Current drying and encapsulation methods for probiotics manufacturing are complicate and cost-burdened processes. The aim of this study was to develop a simple ingredient mixture to make probiotic granules via one-step process, providing not only a cryoprotective effect during freezing and drying bu...
Current drying and encapsulation methods for probiotics manufacturing are complicate and cost-burdened processes. The aim of this study was to develop a simple ingredient mixture to make probiotic granules via one-step process, providing not only a cryoprotective effect during freezing and drying but also high survival ratio in gastrointestinal tract. As cryoprotectans, commercially available ingredients including skim milk, monosaccharide (trehalose or glycerin), maltodextrins (with low or high degree of equivalents) were used. Their cryoprotective effect during lyophilization and survival ratios in artificial gastric juice and bile salt were measured against 3 strains of lactic acid bacteria (LAB) (Lactobacillus plantarum, Lb. brevis, and Lactococcus lactis). As results, 3 mixtures with different compositions showed a cryprotective effect on LAB tested and the best compostion was dependant upon LAB; skim milk 10%, trehalose 15%, glycerin 0.5%, and NaCl 1% was for Lb. plantarum and Lc. lactis, and maltodextrin 10% instead of skim milk was for Lb. brevis. In addition, those mixtures showed similar survival effect on LAB tested. These results demonstrate that skim milk or maltodextrins with trehalose, glycerin, and NACl can be effectively used for onestep lyophilization of LAB as an alternative method of encapsulation.
Current drying and encapsulation methods for probiotics manufacturing are complicate and cost-burdened processes. The aim of this study was to develop a simple ingredient mixture to make probiotic granules via one-step process, providing not only a cryoprotective effect during freezing and drying but also high survival ratio in gastrointestinal tract. As cryoprotectans, commercially available ingredients including skim milk, monosaccharide (trehalose or glycerin), maltodextrins (with low or high degree of equivalents) were used. Their cryoprotective effect during lyophilization and survival ratios in artificial gastric juice and bile salt were measured against 3 strains of lactic acid bacteria (LAB) (Lactobacillus plantarum, Lb. brevis, and Lactococcus lactis). As results, 3 mixtures with different compositions showed a cryprotective effect on LAB tested and the best compostion was dependant upon LAB; skim milk 10%, trehalose 15%, glycerin 0.5%, and NaCl 1% was for Lb. plantarum and Lc. lactis, and maltodextrin 10% instead of skim milk was for Lb. brevis. In addition, those mixtures showed similar survival effect on LAB tested. These results demonstrate that skim milk or maltodextrins with trehalose, glycerin, and NACl can be effectively used for onestep lyophilization of LAB as an alternative method of encapsulation.
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문제 정의
따라서, 본 연구에서는 서로 다른 프로바이오틱스 유산균을 대상으로 동결건조시 위장과 소장 환경에서 높은 생존율을 보이는 동결보호첨가제의 조성을 찾고자 하였다. 이를 위해, 전통 발효식품에서 선발된 3종 유산균 (Lactobacillusplantarum JSA22, Lactobacillus brevis JSB22, Lactococcus lactis I13)에 대하여, 냉동 및 건조시 단백질 변성방지 효과 및 흡습성이 낮은trehalose를 기반으로 기존 산업체에서 주로 사용하는 다당류 및 단백질 성분들로 동결건조 과정과 인체내의 소화 환경에서의 유산균의 활성 실험을 수행하였다.
본 연구에서는 3가지 유산균 균주를 프로바이오틱스 분말 상품으로 제조하기 위해 몇가지 첨가물 조성에 대해 동결보호 및 장관 내 안정성 향상 효과를 조사하였다. 종래 연구된 마이크로캡슐화 코팅 [10]은 알지네이트나 검류 등을 첨가하는 추가공정이 필요하여, 소규모 생산 라인에 적용하기에는 시간 소요와 비용 상승의 부담이 있었다.
제안 방법
회수된 균체는 다양한 조성의 동결보호제를 각 균주에 1:1로 혼합한 뒤 샘플링하여 생균수를 측정하였다. -80℃ 초저온 냉동고 (DF8517, Ilshinlab., Korea)에서 12시간 동결 후, 동결건조기 (FD8508, Ilshinlab., Korea)로 실온 (25~29℃)에서 응축기 온도 -80℃ , 압력 5 mmTorr 이하의 조건에서 72시간 건조하고 생균수를 측정하였다. 동결보호제 조성은 Table 1과 같다.
종래 연구된 마이크로캡슐화 코팅 [10]은 알지네이트나 검류 등을 첨가하는 추가공정이 필요하여, 소규모 생산 라인에 적용하기에는 시간 소요와 비용 상승의 부담이 있었다. 또한 기존 동결보호제연구들은 동해 방지 효과를 주로 조사하였으나, 본 연구에서는 동결보호 효과와 함께 각각의 유산균의 위산과 담즙산에 대한 내성 향상 효과도 함께 분석하였다.
