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문제 정의
- 그러나 바이오에어로졸에 대한 연구는 국제 표준화기구나 미국 환경보호국에서도 표준화된 방법을 정하지 않고 있어 연구자가 목적에 맞게 적절한 방법을 선택해야 하며[26], 환경 유형 별 종의 구성이 달라질 수 있어 다양한 환경에 대한 연구가 필요하나 유관연구는 매우 미흡한 실정이다. 따라서 본 연구에서는 환경 여건이 다른 몇 개의 지점을 대상으로 바이오에어로졸 시료를 채취하여 배양성 세균을 분리, 동정 및 계통분석을 수행하고 그 특성을 비교하고자 하였다.
제안 방법
- 이 후 phylogenetic editor (PHYDIT) ver. 3.2 [1]를 사용하여 염기서열의 peak를 분석하였으며, EzTaxon-e 서버[12]에서 세균을 동정하였다.
- 본 연구에서는 조건이 다른 몇몇의 환경(농업지역, 축산지역, 하수처리장, 해변 및 청정지역)을 대상으로 시료를 채취하였으며, 바이오에어로졸 중 배양성 미생물의 환경 유형별 특성을 분석하였다. 바이오에어로졸 중 배양성 미생물의 농도는 농업지역 밭 가운데와 습도가 높은 실내 조건 (축사내부 및 하수처리장)의 바이오에어로졸에서 높게 측정되었고, 하수처리장에서는 Bacillus속과 축산지역(특히 양계장 내부)에서는 Staphylococcus속이 우점하였으며, 양돈장 내부와 농업지역에서는 타 지역에 비해 많은 종이 출현하는 등 환경 유형별 특성이 나타났다.
대상 데이터
- airkorea. or.kr) 홈페이지를 참조하였다(Supplementary Table S1).
- 농업지역, 축산지역, 하수처리장, 해변 및 청정지역 등 다양한 환경여건을 갖는 지역을 대상으로 바이오에어로졸 시료를 채취하였다. 농업지역은 퇴비를 많이 사용하는 마늘밭과 농경지가 밀집되어 있는 지역을 선정하였고, 축산지역은 양계장, 소와 송아지 우리 및 양돈장을 대상으로 하였으며, 하수처리장은 국립환경과학원 인근에 위치한 지점을 대상으로 시료를 채취하였다.
- 농업지역, 축산지역, 하수처리장, 해변 및 청정지역 등 다양한 환경여건을 갖는 지역을 대상으로 바이오에어로졸 시료를 채취하였다. 농업지역은 퇴비를 많이 사용하는 마늘밭과 농경지가 밀집되어 있는 지역을 선정하였고, 축산지역은 양계장, 소와 송아지 우리 및 양돈장을 대상으로 하였으며, 하수처리장은 국립환경과학원 인근에 위치한 지점을 대상으로 시료를 채취하였다. 해변지역은 서해안의 해수욕장과 동해안에 위치한 항구에서 각각 시료를 채취 하였으며, 청정지역은 자연휴양림에서 시료를 채취하였다(Supplementary Fig.
- 농업지역은 퇴비를 많이 사용하는 마늘밭과 농경지가 밀집되어 있는 지역을 선정하였고, 축산지역은 양계장, 소와 송아지 우리 및 양돈장을 대상으로 하였으며, 하수처리장은 국립환경과학원 인근에 위치한 지점을 대상으로 시료를 채취하였다. 해변지역은 서해안의 해수욕장과 동해안에 위치한 항구에서 각각 시료를 채취 하였으며, 청정지역은 자연휴양림에서 시료를 채취하였다(Supplementary Fig. S1).
이론/모형
- 분리된 미생물의 DNA를 추출하기 위하여, InstaGeneTM Matrix (Bio-Rad, USA)를 사용하였으며, 제품의 프로토콜에 따라 수행하였다[15]. 분리된 미생물 중 세균의 DNA만을 특이적으로 증폭할 수 있는 bacteria 16S rDNA polymerase chain reaction (PCR)을 수행하였다[16]. PCR 조성은 2X type의 EmeraldAmp PCR Master Mix (Takara, Japan)를 사용하여 주형 DNA 1 μl, 27F-1492R 프라이머 각 10 pmol 1 μl 및 nucleic acid free water 7 μl를 첨가하여 총 20 μl로 수행하였다.
