본 연구에서, 우리는 S. mutans Ag I/II 재조합단백질에 의해 유도되어진 염증유발 단백질의 발현에 홍삼 40% 에탄올 추출물의 효과를 알아보고자 하였다. 홍삼에탄올추출물은 Ag I/II 재조합단백질에 의해 유도되어진 염증유발물질들의 mRNA와 단백질의 발현을 억제하였다. 더불어 홍삼에탄올 추출물은 NF-κΒ p65가 핵내로 이용하는 것이 억제하였다. 결론적으로 홍삼 40%에탄올추출물은 NF-κB의 활성에 의해 NO 생성과 iNOS 발현이 조절되어지는 것으로 생각되어지며, 염증유발 관련 유전자들의 낮은 발현을 유도하는 것으로 관찰되어졌다.
본 연구에서, 우리는 S. mutans Ag I/II 재조합단백질에 의해 유도되어진 염증유발 단백질의 발현에 홍삼 40% 에탄올 추출물의 효과를 알아보고자 하였다. 홍삼에탄올추출물은 Ag I/II 재조합단백질에 의해 유도되어진 염증유발물질들의 mRNA와 단백질의 발현을 억제하였다. 더불어 홍삼에탄올 추출물은 NF-κΒ p65가 핵내로 이용하는 것이 억제하였다. 결론적으로 홍삼 40%에탄올추출물은 NF-κB의 활성에 의해 NO 생성과 iNOS 발현이 조절되어지는 것으로 생각되어지며, 염증유발 관련 유전자들의 낮은 발현을 유도하는 것으로 관찰되어졌다.
In this study, we investigated the effects of 40% ethanol extract of Red Ginseng (RGE) on the productions of inflammatory proteins in Antigen I/II (Ag I/II)-N, a recombinant protein isolated from Streptococcus mutans -stimulated in RAW 264.7 cells. RGE inhibited the expression of Ag I/II-N-induced p...
In this study, we investigated the effects of 40% ethanol extract of Red Ginseng (RGE) on the productions of inflammatory proteins in Antigen I/II (Ag I/II)-N, a recombinant protein isolated from Streptococcus mutans -stimulated in RAW 264.7 cells. RGE inhibited the expression of Ag I/II-N-induced pro-inflammatory mediators, both mRNA and protein synthesis levels, without any cytotoxic effects. Moreover, RGE significantly inhibited Ag I/II-N induced NF-κB translocation into the nucleus by preventing the degradation of inhibitor κB-α. In conclusion, RGE down regulates the expression of pro-inflammatory genes involved in the synthesis of NO and iNOS in Ag I/II-N-stimulated RAW 264.7 cells by suppressing NF-κB activity.
In this study, we investigated the effects of 40% ethanol extract of Red Ginseng (RGE) on the productions of inflammatory proteins in Antigen I/II (Ag I/II)-N, a recombinant protein isolated from Streptococcus mutans -stimulated in RAW 264.7 cells. RGE inhibited the expression of Ag I/II-N-induced pro-inflammatory mediators, both mRNA and protein synthesis levels, without any cytotoxic effects. Moreover, RGE significantly inhibited Ag I/II-N induced NF-κB translocation into the nucleus by preventing the degradation of inhibitor κB-α. In conclusion, RGE down regulates the expression of pro-inflammatory genes involved in the synthesis of NO and iNOS in Ag I/II-N-stimulated RAW 264.7 cells by suppressing NF-κB activity.
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문제 정의
mutans의 독성인자를 대상 항원으로 한 연구가 많이 진행 중이며, 특히 세균의 부착에 관여하는 단백질인 Ag I/Ⅱ의 재조합 단백질과 항체를 만들어 우식예방 관련 연구가 진행되어지고 있다[17, 21]. 홍삼에탄올추출의 면역관련 사이토카인 발현변화를 통한 항염증효과를 규명하고자 한다.
제안 방법
분리된 단백질 정량은 BCA 방법을 이용하여 농도를 결정하였고, 40μg의 단백질을 8−12% sodium dodecyl sulfate polyacrylamide gel electrophoresis (SDS-PAGE)로 전기영동하고, PVDF membrane에 blotting한 후 일차 항체, iNOS, COX-2, ERK, JNK, P38, 그리고 NF-κB를 반응시켰다. Horse radish peroxidase가 부착된 이차항체를 반응시키고 chemiluminescence detection system (Fisher)을 이용하여 단백질 발현을 분석하였다.
세포독성을 확인하였다. NO와 PGE2 생성 변화를 관찰하기 대식세포에 염증유발물질인 구강미생물인 Streptococcus mutans에서 분리한 Ag I/II-N 재조합단백질을 처리한 다음 홍삼에탄올추출물 (RGE)을 농도별로 처리 한 후 24시간 배양하였다. NO 생성을 측정하기 위해 세포배양액을 이용한 Griess reaction 방법을 통하여 측정하였다[14, 18].