모든 인공 담즙액은 Lactobacilli MRS broth (Difco, Detroit,MI, USA)에 0.45 µm filter로 여과한 oxgall (Difco, USA)용액을 0.3% 첨가하여 제조하였다 [15,16].
본 연구에서 사용된 균주는 국립농업과학원 발효이용과에서 분양 받은 Lactobacillus plantarum JSA22 (KACC91973P),Lactobacillus brevis JSB22 (KACC91760P) 그리고 Lactococcus lactis I13 균주를 사용하였다. 상기 균주들은 보존을 위하여 균배양액을 10% skim milk와 10% glycerin (w/v)로 조성된 보관액에 혼합하여 -80℃ 초저온 냉동고에서 보관하였으며, 멸균된 MRS 배지 (Difco, USA)에 접종하여 37℃ 배양기에서 24시간 배양하였고 3회 이상 계대배양을 거친 균주를 실험에 사용하였다.
동결건조는 유산균을 가장 효과적으로 보존할 수 있는 방법이지만, 동결 건조시 동해 (凍凍)로 인한 세포손상이 일어나게 된다. 이를 경감할 목적으로, 식품산업에서 흔히 사용하는 단백질, 다당, 올리고당, 단당 성분들로 동결보호제를 제조하고 이들을 각각 처리하여 동결건조하였다 (Table 1). 동결건조 후 생존율을 비교한 결과, 각각의 대조구와 실험구간 유의적 차이가 나타났다 (p<0.
따라서, 본 연구에서는 서로 다른 프로바이오틱스 유산균을 대상으로 동결건조시 위장과 소장 환경에서 높은 생존율을 보이는 동결보호첨가제의 조성을 찾고자 하였다. 이를 위해, 전통 발효식품에서 선발된 3종 유산균 (Lactobacillusplantarum JSA22, Lactobacillus brevis JSB22, Lactococcus lactis I13)에 대하여, 냉동 및 건조시 단백질 변성방지 효과 및 흡습성이 낮은trehalose를 기반으로 기존 산업체에서 주로 사용하는 다당류 및 단백질 성분들로 동결건조 과정과 인체내의 소화 환경에서의 유산균의 활성 실험을 수행하였다.
3% 첨가하여 제조하였다 [15,16]. 인공 담즙액 9 mL에 각각의 동결건조된 균주를 1g씩 넣고, 0시간과 2시간 경과 후, 샘플링하여 멸균 생리 식염수로 단계희석하고 Lactobacilli MRS Agar medium (Difco, USA)에 도말하여 37℃ 배양기에서 24시간 배양한 다음 집락의 수를 측정하였다. 대조군은 Lactobacilli MRS broth (Difco, Detroit, MI, USA)에서 배양하여 실험구와 동일하게 실험하였다.
1으로 조정한 Lactobacilli MRS broth (Difco, USA)에 pepsin (Sigma, USA)을 1,000 unit/mL가 되도록 첨가하여 인공위액을 조제하였다. 인공위액 9 mL에 각각의 동결건조된 균주를 1 g씩 넣고 0시간과 2시간 경과 후, 샘플링하여 멸균 생리 식염수로 단계별로 희석하고 Lactobacilli MRS Agar medium (Difco, USA)에 도말하였다. 그리고 37℃ 배양기에서 24시간 배양한 다음 집락의 수를 측정하였다.
체내 소화관 조건과 유사한 환경에서 측정하기 위하여 인공위액 내성 실험을 실시하였다. Kobayashi 등 [8,14]의 방법을 변형하여 1 N HCl로 pH 2.
3회 이상 계대배양을 거친 균주를MRS medium에 접종하여 37°C 배양기에서 24시간 배양한 후, 배양액을 원심분리기 (DHC-250A, Hanil, Korea)로 분리하여 균체를 회수하였다. 회수된 균체는 다양한 조성의 동결보호제를 각 균주에 1:1로 혼합한 뒤 샘플링하여 생균수를 측정하였다. -80℃ 초저온 냉동고 (DF8517, Ilshinlab.
대상 데이터
동결보호제의 재료는 모두 식품원료인 skim milk (Seoulmilk,Korea), maltodextrin (dextrose equivalent, DE 14~19, Daesang,Korea), low DE maltodextrin (DE 10~12, Daesang, Korea), trehalose (Samyang genex, Korea), glycerin (LG H&H, Korea),NaCl (Young Jin Green Foods, Korea)을 사용하였다.
