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문제 정의
- 위와 같은 결과를 더욱 심도 있게 확인하고자 급성 염증 단계에서 만성 염증 단계로 진행될 경우 반응하는 매개체들을 확인하고자 하였다.
- 이에 본 연구에서는 최 등11)과 김 등12)의 in-vitro 연구를 통해 밝혀진 항염증 효능에 착안하여 2주간의 용담초 추출물 투여를 진행하고 LPS를 체내에 주입함으로써 면역력 증진에 따른 염증 반응에 대한 신속하고 효과적인 제거능을 면역과 관련된 다양한 혈액학적 인자를 통해 확인한 결과, 유의한 결과를 얻었기에 보고하는 바이다.
제안 방법
- 2주간의 적응기 이후 자유 식이를 진행하는 정상군 (Normal)과 증류수만을 투여하는 대조군 (Control), 용담초 추출물을 200, 400 ㎎/㎏/day로 투여하는 실험군 등 총 4개 그룹으로 나누어 매일 오후 2시에 oral zonde를 이용하여 200 ㎕를 2주간 경구 투여하였다. 2주간의 경구 투여 종료 후 대조군과 실험군은 1 ㎎/㎏ 농도의 LPS를 복강 주사를 통해 체내에 주입하고 3시간 후에 ethyl ether로 마취하여 심장 천자법으로 채혈을 진행하였다.
- 2주간의 적응기 이후 자유 식이를 진행하는 정상군 (Normal)과 증류수만을 투여하는 대조군 (Control), 용담초 추출물을 200, 400 ㎎/㎏/day로 투여하는 실험군 등 총 4개 그룹으로 나누어 매일 오후 2시에 oral zonde를 이용하여 200 ㎕를 2주간 경구 투여하였다. 2주간의 경구 투여 종료 후 대조군과 실험군은 1 ㎎/㎏ 농도의 LPS를 복강 주사를 통해 체내에 주입하고 3시간 후에 ethyl ether로 마취하여 심장 천자법으로 채혈을 진행하였다.
- 본 연구에서는 용담초 추출물의 면역 증진 효능을 객관적으로 검증하기 위하여 2주간 200 ㎎/㎏/day과 400 ㎎/㎏/day 용량을 투여한 후 LPS를 체내에 투입하여 급성 염증을 유발하고 획득한 혈액 바이오마커를 확인한 결과 다음과 같은 결론을 얻었다.
- 심장 천자법을 이용하여 채취한 혈액을 3,000 rpm에서 15분간 원심 분리하여 얻은 혈청을 통해 염증 반응 관련 매개체인 Cytokine 및 reactive oxygen species; ROS, prostaglandin E2; PGE2, leukotriene B4; LTB4 등을 Luminex 또는 ELISA 기법을 통해 제조사의 프로토콜에 따라 측정하였다.
- 혈액 내 백혈구 수, 백혈구 내 단핵구 및 호중구, 림프구 비율 등의 면역세포 수를 측정하였다. 백혈구 수와 백혈구 내 호중구 비율은 용담초 추출물을 400 ㎎/㎏/day로 경구 투여한 실험군에서 대조군에 비해 유의성 있는 증가를 보였다(Table 1).
대상 데이터
- 본 실험에 사용한 중국산 용담초는 대원약업사 (Korea)에서 구매하여, 물 500 ㎖에 용담초 50 g을 넣어 100℃에서 3시간 동안 추출하였다. 이후 여과액을 얻어 rotary vacuum evaporator에서 감압 농축하고 얻은 용액을 freeze dryer로 동결 건조하여 5.
- 수컷 5주령의 ICR 마우스는 나라바이오텍 (Korea)사에서 구매하였고, 동물은 실험 당일까지 할란사료(2018S, Hanlan,U.S.A.)와 음수를 충분히 공급하고, 온도 22±2℃, 습도 50~60%, 낮과 밤 주기 12시간 (light-dark cycle)의 환경에서 2주간 적응시킨 후 경희대학교 동물실험 윤리위원회 가이드라인 (KHUASP(SE)-17-013)에 따라서 수행되었다.
- 연구에 사용된 시약은 Lipopolysaccharide (LPS : Sigma Co., U.S.A.), PBS (Welgene Inc., Korea), Ethyl ether(Samchun, Korea), Microtainer® tube with Dipotassium EDTA (BD Co., U.S.A.), Mouse cytokine milliplex map immunoassay kit (Millipore Co., U.S.A.), Mouse reactive oxygen species ELISA kit (MyBioSource, U.S.A.), Prostaglandin E2 ELISA kit (Elabscience, U.S.A.), LTB4 parameter assay kit (R&D system, U.S.A.) 등을 사용하였으며, 기기는 환류 추출기(Mtops, Korea), rotary vacuum evaporator (Büchi B-480, Switzerland), freeze dryer(IlShinBio, Korea), deep freezer (Sanyo, Japan), centrifuge(Sigma CO., U.S.A.), Luminex (Millipore, U.S.A.), ELISA reader (Molecular Devices Co., U.S.A.) 등을 사용하였다.
