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문제 정의
- 막걸리는 제조일이나 사용된 누룩 등의 재료에 따라 서로 다른 유산균 효모가 존재하는데 이를 손쉽게 얻기 위해 시판 막걸리를 사용하여 우리나라 전통 발효유 타락을 제조하였으며 이 타락의 발효 중 pH, 산도, 점도, 당도 및 에탄올 등의 변화와 발효에 관여하는 미생물의 분석을 통하여 전통발효유 타락 연구의 기초자료를 제공하고자 한다.
가설 설정
- 4) NM: not measured.
제안 방법
- 분리된 균주는 (주)마크로젠(Seoul, Korea)에 의뢰하였다. PCR 반응을 통하여 젖산균은 16S rDNA 염기서열 분석을 하였으며, 효모균은 18S rDNA 염기서열 분석을 실시하여 균주를 동정하였다.
- 2(최대값은 2, 500 cP)를 사용하여 60 rpm 에서 그 값을 측정하였다. 단위는 cP로 나타내었으며 측정 시작 후 1분간 안정화시킨 뒤 20초 간격으로 3회 반복 측정하였다. 당도는 측정 범위가 Brix 0~32%인 딩도계(PR-1, ATAGO, Tokyo, Japan)를 이용하여 측정하였다.
- 당도는 측정 범위가 Brix 0~32%인 딩도계(PR-1, ATAGO, Tokyo, Japan)를 이용하여 측정하였다. 당도 계에 타락 시료를 점적하여 3회 반복 측정하였다.
- 발효시간에 따른 타락 시료의 pH는 타락 10 mL씩을 취하여 상온에서 pH meter(ORION 3 STAR, Thermo, Bremen, Germany)를 사용하여 3회 반복 측정하고 평균값을 취하였으며, 산도는 0.1 N NaOH 수용액으로 pH 8.3이 될 때까지 적정하여 이때 소비된 0.1 N NaOH 용액의 양을 다음 식에 의하여 lactic acid 함량(%)으로 환산하였다(7). 적정산도는 3회 반복 측정하였다.
- 발효시간에 따른 타락의 젖산균 및 효모 균수를 측정하기 위해 0시간부터 4시간 간격으로 채취한 시료를 1 g 취한 후 9 mL의 멸균수와 혼합하여 십진 희석법을 이용하여 희석하였다. 젖산균 수는 희석한 시료를 Lactobacilli MRS agar 배지에 도말하여 37℃에서 24시간 배양한 후 유효숫자 범위 내의 콜로니 수를 계측하였다.
- 시판되는 우유는 살균되는 과정을 거치지만 본 실험에서는 문헌을 그대로 재현하기 위하여 살균과정을 거쳤으며 90℃ 10분, 20분, 30분을 살균하여 MRS와 PDA 배지에 도말하여 콜로니가 검출되지 않는 최적의 살균온도를 선정하였다. 이를 통하여 우유는 autoclave를 이용하여 90℃에서 20분간 가열하였으며 미생물 접종 적정온도인 37℃까지 식혀서 6% acetic acid를 0.
- 에탄올 함량을 측정하기 위해 발효시간에 따른 타락 시료를 1 mL씩 취한 후 1,000Xg에서 10분간 원심분리 하였다. 상징액 100 此를 취한 후 3차 증류수로 10배 희석을 하여 0 0.
- 시판되는 우유는 살균되는 과정을 거치지만 본 실험에서는 문헌을 그대로 재현하기 위하여 살균과정을 거쳤으며 90℃ 10분, 20분, 30분을 살균하여 MRS와 PDA 배지에 도말하여 콜로니가 검출되지 않는 최적의 살균온도를 선정하였다. 이를 통하여 우유는 autoclave를 이용하여 90℃에서 20분간 가열하였으며 미생물 접종 적정온도인 37℃까지 식혀서 6% acetic acid를 0.1% 첨가한 후 10%의 시판 막걸리를 첨가하고 37℃의 인큐베이터에서 배양하여 타락을 제조하였다. 제조한 타락은 0시간부터 4시간 간격으로 0, 4, 8, 12, 16, 20, 24시간에 채취하여 실험에 사용하였다.