본 연구에서 사용된 균주는 국립농업과학원 발효이용과에서 분양 받은 Lactobacillus plantarum JSA22 (KACC91973P),Lactobacillus brevis JSB22 (KACC91760P) 그리고 Lactococcus lactis I13 균주를 사용하였다. 상기 균주들은 보존을 위하여 균배양액을 10% skim milk와 10% glycerin (w/v)로 조성된 보관액에 혼합하여 -80℃ 초저온 냉동고에서 보관하였으며, 멸균된 MRS 배지 (Difco, USA)에 접종하여 37℃ 배양기에서 24시간 배양하였고 3회 이상 계대배양을 거친 균주를 실험에 사용하였다.
데이터처리
통계분석은 SPSS (Statistical Package for the Social Science,Ver 12.0, SPSS Inc., Chicago, USA) program을 이용하여 각 측정 군의 평균과 표준편차를 산출하였으며 분산분석을 실시한 후 Duncan의 다중검정을 실시하였다.
성능/효과
또한,Lb. brevis JSB22는 동결보호제의 첨가가 큰 영향력을 나타냈으며, maltodextrin 10%, trehalose 15%, glycerin 0.5%, NaCl 1% 조성에서 가장 큰 유의적 차이를 보였다. 결과적으로 3균주 모두 동결보호제를 첨가하지 않았을 때보다 동결보호제를 첨가했을 때, 동결건조 후에 생존율이 높았다.
특히, Lb. plantarum JSA22는 동결보호제를 첨가하지 않은 1번 조성보다, skim milk 10%, trehalose 15%,glycerin 0.5%, NaCl 1%로 구성된 2번 조성에서 유의한 증가가 크게 나타났다. 또한, Lb.
5%, NaCl 1% 조성에서 가장 큰 유의적 차이를 보였다. 결과적으로 3균주 모두 동결보호제를 첨가하지 않았을 때보다 동결보호제를 첨가했을 때, 동결건조 후에 생존율이 높았다. 또한 인공위액 저항성을 알아보기위해 동결 건조 후의 유산균을 인공위액에서 2시간 배양하였다.
lactis I13 역시 동결보호제를 첨가한 모든 조성에서 유의적 차이를 보였으며, 특히 2, 4번 조성에서 유의적 효과가 보다 높았다. 결론적으로, 3균주 모두 동결보호제를 처리하지 않았을 때보다 동결보호제를 처리시 인공 위액에 대한 내성을 보였다. 특히 Lb.
또한 인공위액 저항성을 알아보기위해 동결 건조 후의 유산균을 인공위액에서 2시간 배양하였다. 그 결과 3균주 모두 동결보호제를 첨가한 조성이 동결보호제를 첨가하지 않은 조성에 비해 높은 유의적 효과를 보였다. 특히, Lc.
동결건조 후 생존율을 비교한 결과, 각각의 대조구와 실험구간 유의적 차이가 나타났다 (p<0.05).
동결보호제 조성별 동결건조 균체에 0.3% oxgall을 함유한 인공 담즙액에 각각 2시간 처리한 결과, 4가지 조성 모두 생균수 1010 CFU/mL 이상으로 유의한 차이를 나타내어 인공담즙에 대한 저항성을 보였다 (Fig. 3). Lb.
본 실험에서 동결보호제의 첨가 유무와 종류에 따라 그 영향을 살펴본 결과, 동결건조 전과 후 생존율은 균주에 따라 그리고 동결보호제 조성에 따라 차이가 있었다. Lb.
05). 세가지 유산균 모두 보호제를 첨가한 경우에서 첨가하지 않은 대조구에 비해 높은 생존율을 보였다. 특히, Lb.
lactis I13의 경우도 3, 4번 조성이1번 조성과는 다른 유의적 차이가 나타나 높은 생존율을 보였다. 요약하면, 본 실험에 사용한 3개 균주 모두 공통적으로 인공 담즙산에 대해 일정 수준의 저항성을 갖고 있었으며, 첨가한 동결보호제에 의해 그 저항성이 더 향상되었다.
인공담즙액에 대한 저항성의 경우도 동결보호제를 첨가하지 않은 조성보다 동결보호제를 첨가한 조성이 유의적 차이를 보이며, 생존율과 1010 CFU/mL 이상의 높은 균수를 나타내었다. 이와 같이 동결보호제를 첨가하였을 때 동결 및 위액과 담즙액에 대한 보호효과가 향상되었으며, 그 효과는 유산균에 따라 최적 동결보호제 조성이 각각 달랐다. 본 실험에서 사용한 동결보호제 조성을 각종 프로바이오틱스 생산에 적용한다면,유산균이 위장과 소장에서 생존하여 보다 많은 균체가 대장으로 이동할 수 있을 것으로 기대된다.