데이터처리
- The statistical significance of differences between control and experimental groups (** : p < 0.01) based on ANOVA with student's t - test determined.
- The statistical significance of differences between normal and control groups (++ : p < 0.01) or control and experimental groups (* : p < 0.05, ** : p < 0.01) based on ANOVA with student's t - test determined.
- The statistical significance of differences between normal and control groups (+++ : p < 0.001) or control and experimental groups (* : p < 0.05, ** : p < 0.01, *** : p < 0.001) based on ANOVA with student's t - test determined.
- The statistical significance of differences between normal and control groups (+++ : p < 0.001) or control and experimental groups (** : p < 0.01, *** : p < 0.001) based on ANOVA with student's t-test determined.
- 각 처리군의 비교는 one-way analysis of variance (ANOVA) 방법을 이용하였고, Student’s t-test를 사용하여 통계적 유의성을 검증하였다(p < 0.001, p < 0.01, p < 0.05).
- 본 연구의 실험 결과는 평균값±표준 편차 (mean ± S.D.)로 표시하였다.
이론/모형
- 심장 천자법을 이용하여 채취한 혈액을 EDTA 튜브에 담아 백혈구 및 백혈구 내 호중구, 대식세포, 림프구 비율 등은 서울의 과학연구소 (Korea)에 분석 의뢰하였다.
성능/효과
- 1. 용담초 추출물을 400 ㎎/㎏/day로 경구 투여한 실험군에서 대조군에 비해 백혈구 수와 백혈구 내 호중구 수의 유의성 있는 증가를 보였으며, 200, 400 ㎎/㎏/day로 경구 투여한 두 실험군은 백혈구 내 대식세포와 림프구 수의 유의성 있는 증가 또는 감소를 보였다.
- 2. 용담초 추출물을 200, 400 ㎎/㎏/day로 경구 투여한 두 실험군은 대조군에 비해 IL-1β및 IL-6, TNF-α 생성량의 유의성 있는 감소를 보였으며, IL-10 생성량의 유의성 있는 증가를 보였다.
- 3. 용담초 추출물을 200, 400 ㎎/㎏/day로 경구 투여한두 실험군은 대조군에 비해 PGE2 생성량의 유의성 있는 증가를 보였다.
- 4. 용담초 추출물을 200, 400 ㎎/㎏/day로 경구 투여한 두 실험군은 대조군에 비해 ROS 및 LTB4 생성량의 유의성 있는 감소를 보였다.
- 이와 같은 염증 반응의 결과, 인체에 올바르게 작용하면 미생물을 제거하지만, 종종 세포 또는 조직에 손상을 끼쳐 폐염, 간염, 기관지염 등과 같은 염증성 질환을 유도하는 감염증이 발생하기도 한다. 따라서 인체에서 안전하고 효과적인 염증 반응을 통해 면역력을 증진할 수 있는 천연물의 탐색을 통해 夏枯草4), 紅景天5), 白屈菜6), 沙蔘7), 忍冬藤8)등과 같은 단일 약재 등에 대해 실험적인 효능이 입증되었다.
- 본 연구에서 용담초 추출물을 400㎎/㎏/day로 경구 투여한 실험군에서 대조군에 비해 백혈구와 백혈구 내 호중구 수의 유의성 있는 증가를 보였다. 또한, 200 ㎎/㎏/day과 400 ㎎/㎏/day로 경구 투여한 두 실험군은 백혈구 내 대식세포 수의 유의성 있는 증가, 백혈구 내 림프구 수의 유의성 있는 감소를 보였다. 이와 같은 결과는 용담초 추출물의 섭취가 선천 면역을 강화하여 LPS를 체내에 주입하였을 때 염증 반응이 빠르게 효과적으로 나타나 급성 염증 반응단계에서 면역세포가 빠르고 효과적으로 작용함으로써 만성단계로 넘어가는 것을 방어하고 있음을 보여주고 있다.