- 1 N NaOH 용액의 양을 다음 식에 의하여 lactic acid 함량(%)으로 환산하였다(7). 적정산도는 3회 반복 측정하였다.
- 젖산균 수는 희석한 시료를 Lactobacilli MRS agar 배지에 도말하여 37℃에서 24시간 배양한 후 유효숫자 범위 내의 콜로니 수를 계측하였다. 효모는 희석한 시료를 10% tartaric acid를 pH 3.
- 1% 첨가한 후 10%의 시판 막걸리를 첨가하고 37℃의 인큐베이터에서 배양하여 타락을 제조하였다. 제조한 타락은 0시간부터 4시간 간격으로 0, 4, 8, 12, 16, 20, 24시간에 채취하여 실험에 사용하였다. 시판 막걸리로는 국순당 옛날막걸리(M1), 금정 산성막걸리(M2), 배상면주가 느린마을막걸리(M3), 덕산 쌀막걸리(M4)를 사용하였으며 이후 제조된 타락은 순서대로 T1, T2, T3, T4로 표기하였다.
- 이러한 결과는 발효의 경과와 더불어 일어나는 pH, 산도 변화와 관계가 있는 것으로 보였다. 최고점도를 보인 이후 응고되었던 타락에서 형성된 커드가 유청과 분리되면서 점도는 감소하는 현상을 보였기에 점도는 최고점도를 보인 시점까지 측정을 진행하였다. Kim 등(10)은 시판 요구르트의 점도가 7, 850~21,000 cP로 제품들 간에 차이가 있고 첨가한 증점제에 따라서도 차이가 있다고 하였는데, 본 실험에서 최고 발효시점에서의 점도는 844.
- 콜로니의 형태를 비교하여 서로 모양이 다른 콜로니를 시료별로 9~10 콜로니를 분리하였다. 획선 배양하여 균주를 분리 후 이를 3번 반복하여 순수 분리하였다.
- 타락제조에 관여하는 균주를 동정하기 위하여 제조된 타락의 균주를 젖산균은 Lactobacilli MRS agar, 효모는 Potato dextrose agar 배지를 사용하여 단일균주를 분리하였다. 콜로니의 형태를 비교하여 서로 모양이 다른 콜로니를 시료별로 9~10 콜로니를 분리하였다.
- 한국 전통 발효유인 타락을 제조하기 위하여 4종의 시판 막걸리와 시판 우유를 사용한 '타락'을 제조하여 발효 특성을 분석하였으며 관여 미생물을 분석하였다. 제조된 타락에서의 pH는 발효시간에 따라 유의적으로(P<0.
- 젖산균 수는 희석한 시료를 Lactobacilli MRS agar 배지에 도말하여 37℃에서 24시간 배양한 후 유효숫자 범위 내의 콜로니 수를 계측하였다. 효모는 희석한 시료를 10% tartaric acid를 pH 3.5가 되도록 첨가하여 효모를 제외한 다른 미생물의 성장이 억제된 Potato dextrose agar 배지에 도말하여 37℃에서 24시간 배양하여 젖산균과 같은 방법으로 계측하였다.
대상 데이터
- 4종의 막걸리는 시판되어 구입할 수 있는 막걸리 중 지역적인 특성을 고려하여 옛날막걸리(Kooksoondang, Seoul, Korea), 금정산성막걸리(Gumjungsansung Tosanju, Busan, Korea), 느린마을막걸리(Beasangmyunjuga, Seoul, Korea), 덕산쌀막걸리(Sewangjujo, Chungbuk, Korea)를구입하였다. 시료는 서울의 대형 마트 1곳, 백화점 2곳에서구입하여 사용하였다.
