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문제 정의
- 따라서 본 연구에서는 알칼리 사용에 따른 갈변을 최소화하고 영양적으로 우수한 천마 단백질을 보다 효율적으로 추출하기 위하여 용출 및 침전 pH 조건을 설정하고자 하였다. 즉, 천마 단백질의 용출 및 침전 pH를 달리하여 단백질을 추출 및 침전시키고, 각 pH에 따른 단백질의 갈변 도와 함량을 측정하여 알칼리 추출의 최적 pH 조건을 설정하고자 하였다.
- 본 연구에서는 알칼리 사용에 따른 갈변을 최소화하고 영 양적으로 우수한 천마 단백질을 보다 효율적으로 추출하기 위하여 용출 및 침전 pH에 따른 단백질의 갈변도와 함량을 측정함으로써 탈지 천마 단백질 알칼리 추출의 최적 pH 조건을 설정하고자 하였다. 천마의 수분은 약 15%로 측정되었으며, 대부분 탄수화물로 구성되어 있었고, 단백질의 함량이 높은 것으로 확인되었다.
- 즉, 천마 단백질의 용출 및 침전 pH를 달리하여 단백질을 추출 및 침전시키고, 각 pH에 따른 단백질의 갈변 도와 함량을 측정하여 알칼리 추출의 최적 pH 조건을 설정하고자 하였다.
제안 방법
- 얻어진 침전 단백질은 중량대비 l:2(w/v)의 증류수를 가하여 여러 차례 수세한 후, 다시 원심분리하여 침전물을 얻었고 다시 증류수를 가하여 충분히 균질화하였다. 균질화한 단백질 수용액의 pH를 7로 중화시켰으며, 얻은 단백질 수용액의 단백질 함량을 측정하는데 사용하였다.
- 측정하였다. 시료 20 yL에 BCA reagent(bidnchommc acid solution : copper(H) sulfate pentahydrate 4% solution=50 : 1, v/v) 160 pL를 혼합하여 37C에서 30분간 반응시켰으며, 560 nm에서 흡광도를 측정 (Epoch microplate spectrophotometer, BioTek, Winooski, VT, USA)하였다. 이때 단백질 함량은 bovine serum albumin(BSA)을 표준품으로 작성한 검량곡선을 이용하여 산출하였다.
- 알칼리 추출 시 pH 변화에 따른 단백질 함량 및 갈변 도를 살펴보기 위해 용출 pH에 따른 단백질 함량과 갈변 도를 측정하였으며, 결과는 Fig. 1에 나타내었다. 단백질 함량은 대부분 용출 pH가 증가할수록 유의적으로 증가하였으나 pH 9와 pH 10에서는 유의적인 차이를 보이지 않았다.
- 즉, 추출된 단백질 분획을 1 N HC1 을 이용하여 pH를 조정하였으며, 30분 동안 상온에서 방치한 다음 10, 000 rpm에서 원심분리 (Supta-21K, Hanil)하여 침전 단백질을 얻었다. 얻어진 침전 단백질은 중량대비 l:2(w/v)의 증류수를 가하여 여러 차례 수세한 후, 다시 원심분리하여 침전물을 얻었고 다시 증류수를 가하여 충분히 균질화하였다. 균질화한 단백질 수용액의 pH를 7로 중화시켰으며, 얻은 단백질 수용액의 단백질 함량을 측정하는데 사용하였다.
- 용출 pH에 따른 단백질 추출 정도를 비교하기 위해 각각의 탈지 천마를 다양한 알칼리 조건에서 용출시켰다. 즉, 탈지 천마 10 g에 80 mL의 증류수를 넣고 1 N NaOH를 이용하여 pH를 & 9, 1Q 11 및 12로 조정하였다.
- 시료 20 yL에 BCA reagent(bidnchommc acid solution : copper(H) sulfate pentahydrate 4% solution=50 : 1, v/v) 160 pL를 혼합하여 37C에서 30분간 반응시켰으며, 560 nm에서 흡광도를 측정 (Epoch microplate spectrophotometer, BioTek, Winooski, VT, USA)하였다. 이때 단백질 함량은 bovine serum albumin(BSA)을 표준품으로 작성한 검량곡선을 이용하여 산출하였다.
