黃連解毒湯, 黃連, 黃芩, 黃柏, 梔子의 Salmonella Typhimurium에 대한 항균효과 Antimicrobial Activity of Hwangryunheadok-tang and Extracts of Scutellariae Radix, Phellodendri Cortex, Coptis Rhizome, and Gardenia Jasminoides against Salmonella Typhimurium원문보기
Objectives: This experiment investigated the antimicrobial activity of Hwangryunheadok-tang and extracts of Scutellariae radix , Phellodendri cortex , Coptis rhizome , and Gardenia jasminoides against Salmonella typhimurium . Methods: After spreading S. typhimurium on a bacterial culture medium plat...
Objectives: This experiment investigated the antimicrobial activity of Hwangryunheadok-tang and extracts of Scutellariae radix , Phellodendri cortex , Coptis rhizome , and Gardenia jasminoides against Salmonella typhimurium . Methods: After spreading S. typhimurium on a bacterial culture medium plate, antimicrobial activity was tested by dripping diluted Hwangryunheadok-tang or extracts of Scutellariae radix , Phellodendri cortex , Coptis rhizome , or Gardenia jasminoides (80 μl, diluted 100, 50, 10, and 1%) onto the plate, followed by culture for 16 to 72 hours. The minimal inhibitory concentration (MIC) was tested by dripping the minimum dilution that showed antimicrobial activity (80, 60, 40, and 20 μl) and measuring the density. The antimicrobial activity of Hwangryunheadok-tang and four extracts showed continuous antibacterial activity against S. typhimurium throughout the experiment. Result: 1. S. typhimurium . (Standard Microorganism, ATCC) 1) The Hwangryunheadok-tang and extracts of Scutellariae radix , Phellodendri cortex , and Coptis rhizome showed antibacterial activity in the undiluted solutions and in 50% dilutions. Gardenia jasminoides extract showed potency only in the undiluted solution. The antimicrobial potency of the undiluted solution was increased when the volume of inoculation was increased, but no difference was noted when the culture time was extended. All the extracts showed antimicrobial potency against S. typhimurium . 2. S. typhimurium isolated from diarrhea patients 1) When compared to the standard microorganism experiment on S. typhimurium , the MICs of the five extracts were increased. However, whereas the antimicrobial potency of doxycycline was lost entirely against bacteria isolated from patients with diarrhea, the antimicrobial potency of all the extracts was diminished but did not disappear. 2) The antimicrobial activity of Hwangryunheadok-tang and four extracts was continuous even when the culture time was extended to 16, 24, and 72 hours. Conclusions: The Hwangryunheadok-tang and four kinds of extracts have antimicrobial activity against S. typhimurium . Comparison of a standard microorganism with S. typhimurium isolated from diarrhea patients showed that the antimicrobial activity of all the extracts was better than that of antibiotics. Further studies should focus on the value and benefits of Hwangryunheadok-tang , and the four kinds of extracts as clinical treatments.
Objectives: This experiment investigated the antimicrobial activity of Hwangryunheadok-tang and extracts of Scutellariae radix , Phellodendri cortex , Coptis rhizome , and Gardenia jasminoides against Salmonella typhimurium . Methods: After spreading S. typhimurium on a bacterial culture medium plate, antimicrobial activity was tested by dripping diluted Hwangryunheadok-tang or extracts of Scutellariae radix , Phellodendri cortex , Coptis rhizome , or Gardenia jasminoides (80 μl, diluted 100, 50, 10, and 1%) onto the plate, followed by culture for 16 to 72 hours. The minimal inhibitory concentration (MIC) was tested by dripping the minimum dilution that showed antimicrobial activity (80, 60, 40, and 20 μl) and measuring the density. The antimicrobial activity of Hwangryunheadok-tang and four extracts showed continuous antibacterial activity against S. typhimurium throughout the experiment. Result: 1. S. typhimurium . (Standard Microorganism, ATCC) 1) The Hwangryunheadok-tang and extracts of Scutellariae radix , Phellodendri cortex , and Coptis rhizome showed antibacterial activity in the undiluted solutions and in 50% dilutions. Gardenia jasminoides extract showed potency only in the undiluted solution. The antimicrobial potency of the undiluted solution was increased when the volume of inoculation was increased, but no difference was noted when the culture time was extended. All the extracts showed antimicrobial potency against S. typhimurium . 2. S. typhimurium isolated from diarrhea patients 1) When compared to the standard microorganism experiment on S. typhimurium , the MICs of the five extracts were increased. However, whereas the antimicrobial potency of doxycycline was lost entirely against bacteria isolated from patients with diarrhea, the antimicrobial potency of all the extracts was diminished but did not disappear. 2) The antimicrobial activity of Hwangryunheadok-tang and four extracts was continuous even when the culture time was extended to 16, 24, and 72 hours. Conclusions: The Hwangryunheadok-tang and four kinds of extracts have antimicrobial activity against S. typhimurium . Comparison of a standard microorganism with S. typhimurium isolated from diarrhea patients showed that the antimicrobial activity of all the extracts was better than that of antibiotics. Further studies should focus on the value and benefits of Hwangryunheadok-tang , and the four kinds of extracts as clinical treatments.
