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문제 정의
- 본 연구에서는 RAW264.7 세포, B16/F10 멜라닌세포주 및 사람진피섬유아세포 (human dermal fibroblast, HDF)를 이용하여 용담초 추출물이 독성실험, 항산화, 항염, 멜라닌 및 콜라겐 생성에 미치는 영향을 비교 분석하여 천연화장품으로서 용담초의 사용 가능성을 제시하고자 한다.
제안 방법
- 피부에서 색소 침착의 정도는 멜라닌 지수로 평가될 수 있으며, 피부 표면의 멜라닌 수치는 안면피부의 색소 침착 형태, 자외선에 대한 민감도 등을 파악하는데 주요한 평가 지표가 된다. 본 실험에서는 용담초 추출물의 멜라닌 형성에 미치는 영향을 평가하기 위한 전 단계로 B16/F10 세포에 대한 독성을 확인하기 위해 B16/F10 세포에 용담초 추출물을 농도별로 처리하여 48시간 동안 배양한 후 NR assay를 수행하였다. 실험 결과 거의 모든 농도에서 세포 생존율이 100% 이상 나타나 세포 독성이 없는 것으로 확인 할 수 있었다(Fig.
- 이러한 MMPs의 발현과 활성이 증가하게 되면 collagen 분해를 촉진시켜 피부노화를 일으키는 중요한 원인이 된다. 본 실험에서는 용담초 추출물이 MMP-1의 생성 변화에 미치는 영향을 알아보기 위한 전 단계로 HDF 세포에 대한 독성을 확인하기 위해 HDF 세포에 용담초 추출물을 농도별로 처리하여 48시간 동안 배양한 후 NR assay를 수행하였다. 실험 결과 모든 농도에서 세포생존율이 95% 이상으로 나타났다(Fig.
- 용담초 에탄올 추출물의 항산화, 항염증, 멜라닌 및 콜라겐 생성에 미치는 영향을 알아보기 위하여 RAW264.7 세포, B16/F10 세포, HDF 세포들을 활용하여 세포독성과 세포내 NO (Nitric Oxide) 생성량을 측정하였고, 세포내 멜라닌 생성 억제 실험과 MMP-1 발현 변화 실험을 실시한 결과 다음과 같은 결과를 얻었다.
- 용담초 추출물의 NO 생성에 미치는 영향을 평가하기 위한 전 단계로 RAW264.7 세포에 대한 독성을 확인하기 위해 RAW264.7 세포에 용담초 추출물을 농도별로 처리하여 48시간 동안 배양한 후 NR assay를 수행하였다. 실험 결과 용담초 추출물을 5-20 µg/mL의 농도로 첨가하였을 때, 대체로 90% 이상의 생존율을 유지하였다.
- 용담초 추출물이 멜라닌 생성에 미치는 영향을 조사하기 위해 B16/F10 세포에 멜라닌세포 자극호르몬(α-Melanocyte Stimulating Hormone, α-MSH) 10 nM을 처리하여 멜라닌생성을 유도하고 동시에 용담초 추출물 1.25, 2.5, 5, 10, 20 µg/mL의 농도로 처리한 후 멜라닌 생성량을 비교하였다. 실험 결과 α-MSH 단독 처리 한 경우 멜라닌 함량이 대조군에 비하여 뚜렷하게 증가하는 것을 확인 할 수 있었으며, 용담초 추출물을 20 ㎍/mL의 농도로 처리한 경우 멜라닌 생성이 62% 억제되었다(Fig.
대상 데이터
- 한국 세포주 은행 (Korea)에서 분양받은 RAW264.7 macrophage 세포, B16/F10 mouse melanoma 세포, human dermal fibroblast (HDF) 세포는 10% FBS, 1% antibiotic-antimycotic을 첨가한 DMEM을 사용하여 37℃, 5% CO2 배양기에서 배양하였다.
이론/모형
- DPPH 라디칼은 매우 안정한 활성산소 (reactive oxygen species, ROS)이며, 이 라디칼을 소거하는 정도로써 항산화 작용을 평가할 수 있으며 라디칼 소거활성은 Blois의 방법으로 측정하였다13). 용담초 에탄올 추출물을 10 ∼ 50 µg/mL의 농도로 용해시킨 후 96 well plate에 0.
- SOD 유사 활성은 Marklund와 Marklund의 방법14)에 따라 과산화수소(H2O2)로 전환반응을 촉매시키는 pyrogallol의 생성량을 측정하여 SOD 유사 활성으로 나타내었다. 일정 농도의 시료 0.
- 실험에서 사용된 시료의 세포 독성을 나타내는 농도 범위는 neutral red (NR) assay를 이용하여 확인하였다15). 연구에 사용한 세포주는 RAW264.
- 용담초 추출물이 HDF 세포에서 MMP-1 생성에 미치는 영향을 확인하고자 ELISA 방법을 이용하였다. 먼저 HDF 세포를 96 well plate에 2×103/well로 부착한 후 UVB 25 mJ/㎠를 조사한 다음 용담초 추출물을 1.
- 용담초 추출물이 MMP-1의 생성 변화에 미치는 영향을 알아보기 위하여 용담초 추출물을 HDF세포에 24시간 동안 처리한 후 배양 상층액을 취하여 ELISA 방법으로 MMP-1 함량을 측정하였다. UVB 25 mJ/㎠를 조사한 HDF 세포에 용담초 추출물을 1.
