸이 진행될수록 분절화된 형태로 바뀌게 되어 cleaved 형태의 활성형이 증가되는 것을 확인할 수 있었다 (Fig. 1B). 이러한 결과는 MPP +에 의한 신경세포 사멸이 caspase-3 경로를 통해 조절되고 있음을 보여주는 것이다.
먼저 80% 에탄올을 이용하여 추출한 미성숙 과피 추출 물과 성숙 과피 추출물의 독성을 확인하기 위해 SH-SY5Y 신 경세포에 각각의 추출물을 10 ㎍/㎖에서 200 ㎍/㎖까지의 농도로 처리하였다. 그 결과, 미성숙 및 성숙 진귤 과피 추출물 을 처리한 실험군 모두에서 대조군과 유사한 생존율을 나타내는 것으로 보아 세포 독성에는 아무런 영향을 미치지 않았다 (Fig. 2A). 미성숙 및 성숙 진귤 과피 추출물의 신경세포 보호 효과를 살펴보기 위해 신경세포에 각각의 추출물을 농도별로 30분 전처리한 후 250 µM의 MPP +를 처리하였고 24시간동안 배양한 후 이들의 생존율을 trypan blue exclusion 으로 측정하였다.
따라서 본 실험에서 도 파킨슨병을 유발하기 위해 인간 신경세포인 SH-SY5Y 세에 MPP +를 사용하여 신경 세포 사멸에 미치는 영향을 알아 보고자 trypan blue exclusion 분석을 통해 생존율을 측정하였다. 다양한 농도(1-500 µM)의 MPP +를 신경세포에 24시간 동안 처리한 결과, 1-50 µM 농도에서는 세포 사멸 효과가 거의 나타나지 않았고 100 µM 처리군에서는 57%의 생존율을 보여 유의적으로 세포 생존율이 감소하기 시작하였으며 500 µM 농도에서는 40%의 낮은 생존율을 나타내었다 (Fig. 1A).
반면, 미성숙 진귤 과피 추출물의 경우 100 ㎍/㎖ 과 200 ㎍/㎖의 농도로 처리한 후 세포의 생존율은 78%로 회복 되었고 48%의 생존율을 보인 MPP + 처리군에 비해 매우 유의 성 있는 결과를 나타내었다 (Fig. 2B). 이러한 결과는 성숙 진귤 과피 추출물에 비해 미성숙 진귤 과피 추출물이 보다 강한 보호 효능을 가지고 있음을 보여주는 것으로 미성숙 진귤과 피 추출물이 가지는 30%의 보호 효능은 기존의 연구들과 비교해 볼 때 유사한 결과를 나타내었다.
진귤 과피 추출물의 세포손상 보호 효과를 검증하기 위해 세포 사멸 관련 단백질들의 발현양상을 분석하였다. 성숙 과피 추출물 처리군의 경우, MPP +처리군과 마찬가지로 PARP의 분 절현상과 활성화되는 cleaved caspase-3의 발현양이 증가되는 것을 확인할 수 있었다. 미성숙 과피 추출물의 경우 PARP의 분절현상이나 활성화되는 cleaved caspase-3의 발현양을 거의 관찰할 수 없는 대조군과 유사한 발현양상을 보여 주었다 (Fig.
2B). 이러한 결과는 성숙 진귤 과피 추출물에 비해 미성숙 진귤 과피 추출물이 보다 강한 보호 효능을 가지고 있음을 보여주는 것으로 미성숙 진귤과 피 추출물이 가지는 30%의 보호 효능은 기존의 연구들과 비교해 볼 때 유사한 결과를 나타내었다. 특히, 신경계세포인 SH-SY5Y 세포나 PC12 세포에서 MPP +로 세포사멸을 유도한 연구들 중 LiuWei dihuang 처리는 MPP + 처리군의 47%의 생존율이 82%로 회복되었고, lycopenee 62%의 생존율을 가지는 MPP + 처리군에 비해 20%의 보호효과를 나타내었다 (Yi et al.
이상의 결과로 볼 때 미성숙 진귤 과피 추출물이 caspase-3 dependent pathway를 통해 MPP+ 유도성 신경세포 사멸에 대한 보호 효과를 가지며 이는 뇌혈관질환 예방을 위한 기능성 소재로서의 가능성을 보여주는 것이다. 그러나 미성숙 진귤과 피가 가지는 보다 구체적인 성분 분석에 의한 효능과 동물모델을 통한 보호 효과는 추후 연구를 통해 밝혀야 할 것으로 보인다.

후속연구

이상의 결과로 볼 때 미성숙 진귤 과피 추출물이 caspase-3 dependent pathway를 통해 MPP+ 유도성 신경세포 사멸에 대한 보호 효과를 가지며 이는 뇌혈관질환 예방을 위한 기능성 소재로서의 가능성을 보여주는 것이다. 그러나 미성숙 진귤과 피가 가지는 보다 구체적인 성분 분석에 의한 효능과 동물모델을 통한 보호 효과는 추후 연구를 통해 밝혀야 할 것으로 보인다.
기존에 보고된 물질들의 생리활성 정도와 처리농도의 범위, 세포의 특이적인 환경조건들로 인해 보호 효과는 10-35% 정도로 다양하게 나타나고 있으며 이들의 신경세포 손상 보호 효능과 비교해 볼 때 30%의 보호 효과를 가지는 미성숙 진귤 과피 추출물의 경우 일정 수준 이상의 신경 손상 보호 효능을 발휘하는 것으로 생각된다. 보다 더 정확한 효능 검증을 위해 파킨슨 증상을 완화시키는 약물과의 비교분석 및 이들의 조절 기전에 대한 지속적인 연구가 진행 되어야 할 것이다.

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저자의 다른 논문 :

표제어: PCR

동의어: Packet Collision Rate

용어 설명 출처 목록 (6)

용어 설명: PCR은 세균 특이성이 있는 primer를 이용하여 적은 수의 세균이 있을지라도 쉽게 검출할 수 있는 유용한 방법이며, 이를 이용하여 구강 내 치면세균막이나 타액에서 직접 세균을 검출할 수 있게 되었다[8].

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