- 즉, 수분은 수분 자동측정기 (FD-720, Kett, Tokyo, Japan)를, 조지방은 조지 방 자동추출기(Soxtec 2050, Foss, Hoganas, Sweden)를 이용하여 측정하였으며, 조회 분은 직접 회화법으로, 조단백 질은 Micro Kjeldahl 장치 (Distillation Unit B-323, Buchi, Flawil, S* witzerland) 이용하여 측정하였다. 조섬유는 조섬유 자동추출기(Fiber test F-6, Raypa, Barcelona, Spain)를 이용하여 측정하였으며, 탄수화물은 시료 전체를 100%로 하고 수분, 조단백, 조지방, 조회분 함량(%)을 감한 것으로 산출하였다.
- Japan)하여 나타내었다. 즉, 각 시료에 단백질 응집으로 인한 파장의 산란을 최소화하기 위해 16%(w/v) sodium dodecyl sulfiite(SDS)를 첨가하였으며, 대조구는 증류수에 16% SDS를 첨가하여 측정하였다.
- 함량을 측정하여 평가하였다. 즉, 수분은 수분 자동측정기 (FD-720, Kett, Tokyo, Japan)를, 조지방은 조지 방 자동추출기(Soxtec 2050, Foss, Hoganas, Sweden)를 이용하여 측정하였으며, 조회 분은 직접 회화법으로, 조단백 질은 Micro Kjeldahl 장치 (Distillation Unit B-323, Buchi, Flawil, S* witzerland) 이용하여 측정하였다. 조섬유는 조섬유 자동추출기(Fiber test F-6, Raypa, Barcelona, Spain)를 이용하여 측정하였으며, 탄수화물은 시료 전체를 100%로 하고 수분, 조단백, 조지방, 조회분 함량(%)을 감한 것으로 산출하였다.
- 제거하였다. 즉, 천마분말과 n-hexane(Duksan Co., Ansan, Korea)을 1:1 비율로 섞어 25X:에서 48시간 동안 교반시켰으며, 교반 후 감압농축기 (R-124, Buchi, Flawil, Switzerland)로 hexane을 날려 보내고 동결건조(FD-1, Eyela, Toleo, Japan)하여 단백질 추출에 이용하였다.
- 용출 pH에 따른 단백질 추출 정도를 비교하기 위해 각각의 탈지 천마를 다양한 알칼리 조건에서 용출시켰다. 즉, 탈지 천마 10 g에 80 mL의 증류수를 넣고 1 N NaOH를 이용하여 pH를 & 9, 1Q 11 및 12로 조정하였다. 이 혼합물을 상온에서 60분간 교반하여 10, 000 rpm에서 30분 동안 원심분리 (Supra-2 IK, Hanil, Incheon, Korea) 한 다음 상등액을 취하였다.
- 천마의 일반성분은 수분, 조지방, 조회분, 조단백, 조섬유의 함량을 측정하여 평가하였다. 즉, 수분은 수분 자동측정기 (FD-720, Kett, Tokyo, Japan)를, 조지방은 조지 방 자동추출기(Soxtec 2050, Foss, Hoganas, Sweden)를 이용하여 측정하였으며, 조회 분은 직접 회화법으로, 조단백 질은 Micro Kjeldahl 장치 (Distillation Unit B-323, Buchi, Flawil, S* witzerland) 이용하여 측정하였다.
- 탈지 천마 단백질의 알칼리 용출은 Gnanasambandam과 Hettiarachdiy(9)5] 방법을 약간 변형하여 추출하였다. 용출 pH에 따른 단백질 추출 정도를 비교하기 위해 각각의 탈지 천마를 다양한 알칼리 조건에서 용출시켰다.
대상 데이터
- 본 실험에서는 2012년 4월 전라북도 무주군에서 수확하여 건조시킨 건천마를 믹서기(M-1211, Starion, Busan, Korea)로 곱게 간 다음, 60 mesh의 체에 통과시켜 -4OC 에보관하면서 실험에 사용하였다.
