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문제 정의
- 또한 미강을 발효하게 되면 미강보다 SOD 활성이 증가한다는 보고18)가 있어 황칠과 미강을 혼합하여 발효한 황칠·미강 발효 추출물의 미백효과와 그 작용기전을 알아보기 위하여 인간 유래 악성 흑색종 세포주인 B16F10 세포에 본 시료를 처리한 다음 세포생존율과 멜라닌 생합성 저해율을 관찰하고, 멜라닌 생성과 관련된 기전을 확인하고자 tyrosinase 활성 저해율 및 superoxide dismutase 유사활성도를 측정한 결과 유의성을 얻었기에 보고하는 바이다.
제안 방법
- 1%) 투입한 다음 90일간 발효를 하였다. 이후 황칠·미강 발효 추출물(시료, Vinegar fermentation of Korean Dendorpanax and Rice bran mixture, VDR)의 미백효과 및 그 기전을 알아보기 위하여 인간 유래 악성 흑색종 세포주인 B16F10 세포를 이용해 세포생존율, 멜라닌 생합성 저해율, tyrosinase 활성 저해율 및 SOD 유사활성도를 측정하였다.
- 황칠·미강 발효 추출물(VDR)이 멜라닌 생성에 미치는 영향은 Hosei 등의 방법19)을 변형하여 측정하였다. B16F10 세포를 배양하여 24 well plate에 각 well당 1×105 cell/well의 농도로 분주하고, 부착 및 안정화를 위하여 24 시간을 배양하였다.
- 황칠과 미강을 배합한 후 90일간 발효한 추출물이 미백효과 및 그 작용기전을 알아보기 위하여 흑색종 세포주인 B16F10 세포를 이용하여 세포생존율, 멜라닌 생합성 저해율, tyrosinase 활성 저해율 및 superoxide dismutase 유사활성도를 측정한 결과 다음과 같은 결론을 얻었다.
대상 데이터
- 인간 유래 악성 흑색종(melanoma) 세포주인 B16F10 cell lines은 한국세포주은행(KCLB, Korea)에서 구입하였다. B16F10 세포주의 생육 배지로는 DMEM(Gibco, 11995-065)을 이용하였고, 배지에는 10% fetal bovine serum(Gibco LOT.
데이터처리
- 수합된 데이터 통계처리 방법으로는 SigmaPlot 11.1 (www.systat.com)를 활용하여 one-way ANOVA 기법으로 처리하였고, 통계적으로 유의한 경우 사후검정은 Tukey 방법을 시행하였다. p-value가 0.
이론/모형
- 황칠·미강 발효 추출물(VDR)이 tyrosinase 활성에 미치는 저해 효과는 Yagi et al. 방법20)을 이용하여 측정하였다. 0.
- 황칠·미강 발효 추출물(VDR)이 세포 내 tyrosinase 활성에 미치는 저해 효과는 Martinez-Esparza et al. 방법21)을 이용하였다. B16F10 세포를 배양하여 pertri-dish에 각 1×106 cell/dish의 농도로 분주한 후, 부착 및 안정화를 위해 24 시간 동안 방치한 후 VDR 500 ㎍/㎖로 처리한 다음 5% CO2 incubator에서 37℃를 유지하면서 24 시간을 추가로 배양하였다.
- 황칠·미강 발효 추출물(VDR)의 SOD 유사활성도는 Marklund와 Marklund의 방법22)에 따라 활성 산소종을 과산화수소(H2O2)로 전환시키는 반응을 촉매하는 pyrogallol의 생성량을 측정하여 SOD 유사활성으로 나타내었다. Vitamin 500 ㎍/㎖을 처리하였을 때의 SOD 유사활성을 양성대조군으로 하고, VDR 처리로 나타난 SOD 유사활성을 알아보기 위하여 각 농도별(62.
- 황칠·미강 발효 추출물(VDR)이 B16F10 세포에 미치는 생존율은 EZ-Cytox Assay kit를 통해 측정하였다. B16F10 세포를 배양하여 96 well plate에 각 well당 5×104 cell/well의 농도로 분주하고, 5% CO2 incubator에서 37℃를 유지하면서 24 시간 동안 pre-incubation시킨 후 VDR을 각 농도별(62.