이들의 과도한 분비는 TNF-α 및 IL-6의 면역계 항상성 불균형을 초래하여 다양한 세포와 조직에 기능저해를 일으켜 염증성 장질환, 류마치스 등과 같은 만성염증 및 자가면역질환을 유발할 수 있다[15, 16]. RGE를 Ag I/II-N 재조합단백질에 의해 염증 유발된 RAW 264.7 대식세포에 농도별로 처리한 후 염증관련사이토카인 생성을 확인하였다. 그 결과 RGE 농도 5 μg/ml 에서 TNF-α 생성이 50% 이상 감소하는 것을 확인할 수 있었으며, IL-1β와 IL-6는 10 μg/ml 농도에서 50%와 46% 이상 각각 감소하는 것을 확인하였다.
배양액을 이용하여 각각의 사이토카인 변화를 ELISA 방법을 통하여 확인하였다. 또한, 염증유발 관련 단백질 발현 변화를 확인하기 위해 RGE를 농도별로 처리한 세포를 모아 RIPA buffer를 이용하여 단백질을 분리하였다. 분리된 단백질 정량은 BCA 방법을 이용하여 농도를 결정하였고, 40μg의 단백질을 8−12% sodium dodecyl sulfate polyacrylamide gel electrophoresis (SDS-PAGE)로 전기영동하고, PVDF membrane에 blotting한 후 일차 항체, iNOS, COX-2, ERK, JNK, P38, 그리고 NF-κB를 반응시켰다.
또한, 염증유발 관련 단백질 발현 변화를 확인하기 위해 RGE를 농도별로 처리한 세포를 모아 RIPA buffer를 이용하여 단백질을 분리하였다. 분리된 단백질 정량은 BCA 방법을 이용하여 농도를 결정하였고, 40μg의 단백질을 8−12% sodium dodecyl sulfate polyacrylamide gel electrophoresis (SDS-PAGE)로 전기영동하고, PVDF membrane에 blotting한 후 일차 항체, iNOS, COX-2, ERK, JNK, P38, 그리고 NF-κB를 반응시켰다. Horse radish peroxidase가 부착된 이차항체를 반응시키고 chemiluminescence detection system (Fisher)을 이용하여 단백질 발현을 분석하였다.
홍삼을 40% 에탄올을 이용하여 추출한 시료를 대식세포에 농도별로 처리한 후 24시간 배양하여 MTT 방법을 이용하여 세포독성을 확인하였다. NO와 PGE2 생성 변화를 관찰하기 대식세포에 염증유발물질인 구강미생물인 Streptococcus mutans에서 분리한 Ag I/II-N 재조합단백질을 처리한 다음 홍삼에탄올추출물 (RGE)을 농도별로 처리 한 후 24시간 배양하였다.
대상 데이터
최근 홍삼 산성 다당체는 NF-κB와 AP-1과 같은 전사인자와 MAPKs와 같은 상위 신호전달을 활성화하여 대식세포를 활성화시킴이 보고되었다[24]. 본 연구에서는 염증유발물질로 Streptococcus mutans의 세균부착 관련 단백질로 알려진 Ag I/II를 재조합단백질로 만들어 사용하였다. 세균이 치면에 부착하는 것은 치아 우식증이 발생하는 첫 번째 단계로 S.
이론/모형
NO와 PGE2 생성 변화를 관찰하기 대식세포에 염증유발물질인 구강미생물인 Streptococcus mutans에서 분리한 Ag I/II-N 재조합단백질을 처리한 다음 홍삼에탄올추출물 (RGE)을 농도별로 처리 한 후 24시간 배양하였다. NO 생성을 측정하기 위해 세포배양액을 이용한 Griess reaction 방법을 통하여 측정하였다[14, 18]. 또한, PGE2생성 변화를 관찰하기 위해 ELISA방법을 이용하였다.
NO 생성을 측정하기 위해 세포배양액을 이용한 Griess reaction 방법을 통하여 측정하였다[14, 18]. 또한, PGE2생성 변화를 관찰하기 위해 ELISA방법을 이용하였다. 그 결과, RGE는 120 μg/ml 농도까지 세포독성이 없는 것을 확인하였다.
-10 을 확인하기 위해 RGE을 Ag I/II-N 재조합단백질에 의해 염증이 유발되어진 대식세포에 농도별로 처리한 후 시간별로 배양하였다. 배양액을 이용하여 각각의 사이토카인 변화를 ELISA 방법을 통하여 확인하였다. 또한, 염증유발 관련 단백질 발현 변화를 확인하기 위해 RGE를 농도별로 처리한 세포를 모아 RIPA buffer를 이용하여 단백질을 분리하였다.