데이터처리
- 본 연구의 결과는 3회 이상 반복 실험으로 얻어진 값의 평균과 표준편차로 나타내었으며, 각 실험결과에 대한 통계분석은 SPSS 통계 프로그램 (Statistics Package for the Social Sdence, 21.0, SPSS Inc., Chicago, IL, USA)을 사용하여 분석하였다. 즉, 각 실험군 간의 차이를 유의수준 p<0.
- , Chicago, IL, USA)을 사용하여 분석하였다. 즉, 각 실험군 간의 차이를 유의수준 p<0.05 에서 one-way ANOVA(Analysis of Variation)로 분석한 뒤 Duncan's multiple range test로 평균치간의 유의적 차이를 검증하였다.
이론/모형
- 알칼리 용출에 의해 얻은 탈지 천마 단백질의 갈변도는 Song 등(14)의 방법에 따라 흡광도를 측정 (U-2900, Hitachi, Tokyo, Japan)하여 나타내었다. 즉, 각 시료에 단백질 응집으로 인한 파장의 산란을 최소화하기 위해 16%(w/v) sodium dodecyl sulfiite(SDS)를 첨가하였으며, 대조구는 증류수에 16% SDS를 첨가하여 측정하였다.
- 용출 단백질과 침전 단백질의 단백질 함량은 biandoiinic acid(BCA)법(15)으로 측정하였다. 시료 20 yL에 BCA reagent(bidnchommc acid solution : copper(H) sulfate pentahydrate 4% solution=50 : 1, v/v) 160 pL를 혼합하여 37C에서 30분간 반응시켰으며, 560 nm에서 흡광도를 측정 (Epoch microplate spectrophotometer, BioTek, Winooski, VT, USA)하였다.
성능/효과
- 2와 같다. pH 12에서 용출된 단백질을 제외한 모든 시료에서 pH 4로 침전시킨 pellet의 단백질 함량이 유의적으로 많았으며, pH 12에서 용출시켜 pH 4로 침전시킨 pellet의 경우 유의적인 차이는 보이지 않았으나 가장 많은 단백질을 함유하고 있었다. 또한 상등액의 단백질 함량은 pH 8에서 용출된 시료를 제외하고 모든 실험군에서 pH 4로 침전시킨 것이 가장 적은 것으로 확인되었다.
- 1%의 높은 회수율을 보이고 있으나 갈변이심 하여 단백질의 품질이 떨어질 것으로 판단된다. 따라서 38.7%의 회수율을 보인 용출 pH 9와 침전 pH 4가 천마 단백질 추출을 위한 최적 추출 pH로 판단된다.
- 뿐만 아니라 단백질의 회수율도 침전 pH가 4일 때가장 높은 값을 나타내었다. 따라서 갈변도와 단백질 함량을 고려한 탈지 천마 단백질 추출을 위한 최적조건은 용출 pH 9와 침전 pH 4로 결정되었다.
- 천마 단백질의 주요 아미노산인 glutamic acid의 등전점이 pH 4이므로 용해도는 pH가 4일 때 가장 낮고 단백질의 침전이 가장 많이 일어난다(22). 따라서 탈지 천마 단백질의 회수율은 용출 pH에 상관없이 pH가 4일 때 가장 높은 것으로 확인되었다. 비록 용출 pH 12, 침전 pH 4에서 단백질 회수율이 58.
- pH 12에서 용출된 단백질을 제외한 모든 시료에서 pH 4로 침전시킨 pellet의 단백질 함량이 유의적으로 많았으며, pH 12에서 용출시켜 pH 4로 침전시킨 pellet의 경우 유의적인 차이는 보이지 않았으나 가장 많은 단백질을 함유하고 있었다. 또한 상등액의 단백질 함량은 pH 8에서 용출된 시료를 제외하고 모든 실험군에서 pH 4로 침전시킨 것이 가장 적은 것으로 확인되었다. 용출 pH가 증가할수록 상등액 에 남아있는 단백질의 비율이 약 45%에서 15%로 30% 감소하는 경향을 보였으며, pH 4에서 침전된 단백질은 전체 단백질의 약 10%만이 상등액에 포함되어 있었다.