- 분리된 미생물의 DNA를 추출하기 위하여, InstaGeneTM Matrix (Bio-Rad, USA)를 사용하였으며, 제품의 프로토콜에 따라 수행하였다[15]. 분리된 미생물 중 세균의 DNA만을 특이적으로 증폭할 수 있는 bacteria 16S rDNA polymerase chain reaction (PCR)을 수행하였다[16].
- 세균의 계통분석을 위하여 관련된 염기서열들을 미국 국립생물정보센터(NCBI)와 EzTaxon-e 서버에서 수집한 뒤 BioEdit를 사용하여 multiple sequence alignment하였다. Molecular Evolutionary Genetics Analysis (MEGA) ver.
- 시료 채취는 MAS-100 NT® (Merck, Germany) 또는 낙하 세균 방법[20, 25]을 사용하여 각각 20초와 1분간 채취하였으며, 37℃ 배양기에서 48시간 동안 배양 후 카운팅하여 colony forming unit (cfu) 값으로 계산하였다. 사용된 배지는 ½로 희석한 Tryptic soy agar (Difco, USA)였으며, 조성은 증류수 1 L를 기준으로 pancreatic digest of casein 8.
성능/효과
- 특히 분리된 strains 중 7종이 B. cereus ATCC 14579T와 99.4−1010.0% 유사성이 분석되었으며, 동해 항구에서 분리된 strain 44-6은 Deinococcus radiopugnans와 99.86%로 분석되어 농업 지역과 함께 다양한 문(phylum)들이 존재할 가능성을 보여주었다. 한편, strain 44-5는 Tepidicella xavieri와 95.
- 또한 농업지역, 축산지역(양돈장 내부), 하수처리장, 해변 및 청정지역에서 분리한 총 31개의 균주가 B. cereus로 동정되었으며, 양계장 내부에서는 Acinetobacter baumannii가 분리되었다. 한편 농업지역, 축산지역 및 해변에서 채취한 바이오에어로졸 중 Domibacillus, Chryceobacterium, Nocardioides속 및 Comamonadaceae에 속하는 신종 또는 신속균주가 분리되었다.
- 또한 strain 16-7은 다양한 환경에 존재하면서 생물막 형성[12] 등 중요한 역할을 수행하고 있을 것으로 추정[16]되는 Flavobacterum속으로 동정(F. oceanosedimentum 99.23%) 되었으며, strain 22-1이 Deinococcus-Thermus문에 포함된 Deinococcus ficus와 100% 유사성이 분석되어 농업지역에의 바이오에어로졸에는 더욱 다양한 배양성 미생물이 존재할 것이라고 추정되었다. 한편, strain 21-2는 Domibacillus robiginosus와 96.
- 농업지역, 축산지역, 하수처리장, 해변 및 청정지역을 대상으로 분리된 바이오에어로졸 중 배양성 미생물은 총 197 strains였으며, 계통분석 결과 genus 수준에서 농업지역 19개, 축산지역 24개, 하수처리장 2개, 해변 14개 및 청정지역 1개의 속이 분석되어 총 42개의 속으로 분석되었다(Table 2). 바이오에어로졸 중 배양성 미생물 다양성이 높게 나타난 축산지역은 양돈장 내부에서 20속으로 대부분을 차지했으나, 양계장 내부(2개속), 소와 송아지 우리(2개속) 및 외부 주변 환경(양계장 외부, 양돈장 외부, 사무실 주변 및 양돈장 외부 출입문 밖)에서는 5속으로 낮은 다양성이 분석되었다.
- 농업지역의 바이오에어로졸 중 배양성 미생물 검출 농도는 마늘밭 중앙 1.7 × 103−2.0 × 103 cfu/m3 , 두엄 주변 1.5 × 102 cfu/m3 및 가장자리 6.0 × 102 cfu/m3로 마늘밭 중앙에서 상대적으로 높게 측정되었다. 축산지역의 바이오에어로졸 중 미생물을 분당 낙하집락 수로 분석한 결과, 양계장 내부 485−498 cfu/min, 소와 송아지 우리 주변 80−94 cfu/min, 양계 농장 대문 5 cfu/min, 양돈장 내부 385−471 cfu/min, 양돈장 외부와 사무실 주변 49−50 cfu/min 및 양돈장 외부 출입문 밖 11 cfu/min으로 측정되었다.