성능/효과
- 본 시료가 멜라닌 생성에 미치는 영향을 관찰하기 위하여 B16F10 세포에 VDR 1,000 ㎍/㎖을 처리한 결과 아무런 처리하지 않았을 때보다 유의성 있게 멜라닌 생성을 억제하였고(Fig. 2), 또한 α-MSH 유도에 의한 멜라닌 생합성 저해율에서도 α-MSH 처리 시 증가되었던 멜라닌 생성이 α-MSH와 arbutin를 병용처리하였을 때 약간 감소하는 경향을 나타내었고, α-MSH와 VDR 500 ㎍/㎖를 병용처리하였을 때가 α-MSH를 단독 처리하였을 때보다 멜라닌 생성이 유의성 있게 억제되었다(Fig. 3).
- 본 시료가 비세포 tyrosinase 활성 저해에 미치는 효과를 관찰한 결과, 처리농도가 고농도일 때 tyrosinase 활성 저해율이 유의성 있게 증가하였고(Fig. 4), 본 시료를 처리한 세포 내 tyrosinase 활성 저해율도 아무런 처리를 하지 않은 처리군보다 유의하게 감소하였다(Fig. 5).
- 본 시료가 α-MSH 유도에 의한 tyrosinase 활성 저해에 미치는 효과를 알아본 결과(Fig. 6), α-MSH와 arbutin을 병용처리한 양성대조군의 tyrosinase 활성 저해율은 α-MSH 단독처리시보다 감소하였고, α-MSH와 VDR 500 ㎍/㎖를 병용처리하였을 때의 tyrosinase 활성 저해율은 α-MSH 단독처리 시와 α-MSH와 albutin을 병용처리하였을 때보다 유의성 있게 억제되었다. 이는 본 시료가 비세포 내와 세포 내에서 tyrosinase의 활성을 저해하여 멜라닌의 생성을 감소시킨 것으로 판단되고, 또한 미백 첨가제로 사용되는 arbutin보다도 tyrosinase의 활성을 저해하여 본 시료가 미백 첨가제로써의 산업적 가치도 있다고 생각된다.
- 본 시료는 비세포 내 tyrosinase의 활성을 유의성 있게 저해하였고, 세포 내에서도 아무런 처리를 하지 않았을 때보다 유의성 있게 억제하였다. 또한 α-MSH와 병용처리하였을 때의 세포 내 tyrosinase 활성 저해율은 α-MSH 단독처리 시와 α-MSH와 albutin을 병용처리하였을 때보다도 유의성 있게 억제되었다.
- 본 시료가 B16F10 세포의 생존율에 미치는 효과를 관찰한 결과 VDR 500 ㎍/㎖ 이상을 처리하였을 때 B16F10 세포의 생존율을 유의성 있게 억제하였다(Fig. 1).
- 본 시료가 멜라닌 생성에 미치는 영향을 관찰하기 위하여 B16F10 세포에 VDR 1,000 ㎍/㎖을 처리한 결과 아무런 처리하지 않았을 때보다 유의성 있게 멜라닌 생성을 억제하였고(Fig. 2), 또한 α-MSH 유도에 의한 멜라닌 생합성 저해율에서도 α-MSH 처리 시 증가되었던 멜라닌 생성이 α-MSH와 arbutin를 병용처리하였을 때 약간 감소하는 경향을 나타내었고, α-MSH와 VDR 500 ㎍/㎖를 병용처리하였을 때가 α-MSH를 단독 처리하였을 때보다 멜라닌 생성이 유의성 있게 억제되었다(Fig.
- 본 시료가 비세포 tyrosinase 활성 저해에 미치는 효과를 관찰한 결과, 처리농도가 고농도일 때 tyrosinase 활성 저해율이 유의성 있게 증가하였고(Fig. 4), 본 시료를 처리한 세포 내 tyrosinase 활성 저해율도 아무런 처리를 하지 않은 처리군보다 유의하게 감소하였다(Fig.
- 본 시료는 vitamin C를 처리하였을 때보다는 감소하였지만 처리농도에 의존해 SOD 활성도가 유의성 있게 증가하였다.