- 단위는 cP로 나타내었으며 측정 시작 후 1분간 안정화시킨 뒤 20초 간격으로 3회 반복 측정하였다. 당도는 측정 범위가 Brix 0~32%인 딩도계(PR-1, ATAGO, Tokyo, Japan)를 이용하여 측정하였다. 당도 계에 타락 시료를 점적하여 3회 반복 측정하였다.
- 43 mg/mL의 glucose가 검출되었으며 이외에 fructose, maltose, lactose 등이 검출되었다고 보고하였다. 또한 본 실험에서 사용된 시판 막걸리의 경우 검출된 유리당 외에 다양한 감미료와 aspartame등이 사용되었다. 이를 통하여 발효 24시간까지의 타락에서는 단당류인 glucose와 fructose 등의 단당류 및 막걸리에서 유래한 감미료를 우선적으로 기질로 사용하여 발효를 하는 것으로 생각되었으며 이로 인하여 발효기간에 따른 lac- tose의 변화는 크지 않았다.
- 수운잡방에 언급된 타락의 제조법은 우유를 노구솥에 끓이며 막이 생기면 걷어내는 과정을 거치는데 이것은 살균 처리와 우유의 지방층을 걷어내기 위한 과정으로 보인다. 본 실험에서는 우유를 끓여서 사용하지 않고 고압증기멸균기를 이용하여 살균 처리하였으나 문헌 (6) 속의 타락 제조과정을 재현하기 위하여 우유에서 지방의 함량이 저감된 저지방 우유를 사용하였다.
- 획선 배양하여 균주를 분리 후 이를 3번 반복하여 순수 분리하였다. 분리된 균주는 (주)마크로젠(Seoul, Korea)에 의뢰하였다. PCR 반응을 통하여 젖산균은 16S rDNA 염기서열 분석을 하였으며, 효모균은 18S rDNA 염기서열 분석을 실시하여 균주를 동정하였다.
- 시료는 서울의 대형 마트 1곳, 백화점 2곳에서구입하여 사용하였다.
- 5 mL/min으로 흘려보냈다. 시료의 1회 주입량은 10 此였으며 detector는 RI(Shodex RI-101, Tokyo, Japan), UV(210 nm)를 사용하여 검출하였다.
- 제조한 타락은 0시간부터 4시간 간격으로 0, 4, 8, 12, 16, 20, 24시간에 채취하여 실험에 사용하였다. 시판 막걸리로는 국순당 옛날막걸리(M1), 금정 산성막걸리(M2), 배상면주가 느린마을막걸리(M3), 덕산 쌀막걸리(M4)를 사용하였으며 이후 제조된 타락은 순서대로 T1, T2, T3, T4로 표기하였다. 발효원으로 사용된 막걸리의 품질 특성은 Table 1과 같다.
- 22 um membrane filter를 이용하여 칼럼에 주입하였다. 유리당 분석에 이용된 HPLC(Ultimate 3000) 의 칼럼은 Waters Sugar-pak(300 mmX6.5 mm, 10 um, Waters, Milford, MA, USA)을 사용하였으며 이동상은 3차 증류수를 이용하여 0.5 mL/min으로 흘려보냈다. Detector 는 RI(Shodex RI-101)를 사용하여 검출하였다.
- 주재료인 우유는 서울우유사(Seoul Milk, Seoul, Korea) 저지방우유(탄수화물 2%, 단백질 5%, 지방 2%, 세균수 기준 1급A)를 사용하였다. 수운잡방에 언급된 타락의 제조법은 우유를 노구솥에 끓이며 막이 생기면 걷어내는 과정을 거치는데 이것은 살균 처리와 우유의 지방층을 걷어내기 위한 과정으로 보인다.
- 타락의 제조 및 발효 특성 분석을 위해 사용한 시약은 ethanol(Daejung, Gyeonggi, Korea), acetic acid(Merck, Darmstadt, Germany), sodium hydroxide(Samchun Chemicals, Gyeonggi, Korea) 배지는 Lactobacilli MRS agar(MRS agar, Difco, Detroit, MI, USA), Potato dextrose agar(PDA agar, Merck)를 사용하였다. 기타 HPLC 분석용 시약은 분석급을 사용하였다.