- 이상의 결과를 종합해 볼 때, 용담초 추출물의 섭취는 급성 염증 시 혈액 내 백혈구 수, 백혈구 내 단핵구 및 호중구 수가 증가함으로써 감염성 질환 및 외부물질에 대한 방어기능을 수행되는 것이 확인되었다. 또한, 용담초 추출물은 염증 반응에 대해 염증과 면역촉진 사이토카인의 길항작용과 더불어 급성 염증에서 만성 염증단계로의 전환을 방지하는 PGE2의 증가, 백혈구의 부착과 활성을 중재시키고 호중구에서 잠재적인 화학적 물질이자 ROS를 형성하는 LTB4의 감소 결과는 용담초 추출물이 급성 염증 유발 시 신속하고 효과적인 방어를 할 수 있음을 나타내고 있다. 특히, 용담초 추출물의 농도 의존적인 효능 결과를 바탕으로 최적의 섭취 농도를 확보하는 연구가 보강된다면 선천 면역을 높여 체내 외부물질 침투에 대한 1차적 방어를 효과적으로 할 수 있는 우수한 천연물로 판단된다.
- 또한, 항염증성 사이토카인 IL-10 생성량은 용담초 추출물을 200 ㎎/㎏/day과 400 ㎎/㎏/day으로 경구 투여한 두 실험군에서 대조군에 비해 유의성 있는 증가를 보였다(Table 2).
- 백혈구 내 대식세포 및 림프구 비율은 용담초 추출물을 200㎎/㎏/day과 400 ㎎/㎏/day으로 경구 투여한 두 실험군에서 대조군에 비해 유의성 있는 증가 또는 감소를 보였다(Table 1).
- 혈액 내 백혈구 수, 백혈구 내 단핵구 및 호중구, 림프구 비율 등의 면역세포 수를 측정하였다. 백혈구 수와 백혈구 내 호중구 비율은 용담초 추출물을 400 ㎎/㎏/day로 경구 투여한 실험군에서 대조군에 비해 유의성 있는 증가를 보였다(Table 1).
- IL-1β, IL-6, TNF-α등은 염증 발생에 관여하는 염증성 사이토카인으로 림프구를 활성화하고 염증 반응을 야기시키며, 반대로 IL-10은 염증 억제에 관여하는 항염증성 사이토카인이자 면역조절 사이토카인으로써 B세포의 증식을 유도하는 것으로 알려져 있다15-18). 본 연구에서 용담초 추출물을 200 ㎎/㎏/day과 400 ㎎/㎏/day로 경구 투여한 두 실험군에서 대조군에 비해 염증성 사이토카인의 유의성 있는 감소와 항염증성 사이토카인의 유의성 있는 증가를 보였다. 이는 급성 염증 반응에 대해 용담초 추출물의 투여가 사이토카인 조절에 따른 염증 반응 억제 효능을 보여주고 있으며, 면역세포 결과와 부합되는 기전이 나타나 용담초 추출물이 선천 면역반응에 따른 만성 염증으로의 전환을 억제하고 있음을 더욱 증명하고 있다.
- ROS는 계속되는 급성 염증 반응 시 파고리소좀 (phagolysosome)을 통해 식작용으로 이입된 미생물을 제거하며20), LTB4는 호중구에서 잠재적인 화학주성인자 (chemoattractant)이자 ROS를 형성하고 백혈구의 부착과 활성을 중재시키는 역할을 하게 된다21). 본 연구에서 용담초 추출물을 200 ㎎/㎏/day과 400 ㎎/㎏/day로 경구 투여한 두 실험군은 대조군에 비해 PGE2 생성량의 유의성 있는 감소와 ROS 및 LTB4 생성량의 유의성 있는 증가를 보였다. 이와 같은 결과는 PGE2 생성이 증가된 결과를 통해 염증반응의 주된 반응을 바탕으로 침투된 이물질 제거를 신속하게 진행하며, 만성 염증 단계로의 전환을 방어하는 것을 ROS 및 LTB4 결과를 통해 확인하였다.
- . 본 연구에서 용담초 추출물을 400㎎/㎏/day로 경구 투여한 실험군에서 대조군에 비해 백혈구와 백혈구 내 호중구 수의 유의성 있는 증가를 보였다. 또한, 200 ㎎/㎏/day과 400 ㎎/㎏/day로 경구 투여한 두 실험군은 백혈구 내 대식세포 수의 유의성 있는 증가, 백혈구 내 림프구 수의 유의성 있는 감소를 보였다.
- 본 연구에서 용담초 추출물을 200 ㎎/㎏/day과 400 ㎎/㎏/day로 경구 투여한 두 실험군에서 대조군에 비해 염증성 사이토카인의 유의성 있는 감소와 항염증성 사이토카인의 유의성 있는 증가를 보였다. 이는 급성 염증 반응에 대해 용담초 추출물의 투여가 사이토카인 조절에 따른 염증 반응 억제 효능을 보여주고 있으며, 면역세포 결과와 부합되는 기전이 나타나 용담초 추출물이 선천 면역반응에 따른 만성 염증으로의 전환을 억제하고 있음을 더욱 증명하고 있다.