이에 저자는 식중독 대표 원인균의 하나인 S. Typhimurium를 표준균주와 항생제 내성을 가진 환자분리균주 두 가지로 준비하고, 두 종류의 균주에 대해 黃連解毒湯과 각각의 구성 약물들이 가지고 있는 항균효과를 비교함으로써 천연 항균제로서 이용 가능성에 대한 유의한 결과를 얻었기에 보고하는 바이다.
그러나 현재까지 다종의 식중독균들에 대해 黃連解毒湯과 그 구성 약재인 黃連, 黃柏, 黃芩, 梔子의 항균력을 함께 수평적으로 비교함으로써, 黃連解毒湯의 어떤 약재가 항균력에 얼마만큼 기여하였는가를 분석해보는 연구는 없었으며 특히 표준 균주가 아닌 항생제에 내성을 가진 환자분리균주를 이용한 연구로는 장21의 연구를 제외하고 현재까지는 전무한 실정이기에 黃連解毒湯과 그 구성 약물들을 이용한 본 연구를 통해 천연 항균제로서의 가능성을 검증해 기초 자료로 활용하고자 연구를 실시하였다.
제안 방법
黃連解毒湯, 黃連추출물, 黃芩추출물, 黃柏추출물, 梔子추출물이 S. Typhimurium에 미치는 항균효과를 알아보기 위하여 표준균주, 환자분리균주 각각에 대해 추출물의 희석율⋅접종량에 따른 억제환(Inhibition zone) 비교 실험, 최소 성장억제 농도실험(MIC), 배양시간에 따른 항균효과 지속성실험을 실시하고 다음과 같은 결론을 얻었다.
각 추출물의 접종량에 따른 항균력 측정은 ‘희석률에 따른 항균력 측정’과 동일한 방법으로 수행하되, 각 추출물 원액(100%)을 가지고 접종량을 달리하여(80 μl, 60 μl, 40 μl, 20 μl) disc에 접종한 후 억제환의 크기를 비교하였다.
약재를 비이커에 黃連解毒湯, 黃連, 黃柏, 黃芩, 梔子의 각각 취한 양 100 g당 증류수 1,000 ml를 넣고 실온에서 8시간 동안 약재를 불렸다.
항균효과 지속성 측정은 위의 세 가지 실험과 동일한 방법으로 표준균주와 분리균주에 대해 실험한 후, 36 ℃에서 16시간에서 72시간까지 배양하면서 같은 조건하에서 억제환의 크기비교 및 항균력의 지속성 여부를 비교하였다.
대상 데이터
본 실험에 사용한 표준균주는 광주광역시 보건환경연구원의 보관균주로 S. Typhimurium(ATCC, 13565)를 Trypic soy agar(TSA)(Oxoid LTD., Basingstoke, Hampshire, England) 배지에서 배양하였다.
동신대한방병원에서 사용하는 약재를 준비하여 각질을 제거하고 黃連, 黃柏, 黃芩, 梔子를 각 50 g을 취해 합하여 200 g의 黃連解毒湯을 준비하고 따로 黃連, 黃柏, 黃芩, 梔子 각각 약재 100 g을 취하여 준비하였다(Table 1).
본 실험에 사용된 약재들은 현재 동신대광주한방병원에서 사용되고 있는 제품을 구입하여 雜質을 제거하고 형태가 완전한 것을 정선하여 사용하였다.
본 실험에 사용한 분리균주는 광주광역시 보건환경연구원에서 광주지역에서 2012년 1월부터 2013년 8월까지 설사환자에게서 분리된 균주로 S. Typhimurium를 미생물 생화학적 동정기(VitekII Compact, bioMerieux, France)를 이용하여 동정한 후, 표준균주와 동일한 방법으로 배양하였다.