데이터처리
- 3) Means with different letters (a-f) in a row are significantly different (p<0.05) by Duncan's multiple range test.
- 본 연구의 결과는 3번 반복하여 평균(土표준편차)을 구한값을 사용하였다. 각 항목에 따른 자료분석을 위하여 SPSS program(ver.
- 0, IBM Company, Armonk, NY, USA)을이용하였다. 분산분석(ANOVA)을 실시하여 처리물질의 유의성을 검토한 후 유의성이 있는 경우의 차이 검증을 위해 Duncan's multiple range test로 각 시료 간의 사후검증을 하였다.
성능/효과
- T1과 T3의 경우는 발효 초기 함유 효모의 수가 적었지만 비교적 빠른 효모의 성장이 일어나면서 최종 효모의 수는 7 log CFU/mL 범위를 나타내었다. T2, T4 효모의 성장은 발효 12시간까지는 근 차이를 보이지 않다가 이후 증가를 하여 T1보다 효모의 알코올 발효가 늦게 일어남을 알 수 있었다. 효모는 알코올 발효를 통하여 특유의 향이 나게 하는 원인이 되며 따라서 관능검사를 실시하지는 않았으나 타락의 향기성분을 주도하는 것으로 생각되었다(17).
- 52 mg/mL 범위를 나타내었으며 이것은 발효 원인 막걸리에서 유래한 에탄올 함량이라 여겨진다. T4를 제외한 T1, T2, T3에서 발효시간에 따라 에탄올 함량이 증가하는 것을 알 수 있는데 T1의 경우 증가의 폭이 가장 커서 발효 16시간까지 꾸준한 증가를 보여 0.69 mg/mL를 나타내었고 이후 완만한 증가를 보여 발효 24시간에는 0.71 mg/mL로 나타났다. T3의 경우 또한 발효 20시간까지 꾸준한 증가를보여 0.
- 적정산도는 발효시간에 따른 pH 변화의 결과와 반비례하여 발효가 진행됨과 동시에 증가하는 추세를 보였다. 가장 높은 산도를 보인 것은 T1로 발효 4시간 이후 급격한 산도의 증가를 보여 발효 24시간에는 0.73%의 값을 나타냈다.
- 58 mg/ mL glucose가 검출되었지만 이 또한 점차 감소하여 발효 20시간부터는 검출되지 않았다. 검출된 glucose와 fruc- tose는 원료 중 발효 원인 막걸리에서 유래된 것으로 보이며 이를 발효 중 젖산균과 효모가 단당류인 glucose와 fruc- tose를 초기 발효원으로 사용하여 16시간 이후에는 검출되지 않은 것으로 생각된다. 쌀의 품종 및 누룩에 따른 막걸리의 품질 특성에 관한 Lee 등(15)의 연구에서는 원료를 달리하여 담근 막걸리에서 49.
- 타락에서의 분리된 균주는 효모인 Saccharomyces cerevisiae와 다양한 Pediococcus acidilactici, Lactobacillus fermentum, Leuconostoc mesenteroides 등의 다양한 젖산균이 나타났다. 따라서 타락은 효모와 젖산균이 공존하는 효모-젖산균 발효유임을 알 수 있었다.
- mesen- teroides의 영향(Table 3)으로 이 균주는 우유에서 citric acid를 소비하여 diacetyl을 생성할 수 있는 것으로 알려져 있다(13, 14). 또한 초반 acetic acid를 0.1% 첨가한 것에서 유래한 것으로 여겨지는 acetic acid가 발효 0시간부터 소량 검출되었으며 이후 완만히 증가되었다. 제조된 타락에서 분리된 균주들은 Lactobacillus sp.
- 71 mg/mL를 나타내었다. 발효산물로는 주된 유기산이 lactic acid로 발효 시간에 따라 점차 증가하여 발효 24시간에서는 모든 시료에서 전체 유기산 생성량의 80% 이상을 차지하였으며 이외에 미량의 acetic acid, citric acid, succinic acid도 검줄되었다. 발효와 더불어 검출된 주된 유리당은 lactose였고 소량의 glucose가 나타났다.