- 3과 같다. 모든 용출 pH에서 침전 pH가 4일 때 가장 많은 단백질을 회수할 수 있었으며, 침전 pH가 2인 경우에는 대부분 가장 낮은 회수율을 나타내었으나 용출 pH가 8과 9인 조건에서는 침전 pH가 6인 경우보다 더 높은 회수율을 보였다. 단백질을 구성하는 아미노산은 전기적 성질에 따라 등전점이 달리 나타나며, 이에 따라 산성, 중성, 염기성으로 나눌 수 있다.
- Kim 등(10)은 미강단백질의 침전 pH 조사 결과, pH 4의 상등액에 남아있는 단백질의 양이 다른 pH에 비해 가장 적었다고 보고하여 본 연구 결과와 유사하였다. 반면, 회수한 단백질의 약 15~30%가 상등액에 여전히 남아있는 것으로 보고하여 본 연구 결과와 차이를 보였다 즉, 미강 단백질에 비해 천마 단백질은 pH 4에서 단백질 추출 효율이 크게 증가했음을 확인할 수 있었다.
- 침전 pH에 따른 단백질 함량은 pH 4에서 침전된 pdtet이가장 많은 함량을 나타내었으며, 상등액의 단백질 함량 또한 대부분 pH 4로 침전시킨 경우 가장 적은 것으로 확인되었다. 뿐만 아니라 단백질의 회수율도 침전 pH가 4일 때가장 높은 값을 나타내었다. 따라서 갈변도와 단백질 함량을 고려한 탈지 천마 단백질 추출을 위한 최적조건은 용출 pH 9와 침전 pH 4로 결정되었다.
- 또한 상등액의 단백질 함량은 pH 8에서 용출된 시료를 제외하고 모든 실험군에서 pH 4로 침전시킨 것이 가장 적은 것으로 확인되었다. 용출 pH가 증가할수록 상등액 에 남아있는 단백질의 비율이 약 45%에서 15%로 30% 감소하는 경향을 보였으며, pH 4에서 침전된 단백질은 전체 단백질의 약 10%만이 상등액에 포함되어 있었다. 반면 pH 2 또는 6에서 침전 시 20% 정도의 단백질이 상등액에 남아있는 것으로 확인되었다.
- 천마의 수분은 약 15%로 측정되었으며, 대부분 탄수화물로 구성되어 있었고, 단백질의 함량이 높은 것으로 확인되었다. 이러한 단백질을 다양한 pH에서 용출시 킨 결과 pH가 증가함에 따라 용출된 단백질의 양이 증가하였으며, 갈변도 또한 증가함을 보였다. 침전 pH에 따른 단백질 함량은 pH 4에서 침전된 pdtet이가장 많은 함량을 나타내었으며, 상등액의 단백질 함량 또한 대부분 pH 4로 침전시킨 경우 가장 적은 것으로 확인되었다.
- 조건을 설정하고자 하였다. 천마의 수분은 약 15%로 측정되었으며, 대부분 탄수화물로 구성되어 있었고, 단백질의 함량이 높은 것으로 확인되었다. 이러한 단백질을 다양한 pH에서 용출시 킨 결과 pH가 증가함에 따라 용출된 단백질의 양이 증가하였으며, 갈변도 또한 증가함을 보였다.
- 이러한 단백질을 다양한 pH에서 용출시 킨 결과 pH가 증가함에 따라 용출된 단백질의 양이 증가하였으며, 갈변도 또한 증가함을 보였다. 침전 pH에 따른 단백질 함량은 pH 4에서 침전된 pdtet이가장 많은 함량을 나타내었으며, 상등액의 단백질 함량 또한 대부분 pH 4로 침전시킨 경우 가장 적은 것으로 확인되었다. 뿐만 아니라 단백질의 회수율도 침전 pH가 4일 때가장 높은 값을 나타내었다.
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