성능/효과
그 결과, RGE는 120 μg/ml 농도까지 세포독성이 없는 것을 확인하였다. NO의 생성이 농도의존적으로 억제를 보였으며, 10 μg/ml 농도에서부터 58.44% 이상 감소되는 것을 확인하였다(Fig. 1). 또한, PGE2 역시 농도의존적으로 감소하는 것을 확인하였으며, 10 μg/ml 농도에서 43.
iNOS에 의해 생성되는 NO의 생성이 농도의존적으로 억제됨을 확인하였으므로 iNOS 생성 역시 억제되는 것을 확인한 결과, RGE 5 μg/ml에서부터 iNOS가 거의 발현되지 않음을 확인할 수 있었다(Fig. 2). 또한, 염증과정에서 인지질을 대사시켜 생성된 아라키돈산에서 PGE2를 생성시키는 효소인, COX-2의 발현을 확인하기 위해 RGE를 농도별로 염증이 유발된 RAW 264.
2). iNOS와 COX-2 mRNA 발현 역시 농도 의존적으로 감소됨을 확인하였다.
7 대식세포에 농도별로 처리한 후 염증관련사이토카인 생성을 확인하였다. 그 결과 RGE 농도 5 μg/ml 에서 TNF-α 생성이 50% 이상 감소하는 것을 확인할 수 있었으며, IL-1β와 IL-6는 10 μg/ml 농도에서 50%와 46% 이상 각각 감소하는 것을 확인하였다. IL-10은 15 μg/ml 농도에서 35% 이상 감소하는 것을 관찰하였다(Fig.
또한, PGE2생성 변화를 관찰하기 위해 ELISA방법을 이용하였다. 그 결과, RGE는 120 μg/ml 농도까지 세포독성이 없는 것을 확인하였다. NO의 생성이 농도의존적으로 억제를 보였으며, 10 μg/ml 농도에서부터 58.
1). 또한, PGE2 역시 농도의존적으로 감소하는 것을 확인하였으며, 10 μg/ml 농도에서 43.67% 이상 감소하였다(Fig. 1). NO는 iNOS에 의해 생성되며 정상적인 상태에서는 방어작용과 신경전달물질 및 혈관 조절 등의 기능을 하지만 염증과정에서 염증성 사이토카인에 의해 과도하게 분비된 NO는 급성 패혈성 쇼크를 일으킬 수 있으며, DNA 손상, 염증매개물 과다 생성을 통한 염증 증폭, 강한 세포독성으로 인한 세포 및 조직 괴사, 기능장애 등을 일으켜 만성 염증 및 자가면역질환의 원인이 될 수 있다[2, 34, 36].
2). 또한, 염증과정에서 인지질을 대사시켜 생성된 아라키돈산에서 PGE2를 생성시키는 효소인, COX-2의 발현을 확인하기 위해 RGE를 농도별로 염증이 유발된 RAW 264.7 대식세포에 농도별로 처리한 결과, iNOS와 마찬가지로 농도의존적으로 발현이 감소되는 것을 확인하였다(Fig. 2). iNOS와 COX-2 mRNA 발현 역시 농도 의존적으로 감소됨을 확인하였다.
[13, 39]. 본 연구에서 MAPKs 신호전달 관련성을 확인한 결과, ERK와 p38의 인산화가 농도의존적으로 감소하는 것이 확인되었으나, JNK에서는 변화가 관찰되지 않았다(Fig. 4).
활성화시킨다[20, 30, 31]. 본 연구에서도 위와 같은 변화를 관찰하기 위해 염증유발된 대식세포에서 세포질과 핵에서 관련 전사인자 NF-κB p65의 활성화를 확인한 결과, RGE를 처리하였을 때 농도의존적으로 핵에서 p65 활성이 염증 유발 시 증가하던 단백질이 RGE 처리시 농도 의존적으로 억제되었으며, 세포질 내 p65와 IκB-α는 농도 의존적으로 증가하는 것을 확인하였다(Fig. 5).
위 결과는 iNOS 관련의 발현은 Ag I/II-N 재조합 단백질에 의한 ERK와 p38의 인산화에 의한 NF-κB p65의 활성화에 의해 유도되기 때문에 이 농도에서 NF-κB p65의 활성이 차단되어 iNOS의 발현 감소가 이루어진 것으로 추정되었다. 최근 연구에 의하면 NSAID 장기간 투여 시 위장과 신장의 기능 저하를 일으키며 특히, 혈관을 확장시키는 PGE2와 prostacyclin의 생성을 억제하여 심혈관과 관련된 여러 부작용이 보고되고 있다[5, 14].
후속연구
따라서 최근에는 천연물 유래의 COX-2 억제제가 NSAID에 비해 생체에 잘 흡수되고 대사되므로 부작용이 좀 더 적을 것으로 판단하여, 우유 엉겅퀴 유래의 silymarin과 천연허브 6종을 혼합하여 만든 신바로 (shinbaro) 등과 같은 천연물에서 COX-2 억제제를 찾으려는 노력이 진행되고 있다[1, 18, 25]. 본 연구에서 이용한 홍삼에탄올추출물 (RGE)은 천연추출물로서 TNF-α, IL-1β 그리고 IL-6와 같은 염증성 사이토카인과 iNOS와 COX-2의 발현을 억제하고, NF-κB의 활성화에 ERK와 p38 인산화가 관여하여 이를 억제하므로 천연물 유래 항염증 물질로 개발될 수 있을 것이라 기대한다.
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