- 축산지역에서는 총 65개의 strains가 분리되었으며 이 중 60개의 isolates가 동정되었다. 동정된 isolates 중 21종이 Staphylococcus spp.로 바이오에어로졸 중 배양성 미생물 중 가장 많이 나타났으며, 특히 양계장 내부에서 분리된 13개의 isolates 중 12개(약 92.3%)가 Staphylococcus spp.로 동정되어 Staphylococcus가 우점하고 있는 것으로 분석되었다. 그 밖에도 양계장 내부에서 Acinetobacter속, 소와 송아지 우리 주변에서는 Bacillus와 Prolinoborus속이 동정되었으며, 양계 농장 대문에서는 Brevibacterium, Cellulomonas 및 Janibacter spp.
- 비교적 높은 다양성을 보인 양돈장 내부에서는 타 지역에서 나타나지 않은 Aerococcus, Candidatus Amoebinatus, Chryseobacterium, Corynebacterium, Escherichia, Kurthia, Nocardioides, Pantoea, Prolinoborus, Stenotrophomonas 및 Streptococcus 속이 특이적으로 분리·동정되었다. 또한 19개의 속이 분석되어 높은 다양성을 보인 농업지역에서는 타 지역에서 동정되지 않은 Brevundimonas, Cellulosimicrobium, Domibacillus, Flavobacterum, Phyciccus, Planococcus, Planomicrobium, Psychrobacillus 및 Rhodococcus 속이 특이적으로 분리·동정되었으며, 14개 속의 배양성 미생물이 동정된 해변에서는 타 지역에서 분석되지 않은 Micrococcus, Moraxella, Paracoccus, Pseudomonas, Tepidicella 및 Terrabacter 속이 특이적으로 분리· 동정되는 등 지역적 특이성이 분석되었다(Table 1, Fig. 1).
- 1). 또한 고세균을 out-group으로 구축한 계통분석 결과, 대기 환경에서는 총 5개의 phylum (Firmicutes, Actinobacteria, Proteobacteria, Bacteroidetes/Fibrobacteres-Chlorobi 및 Deinococcus-Thermus)에 속하는 세균이 분리되었다(Fig. 1).
- 바이오에어로졸 중 배양성 미생물의 농도는 농업지역 밭 가운데와 습도가 높은 실내 조건 (축사내부 및 하수처리장)의 바이오에어로졸에서 높게 측정되었고, 하수처리장에서는 Bacillus속과 축산지역(특히 양계장 내부)에서는 Staphylococcus속이 우점하였으며, 양돈장 내부와 농업지역에서는 타 지역에 비해 많은 종이 출현하는 등 환경 유형별 특성이 나타났다. 또한 농업지역, 축산지역(양돈장 내부), 하수처리장, 해변 및 청정지역에서 분리한 총 31개의 균주가 B. cereus로 동정되었으며, 양계장 내부에서는 Acinetobacter baumannii가 분리되었다.
- 농업지역, 축산지역, 하수처리장, 해변 및 청정지역을 대상으로 분리된 바이오에어로졸 중 배양성 미생물은 총 197 strains였으며, 계통분석 결과 genus 수준에서 농업지역 19개, 축산지역 24개, 하수처리장 2개, 해변 14개 및 청정지역 1개의 속이 분석되어 총 42개의 속으로 분석되었다(Table 2). 바이오에어로졸 중 배양성 미생물 다양성이 높게 나타난 축산지역은 양돈장 내부에서 20속으로 대부분을 차지했으나, 양계장 내부(2개속), 소와 송아지 우리(2개속) 및 외부 주변 환경(양계장 외부, 양돈장 외부, 사무실 주변 및 양돈장 외부 출입문 밖)에서는 5속으로 낮은 다양성이 분석되었다. 비교적 높은 다양성을 보인 양돈장 내부에서는 타 지역에서 나타나지 않은 Aerococcus, Candidatus Amoebinatus, Chryseobacterium, Corynebacterium, Escherichia, Kurthia, Nocardioides, Pantoea, Prolinoborus, Stenotrophomonas 및 Streptococcus 속이 특이적으로 분리·동정되었다.