- 젖산균에 의한 lactose 대사과정 중 생성되는 glucose는 약 95%가 lactic acid로 전환되며, 이 lactic acid는 발효유제품의 풍미, 조직 및 영양 면에서 중요한 역할을 담당하게 된다(13). 생성된 lactic acid는 4개의 실험군 모두에서 전체 유기산 생성량의 80% 이상을 차지하였다. Citric acid는 원료에서 유래하여 발효 0시간에 가장 높게 검출되었다.
- 64의 범위를 나타내어 우유의 등전점에 도달하였다. 우유의 응고과정은 크게 산에 의한 응고, 열에 의한 응고, 단백분해효소에 의한 응고 등으로 나뉠 수 있는데 본 실험에서는 등전점에 도달하기 전에 겔을 형성하는 모습을 보여 다양한 유기산의 생성으로 인하여 pH가 등전점에 도달하는 산에 의한 응고 이외에 단백분해효소에 의한 소수기 간의 응고가 복합적으로 일어난 것으로 보인다. T2, T3은 발효 24시간 동안 완만하게 감소하여 24시간에도 등전점에 도달하지 못하였으나 각각 발효 8시간과 4시간째부터 겔을 형성하기 시작하였다(8).
- 또한 본 실험에서 사용된 시판 막걸리의 경우 검출된 유리당 외에 다양한 감미료와 aspartame등이 사용되었다. 이를 통하여 발효 24시간까지의 타락에서는 단당류인 glucose와 fructose 등의 단당류 및 막걸리에서 유래한 감미료를 우선적으로 기질로 사용하여 발효를 하는 것으로 생각되었으며 이로 인하여 발효기간에 따른 lac- tose의 변화는 크지 않았다.
- 이외에 succinic acid도 소량 생성되었다. 이를 통하여 타락은 정상젖산 발효균과 이상젖산 발효균이 혼재하는 발효유임을 알 수 있고 이때의 발효를 이끄는 균주에 따라서 유기산의 생성량이 달라지는 것으로 생각되었다.
- 이처럼 타락이 발효가 진행되면서 pH 의 감소 양상이 다른 것은 발효를 주도하는 젖산균의 차이에의 하며, 우유에 함유된 당을 기질로 소비하여 lactic acid와 이외의 유기산을 생성하면서 pH가 감소되는 것으로 생각되었다(9). 적정산도는 발효시간에 따른 pH 변화의 결과와 반비례하여 발효가 진행됨과 동시에 증가하는 추세를 보였다. 가장 높은 산도를 보인 것은 T1로 발효 4시간 이후 급격한 산도의 증가를 보여 발효 24시간에는 0.
- 분석하였으며 관여 미생물을 분석하였다. 제조된 타락에서의 pH는 발효시간에 따라 유의적으로(P<0.001) 감소되어 pH 5.56~6.49를 나타내고 산도는 유의적으로(P<0.001) 증가하여 0.17~0.40%의 값을 나타내었다. 점도는 유 청이 분리되기 전까지 유의적으로(P<0.
- 73 log CFU/mL였다. 타락에서의 분리된 균주는 효모인 Saccharomyces cerevisiae와 다양한 Pediococcus acidilactici, Lactobacillus fermentum, Leuconostoc mesenteroides 등의 다양한 젖산균이 나타났다. 따라서 타락은 효모와 젖산균이 공존하는 효모-젖산균 발효유임을 알 수 있었다.
- 2와 같다. 타락을 처음 제조한 0시간은 각각 발효 원인 시판 막걸리 함유 젖산균으로 인해 T1, T3 은 5 log CFU/mL 수준의 젖산균이, T2, T4의 경우에는 6 log CFU/mL 정도의 젖산균이 존재함을 알 수 있었다. 이 중 T1과 T3의 타락이 가장 빠른 젖산균의 성장을 보였는데 T1은 발효 12시간에 9.
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