lactis I13의 경우 maltodextrin을 10% 첨가한 동결보호제와 10% skim milk를 첨가한 동결보호제에서 유의한 효과를 보였으며, 나머지 2균주는 10% skim milk를 첨가한 동결보호제가 효과가 있었다. 인공담즙액에 대한 저항성의 경우도 동결보호제를 첨가하지 않은 조성보다 동결보호제를 첨가한 조성이 유의적 차이를 보이며, 생존율과 1010 CFU/mL 이상의 높은 균수를 나타내었다. 이와 같이 동결보호제를 첨가하였을 때 동결 및 위액과 담즙액에 대한 보호효과가 향상되었으며, 그 효과는 유산균에 따라 최적 동결보호제 조성이 각각 달랐다.
후속연구
본 실험에서 사용한 동결보호제 조성을 각종 프로바이오틱스 생산에 적용한다면,유산균이 위장과 소장에서 생존하여 보다 많은 균체가 대장으로 이동할 수 있을 것으로 기대된다. 또한, 본 연구는 기존연구되었던 복잡한 다단계 코팅기술보다 간편하면서 동시에 높은 유산균 생존 효과를 제공하여 다양한 프로바이오틱스 제품 제조에 적용 가능할 것으로 판단된다.
이와 같이 동결보호제를 첨가하였을 때 동결 및 위액과 담즙액에 대한 보호효과가 향상되었으며, 그 효과는 유산균에 따라 최적 동결보호제 조성이 각각 달랐다. 본 실험에서 사용한 동결보호제 조성을 각종 프로바이오틱스 생산에 적용한다면,유산균이 위장과 소장에서 생존하여 보다 많은 균체가 대장으로 이동할 수 있을 것으로 기대된다. 또한, 본 연구는 기존연구되었던 복잡한 다단계 코팅기술보다 간편하면서 동시에 높은 유산균 생존 효과를 제공하여 다양한 프로바이오틱스 제품 제조에 적용 가능할 것으로 판단된다.
질의응답
핵심어
질문
논문에서 추출한 답변
프로바이오틱스란?
현재 식품의약품안전처가 분석한 ‘2013년 건강기능식품 생산실적’에 따르면 국내 프로바이오틱스는 2012년 대비 생산액이 55% 증가하였고, 이는 유산균과 장내면역, 장내미생물의 중요성에 대한 소비자의 인식이 높아진데 따른다 [1]. 프로바이오틱스란 ‘체내에 들어가서 건강에 좋은 효과를 주는 살아있는 균’으로 정의되며, 유익한 유산균 증식, 유해균 억제 또는 배변활동 원활에 도움을 준다. 유산균을 비롯한 세균들이 프로바이오틱스로 인정받기 위해서는 위산과 담즙산에서 살아남아 소장까지 도달한 후, 장에서 증식하고 정착하여 장관 내에서 유용한 효과를 나타내어야 한다 [2].
프로바이오틱스가 체내에서 유익한 이유는?
현재 식품의약품안전처가 분석한 ‘2013년 건강기능식품 생산실적’에 따르면 국내 프로바이오틱스는 2012년 대비 생산액이 55% 증가하였고, 이는 유산균과 장내면역, 장내미생물의 중요성에 대한 소비자의 인식이 높아진데 따른다 [1]. 프로바이오틱스란 ‘체내에 들어가서 건강에 좋은 효과를 주는 살아있는 균’으로 정의되며, 유익한 유산균 증식, 유해균 억제 또는 배변활동 원활에 도움을 준다. 유산균을 비롯한 세균들이 프로바이오틱스로 인정받기 위해서는 위산과 담즙산에서 살아남아 소장까지 도달한 후, 장에서 증식하고 정착하여 장관 내에서 유용한 효과를 나타내어야 한다 [2].
프로바이오틱스 건조 균주를 코팅 또는 캡슐화하기 위한 다단공정의 문제점은 무엇인가?
프로바이오틱스 건조 균주를 코팅 또는 캡슐화하기 위한 최근 연구에 따르면, 대부분 동결건조와 코팅으로 구분되는 2단계 이상의 다단공정을 제안하고 있다 [10-13]. 하지만, 이러한 다단공정은 높은 생존율을 제공하는 반면, 실제 생산 현장에 적용될 때에 공정이 복잡하고 다량의 첨가제들이 소요되는 문제점이 있다. 또한, 이러한 다단공정에서 프로바이오틱스의 높은 생존율을 유지하기 위해서는 매우 엄격한 공정관리 기술이 함께 확립되어야 한다. 한편, 사료용과 같은 프로바이오틱스 상품의 경우에는 비용과 효율을 함께 고려하여, 최소한의 첨가물을 이용하여 최소단계로 생산하는 공정의 개발이 필요하다.
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