- 본 연구에서는 조건이 다른 몇몇의 환경(농업지역, 축산지역, 하수처리장, 해변 및 청정지역)을 대상으로 시료를 채취하였으며, 바이오에어로졸 중 배양성 미생물의 환경 유형별 특성을 분석하였다. 바이오에어로졸 중 배양성 미생물의 농도는 농업지역 밭 가운데와 습도가 높은 실내 조건 (축사내부 및 하수처리장)의 바이오에어로졸에서 높게 측정되었고, 하수처리장에서는 Bacillus속과 축산지역(특히 양계장 내부)에서는 Staphylococcus속이 우점하였으며, 양돈장 내부와 농업지역에서는 타 지역에 비해 많은 종이 출현하는 등 환경 유형별 특성이 나타났다. 또한 농업지역, 축산지역(양돈장 내부), 하수처리장, 해변 및 청정지역에서 분리한 총 31개의 균주가 B.
- 해변에서는 총 44개의 isolates가 분리되었으며, 이 중 42개가 동정되었다. 분리된 isolates들 중 18종이 Bacillus spp.로 동정되어 바이오에어로졸 배양성 미생물 중 우점하였고, 추가적으로 Arthrobacter, Deinococcus, Kocuria, Microbacterium, Micrococcus, Moraxella, Paenibacillus, Paracoccus, Pseudomonas, Psychrobacter, Staphylococcus, Tepidicella 및 Terrabacter속으로 동정되었다(Supplementary Table S5). 특히 분리된 strains 중 7종이 B.
- 하수처리장에서는 총 32개의 isolates가 분리되었으며, 이 중 26개가 동정되었다. 분리된 isolates들은 모두 Bacillus와 Brevibacillus spp.로 동정되었고, Bacillus spp.가 23종으로 바이오에어로졸 중의 배양성 미생물 중 우점속으로 나타났으며, 이 중 16종이 B. cereus ATCC 14579T와 99.
- 바이오에어로졸 중 배양성 미생물 다양성이 높게 나타난 축산지역은 양돈장 내부에서 20속으로 대부분을 차지했으나, 양계장 내부(2개속), 소와 송아지 우리(2개속) 및 외부 주변 환경(양계장 외부, 양돈장 외부, 사무실 주변 및 양돈장 외부 출입문 밖)에서는 5속으로 낮은 다양성이 분석되었다. 비교적 높은 다양성을 보인 양돈장 내부에서는 타 지역에서 나타나지 않은 Aerococcus, Candidatus Amoebinatus, Chryseobacterium, Corynebacterium, Escherichia, Kurthia, Nocardioides, Pantoea, Prolinoborus, Stenotrophomonas 및 Streptococcus 속이 특이적으로 분리·동정되었다. 또한 19개의 속이 분석되어 높은 다양성을 보인 농업지역에서는 타 지역에서 동정되지 않은 Brevundimonas, Cellulosimicrobium, Domibacillus, Flavobacterum, Phyciccus, Planococcus, Planomicrobium, Psychrobacillus 및 Rhodococcus 속이 특이적으로 분리·동정되었으며, 14개 속의 배양성 미생물이 동정된 해변에서는 타 지역에서 분석되지 않은 Micrococcus, Moraxella, Paracoccus, Pseudomonas, Tepidicella 및 Terrabacter 속이 특이적으로 분리· 동정되는 등 지역적 특이성이 분석되었다(Table 1, Fig.
- 0 × 102 cfu/m3로 마늘밭 중앙에서 상대적으로 높게 측정되었다. 축산지역의 바이오에어로졸 중 미생물을 분당 낙하집락 수로 분석한 결과, 양계장 내부 485−498 cfu/min, 소와 송아지 우리 주변 80−94 cfu/min, 양계 농장 대문 5 cfu/min, 양돈장 내부 385−471 cfu/min, 양돈장 외부와 사무실 주변 49−50 cfu/min 및 양돈장 외부 출입문 밖 11 cfu/min으로 측정되었다. 축산지역은 사육장 내부(양계장 및 양돈장)에서 높게 측정되었다.