- 이상의 결과를 종합해 보면, 용담초 추출물은 면역력 증진효능을 통해 체내에 이물질 침투 시 발열, 혈관 확장, 통증 등의 염증 반응의 증상을 바탕으로 면역세포 및 사이토카인 조절을 통해 만성 염증 단계로의 전환을 효과적으로 낮추는 것이 혈액 바이오마커 검증을 통해 입증되었다. 따라서 용담초 추출물은 선천 면역을 높일 수 있는 식·의약품 소재로 활용될 수 있다고 판단된다.
- 이상의 결과를 종합해 볼 때, 용담초 추출물의 섭취는 급성 염증 시 혈액 내 백혈구 수, 백혈구 내 단핵구 및 호중구 수가 증가함으로써 감염성 질환 및 외부물질에 대한 방어기능을 수행되는 것이 확인되었다. 또한, 용담초 추출물은 염증 반응에 대해 염증과 면역촉진 사이토카인의 길항작용과 더불어 급성 염증에서 만성 염증단계로의 전환을 방지하는 PGE2의 증가, 백혈구의 부착과 활성을 중재시키고 호중구에서 잠재적인 화학적 물질이자 ROS를 형성하는 LTB4의 감소 결과는 용담초 추출물이 급성 염증 유발 시 신속하고 효과적인 방어를 할 수 있음을 나타내고 있다.
- 본 연구에서 용담초 추출물을 200 ㎎/㎏/day과 400 ㎎/㎏/day로 경구 투여한 두 실험군은 대조군에 비해 PGE2 생성량의 유의성 있는 감소와 ROS 및 LTB4 생성량의 유의성 있는 증가를 보였다. 이와 같은 결과는 PGE2 생성이 증가된 결과를 통해 염증반응의 주된 반응을 바탕으로 침투된 이물질 제거를 신속하게 진행하며, 만성 염증 단계로의 전환을 방어하는 것을 ROS 및 LTB4 결과를 통해 확인하였다.
- 또한, 200 ㎎/㎏/day과 400 ㎎/㎏/day로 경구 투여한 두 실험군은 백혈구 내 대식세포 수의 유의성 있는 증가, 백혈구 내 림프구 수의 유의성 있는 감소를 보였다. 이와 같은 결과는 용담초 추출물의 섭취가 선천 면역을 강화하여 LPS를 체내에 주입하였을 때 염증 반응이 빠르게 효과적으로 나타나 급성 염증 반응단계에서 면역세포가 빠르고 효과적으로 작용함으로써 만성단계로 넘어가는 것을 방어하고 있음을 보여주고 있다.
- 혈청 중 LTB4 생성량은 대조군에서 정상군에 비해 유의성 있는 증가를 보인 반면, 용담초 추출물을 200 ㎎/㎏/day과 400 ㎎/㎏/day로 경구 투여한 두 실험군에서 대조군에 비해 유의성 있는 감소를 보였다(Fig. 3).
- 혈청 중 PGE2 생성량은 용담초 추출물을 200 ㎎/㎏/day과 400 ㎎/㎏/day로 경구 투여한 두 실험군에서 대조군에 비해 유의성 있는 증가를 보였다(Fig. 1).
- 혈청 중 ROS 생성량은 대조군에서 정상군에 비해 유의성 있는 증가를 보인 반면, 용담초 추출물을 200 ㎎/㎏/day과 400 ㎎/㎏/day로 경구 투여한 두 실험군에서 대조군에 비해 유의성 있는 감소를 보였다(Fig. 2).
- 혈청 중 염증성 사이토카인(IL-1β, IL-6, TNF-α등) 생성량은 대조군에서 정상군에 비해 유의성 있는 증가를 보인 반면, 용담초 추출물을 200 ㎎/㎏/day과 400 ㎎/㎏/day로 경구 투여한 두 실험군에서 대조군에 비해 유의성 있는 감소를 보였다(Table 2).
후속연구
- 따라서 용담초 추출물은 선천 면역을 높일 수 있는 식·의약품 소재로 활용될 수 있다고 판단된다.
- 또한, 용담초 추출물은 염증 반응에 대해 염증과 면역촉진 사이토카인의 길항작용과 더불어 급성 염증에서 만성 염증단계로의 전환을 방지하는 PGE2의 증가, 백혈구의 부착과 활성을 중재시키고 호중구에서 잠재적인 화학적 물질이자 ROS를 형성하는 LTB4의 감소 결과는 용담초 추출물이 급성 염증 유발 시 신속하고 효과적인 방어를 할 수 있음을 나타내고 있다. 특히, 용담초 추출물의 농도 의존적인 효능 결과를 바탕으로 최적의 섭취 농도를 확보하는 연구가 보강된다면 선천 면역을 높여 체내 외부물질 침투에 대한 1차적 방어를 효과적으로 할 수 있는 우수한 천연물로 판단된다.
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