- 용담초 추출물이 RAW264.7 세포 배양에서 NO 생성에 미치는 영향을 측정하기 위해 Green 등의 방법17)에 따라 세포배양액 내 NO 양을 nitrite (NO2-)와 nitrate (NO3-) 형태로 측정하였다. RAW264.
성능/효과
- 용담초 추출물이 MMP-1의 생성 변화에 미치는 영향을 알아보기 위하여 용담초 추출물을 HDF세포에 24시간 동안 처리한 후 배양 상층액을 취하여 ELISA 방법으로 MMP-1 함량을 측정하였다. UVB 25 mJ/㎠를 조사한 HDF 세포에 용담초 추출물을 1.25, 2.5, 5, 10, 20 µg/mL을 처리한 결과, 용담초 추출물 5 µg/mL까지 농도 의존적으로 MMP-1 발현을 억제하였다(Fig. 4B).
- 이러한 MMPs의 발현과 활성이 증가하게 되면 collagen 분해를 촉진시켜 피부노화를 일으키는 중요한 원인이 되며26) 이러한 단백질 가수분해물로부터 얻어진 펩타이드가 주름 개선, 보습 증진, 탄력 증가와 특정 피부 효능 소재로 활용되고 있으며, 대표적인 것이 콜라겐 가수분해물이다27,28). 본 실험에서 MMP-1 활성 변화에 미치는 영향을 조사한 결과 HDF세포에 UVB를 조사하면 MMP-1 활성이 크게 증가하였고 용담초 추출물을 첨가하면 이들의 활성이 감소하는 것으로 나타났다.
- 색소 세포인 멜라닌은 외부 환경으로부터 피부세포를 보호해 주는 역할을 하지만 자외선 노출 및 피부노화로 인해 생리기능이 떨어지게 되면 멜라닌이 국소적으로 과도하게 합성되거나 피부표면에 침착되어 기미, 주근깨 및 다양한 색소 침착을 형성하고 심하게는 피부암을 유발하는 것으로 알려져 있다25). 본 실험에서 용담초 에탄올 추출물이 melanin 생성에 미치는 영향을 조사한 결과, 용담초 추출물 20 µg/mL 농도에서 멜라닌 생성이 62% 억제된 것으로 나타났다.
- 본 실험에서 용담초 추출물이 RAW264.7 cell에서 LPS에 의해 유도되는 NO의 생성을 억제시키는지의 여부를 평가 한 결과 용담초 추출물 20 ㎍/mL의 농도에서 NO 생성이 80% 이상 억제되는 것으로 나타나 항염 작용이 매우 우수한 것으로 나타났다.
- 본 실험에서 용담초 추출물이 항산화 활성에 미치는 영향을 조사한 결과, 항산화 활성은 농도 의존적으로 증가하였으며 DPPH radical 소거능에서는 10 µg/ml의 용담초 추출물을 처리 하였을 때는 크게 변화가 보이지 않았으나 50 µg/ml 농도에서는 55%의 높은 DPPH radical 소거능을 나타나는 것을 확인 할 수 있었다.
- 5, 5, 10, 20 µg/mL의 농도로 처리한 후 멜라닌 생성량을 비교하였다. 실험 결과 α-MSH 단독 처리 한 경우 멜라닌 함량이 대조군에 비하여 뚜렷하게 증가하는 것을 확인 할 수 있었으며, 용담초 추출물을 20 ㎍/mL의 농도로 처리한 경우 멜라닌 생성이 62% 억제되었다(Fig. 3B).
- 7 세포, B16/F10 세포와 HDF 세포의 생존율은 90% 이상 나타나 세포 독성이 없는 것을 확인하였다. 용담초 에탄올 추출물은 B16/F10 세포의 melanin 생성을 유의하게 감소시켰으며 HDF 세포에서 MMP-1 발현을 억제하였고 RAW264.7 세포에서 NO 생성을 유의하게 억제하였다.
- 용담초 에탄올 추출물은 DPPH radical 소거능과 SOD 유사 활성이 농도 의존적으로 높게나타났으며 20 µg/mL 농도에서 RAW264.7 세포, B16/F10 세포와 HDF 세포의 생존율은 90% 이상 나타나 세포 독성이 없는 것을 확인하였다. 용담초 에탄올 추출물은 B16/F10 세포의 melanin 생성을 유의하게 감소시켰으며 HDF 세포에서 MMP-1 발현을 억제하였고 RAW264.
- 용담초 추출물을 이용하여 RAW264.7 cell에서 LPS에 의해 유도되는 NO의 생성을 억제시키는지의 여부를 평가 한 결과 용담초 추출물 1.25, 2.5, 5, 10, 20 ㎍/mL의 농도로 처리하였을 때, LPS 처리군에 비해 농도 의존적으로 NO 생성이 억제되는 것으로 나타났다(Fig. 5B).
후속연구
- 이상의 결과 용담초 추출물은 본 실험에서 다양한 세포에 대해 독성을 나타내지 않았으며 항산화, 멜라닌 및 콜라겐 생성 효능 및 항염 효능을 가지고 있는 것으로 보아 기능성 소재로서의 활용성이 있을 것이라 사료된다.
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