- 양돈장 내부는 같은 실내 사육장이지만 양계장에 비해 매우 다양한 종류의 바이오에어로졸 중 배양성 미생물이 분석되었다. 특히 양돈장에서 분리된 strain 30-1, 30-2, 30-3 및 30-5는 Esherichia coli KCTC 2441T와 99.4−99.8%의 유사성이 분석되어 공기 중 대장균 오염이 추정되었으나, 대장균은 16S rDNA만으로는 종 동정이 매우 어려워, 표준분석 방법을 통한 확정 다상 동정이 필요할 것으로 사료되었다. 또한 양돈장에서 분리된 strain 29-4는 Acinetobacter baumannii와 99.
- 양계장 실내는 먼지가 많아 육안으로도 관찰되는 정도였고, 양계장과 양돈장 모두 특유의 악취가 나는 등 실내에서 특정 환경이 일정하게 유지됨에 따라 바이오에어로졸 중 배양성 미생물이 높게 측정되었을 것으로 추정된다. 하수처리장의 바이오에어로졸 중 배양성 미생물 검출 농도는 하수 유입부인 swing zone 주변 3.1 × 103 cfu/m3, 지하2층 악취가 나는 작업장 주변 5.4 × 102 cfu/m3, 방류지점 및 2차 침전지 6.1 × 102−7.0 × 102 cfu/m3 및 처리장 외부 환풍기 주변에서는 5.3 × 102 cfu/m3가 측정되었다. 하수처리장 주변에서는 대체적으로 유사한 값이 측정되었으나 하수 유입부인 swing zone 주변에서 약 5−10배 정도 높게 측정되었는데, 이것은 다른 지점에 비해 약 20−38% 높은 공기 중 습도(Supplementary Table S1)로 인하여 미생물의 검출농도가 높아진 것으로 사료된다.
- cereus로 동정되었으며, 양계장 내부에서는 Acinetobacter baumannii가 분리되었다. 한편 농업지역, 축산지역 및 해변에서 채취한 바이오에어로졸 중 Domibacillus, Chryceobacterium, Nocardioides속 및 Comamonadaceae에 속하는 신종 또는 신속균주가 분리되었다. 바이오에어로졸은 환경 중 더욱 다양하게 분포할 것이라고 추정되며, 향후 바이오에어로졸의 미생물학적 특성을 평가하기 위해서는 유전자 분석법 등을 이용하여 보다 많은 미생물 정보를 획득하는 것이 필요할 것으로 사료된다.
- 환경유형 별로 분리한 배양성 세균 중, 신종으로 추정되는 5종을 대상으로 16S rDNA 염기서열을 추가적으로 분석한 결과, 1,390−1,460 bp의 염기서열이 분석되었다. 염기서열들을 EzTaxon-e 서버[12]를 통해 분석한 결과, 양계장에서 분리한 strain 26-4는 Staphylococcus gallinarum와 99% 이상의 염기서열이 분석되어 신종 추정균주에서 제외하였다.
후속연구
- 한편 농업지역, 축산지역 및 해변에서 채취한 바이오에어로졸 중 Domibacillus, Chryceobacterium, Nocardioides속 및 Comamonadaceae에 속하는 신종 또는 신속균주가 분리되었다. 바이오에어로졸은 환경 중 더욱 다양하게 분포할 것이라고 추정되며, 향후 바이오에어로졸의 미생물학적 특성을 평가하기 위해서는 유전자 분석법 등을 이용하여 보다 많은 미생물 정보를 획득하는 것이 필요할 것으로 사료된다.
- 가 동정되었다. 본 연구에서 양계장을 중심으로 동정된 바이오에어로졸 중 배양성 미생물을 기초한다면 실내 양계장으로부터 외부로의 미생물학적 오염은 없는 것으로 분석되었으나, 주변 농경지역 또는 바람의 영향 등을 고려하고 분자생물학적 미생물 다양성을 분석하는 등 정밀분석이 필요할 것으로 사료되었다. 양돈장 내부에서는 Achromobacter, Aerococcus, Bacillus, Candidatus Amoebinatus, Chryseobacterium, Corynebacterium, Escherichia, Exiguobacterium, Kocuria, Kurthia, Microbacterium, Nocardioides, Pantoea, Prolinoborus, Psychrobacter, Stenotrophomonas 및 Streptococcus spp.
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