- 본 시료는 비세포 내 tyrosinase의 활성을 유의성 있게 저해하였고, 세포 내에서도 아무런 처리를 하지 않았을 때보다 유의성 있게 억제하였다. 또한 α-MSH와 병용처리하였을 때의 세포 내 tyrosinase 활성 저해율은 α-MSH 단독처리 시와 α-MSH와 albutin을 병용처리하였을 때보다도 유의성 있게 억제되었다.
- 본 시료는 처리농도 1,000 ㎍/㎖ 이상일 때 멜라닌 생성을 유의성 있게 억제하였고, α-MSH와 병용처리하였을 때는 α-MSH와 arbutin을 병용처리하였을 때보다도 감소하였으며, α-MSH를 단독처리하였을 때보다는 유의성 있게 억제하였다.
- 본 시료는 처리농도 500 ㎍/㎖ 이상일 때 B16F10 세포의 생존율을 유의성 있게 억제하였다.
- 본 연구는 미강과 황칠을 다양하게 배합한 후 발효 시간, 설탕 중량, 효소 투입량 등을 달리하면서 각각의 성분을 조사한 결과 최적의 상태를 나타낸 발효 추출물 중 미강 45 ㎏에 황칠 5 ㎏을 혼합한 후 설탕을 총 중량의 10%, 효소를 총 중량의 1000:1, 발효 온도는 20℃ 내외, 발효기간은 90일이었을 때가 최적의 조건이었다. 이렇게 발효된 추출물인 황칠·미강 발효 추출물 50 ㎖을 원심분리하여 찌꺼기를 제거하고 상층액을 얻은 후 동결건조기(삼원, 한국)를 이용하여 동결건조 분말(시료, Vinegar fermentation of Korean Dendorpanax and Rice bran mixture, VDR) 6.
- 이러한 이유로 본 시료가 SOD에 미치는 영향을 관찰하기 위하여 유사활성도를 측정한 결과, VDR을 처리한 군의 SOD 유사활성도는 비록 vitamin C를 처리하였을 때보다는 감소하였지만 처리농도에 의존해 SOD 유사활성도가 유의성 있게 증가하였고, 저농도 처리시보다 고농도를 처리하였을 때 SOD 유사활성도가 유의성 있게 증가하는 것으로 나타났다. 이와 같은 결과는 서 등40)이 SOD와 같은 항산화제가 H2O2의 산화적 스트레스에 대한 세포생존율을 증가시킴은 물론 tyrosinase의 활성을 감소시켜 활성산소의 산화적 스트레스에 대한 방어효과가 있음을 보고한 내용과 일맥상통한 것으로 본 시료는 자외선 등의 산화적 스트레스에 의한 색소침착에도 효과적으로 방어할 수 있을 것으로 판단되었다.
- 이상과 같이 미강과 황칠을 배합하여 90일 동안 발효한 추출물을 이용하여 미강의 산업적 가치와 함께 미백에 관련된 효능을 관찰한 결과 본 발효 추출물은 tyrosinase의 활성을 저해해 멜라닌의 생성을 억제하였으며, 또한 자외선 등의 산화적 스트레스에 대해서도 방어적인 효과를 나타냈다.
후속연구
- 6), α-MSH와 arbutin을 병용처리한 양성대조군의 tyrosinase 활성 저해율은 α-MSH 단독처리시보다 감소하였고, α-MSH와 VDR 500 ㎍/㎖를 병용처리하였을 때의 tyrosinase 활성 저해율은 α-MSH 단독처리 시와 α-MSH와 albutin을 병용처리하였을 때보다 유의성 있게 억제되었다. 이는 본 시료가 비세포 내와 세포 내에서 tyrosinase의 활성을 저해하여 멜라닌의 생성을 감소시킨 것으로 판단되고, 또한 미백 첨가제로 사용되는 arbutin보다도 tyrosinase의 활성을 저해하여 본 시료가 미백 첨가제로써의 산업적 가치도 있다고 생각된다.
- 이상과 같이 황칠·미강 발효 추출물은 tyrosinase의 활성을 저해함으로써 멜라닌의 생성을 억제하였고, 또한 자외선 등의 산화적 스트레스에 대한 방어적인 효과도 나타내어 이를 산업적으로 활용한다면 고부가가치를 창출할 것으로 기대되며, 또한 기능성이 강화된 식품으로도 활용할 수 있을 것으로 생각된다.
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