본 실험에 사용한 표준균주는 광주광역시 보건환경연구원의 보관균주로 S. Typhimurium(ATCC, 13565)를 Trypic soy agar(TSA)(Oxoid LTD.
분리균주는 광주광역시보건환경연구원에서 2013년 광주지역에서 발생한 설사환자에서 분리된 균주로, 미생물 생화학 자동 동정기를 사용하여 동정한 후, 표준균주와 동일한 방법으로 배양하여 사용하였다.
이론/모형
분리된 균주의 항생제 감수성시험은 미생물 생화학 자동 동정기를 사용하여 실시하였고, 항생제 내성기준은 CLSI(Clinical and Laboratory Standards Institute)지침에 따라 내성률을 산출하였다.
희석률에 따른 최소 성장 억제 농도 측정 측정은 Disc diffusion method에 준하여 실험하였다. 준비된 표준균주 및 분리균주 현탁액을 Mueller-Hinton agar(MHA)(Oxoid LTD.
성능/효과
삼환계 항생제에 내성을 가진 S. Typhimurium 균주에 대해 梔子를 제외한 네 가지 추출물들은 표준균주 실험에 비해 감소하였지만 유의한 항균력을 보였다. 표준균주 실험과 마찬가지로 S.
표준균주 실험과 마찬가지로 S. Typhimurium 분리균주에 대해서도 黃連解毒湯, 黃連, 黃芩, 黃柏, 梔子 모두 16시간, 24시간, 72시간 후에도 지속적인 항균효과를 보였다.
환자분리균주에 대한 추출물들의 희석률에 따른 항균력 비교 실험에서 S. Typhimurium에 대해 黃柏추출물의 항균력은 100%에서만 보였으며, 黃連, 黃連解毒湯, 黃芩은 100%, 50%까지 보여 표준균주 실험에 비해 항균효과가 감소하였다. 그러나 대조군으로 사용한 doxycycline에서는 억제환이 전혀 나타나지 않아 삼환계 항생제에 대한 내성을 보였고 반면 ciprofloxacin은 동일한 항균력을 유지하였다.
이상의 결과를 종합해보면 黃連解毒湯과 黃連, 黃柏, 黃芩, 梔子 추출물은 S. Typhimurium에 대해 모두 항균력을 보였다. 유의성 있는 항균력을 가진 추출물은 黃連解毒湯과 黃連, 黃芩이었다.
결론적으로 梔子를 제외한 네 가지 추출물들은 삼환계 항생제 내성을 갖는 S. Typhimurium에 대해 증식 억제 효과가 있음을 볼 수 있었다. 배양시간에 따른 항균효과 실험에서도 표준균주 실험에서와 같이 다섯 가지 추출물 모두가 16시간, 24시간, 72시간 배양 후에도 동일한 억제환의 크기를 유지했다.
모든 추출물이 S. Typhimurium에 대해 지속적인 항균력을 보였다.
이상의 결과를 종합해 볼 때, 黃連解毒湯, 黃連, 黃芩, 黃柏, 梔子는 S. Typhimurium에 대해 항균력을 가지는 것을 알 수 있다. 그러나 梔子의 항균력은 항생제로의 효과를 기대하기에 미미하였고 그 외 黃連解毒湯, 黃芩, 黃連, 黃柏은 유의한 항균력을 보였다.
黃芩과 黃柏은 10%, 60 μl였고, 黃連은 10%, 20 μl였다. 梔子은 100%, 80 μl였다. 시간에 따른 항균력은 16시간, 24시간, 72시간에서 유의한 차이가 없었다.
黃連解毒湯, 黃連, 黃柏, 黃芩은 50%까지 항균력을 보였다. 단지 梔子추출물은 100%에서만 항균력을 보였다.
黃連解毒湯, 黃連추출물, 黃芩추출물, 黃柏추출물, 梔子추출물이 S. Typhimurium에 미치는 항균효과를 알아보기 위하여 표준균주, 환자분리균주 각각에 대해 추출물의 희석율⋅접종량에 따른 억제환(Inhibition zone) 비교 실험, 최소 성장억제 농도실험(MIC), 배양시간에 따른 항균효과 지속성실험을 실시하고 다음과 같은 결론을 얻었다.
원액(100%)에서의 항균력은 접종량이 많아짐에 따라 더 우수한 항균력이 나타나는 것을 볼 수 있었다. 黃連解毒湯의 MIC는 10%, 20 μl였다. 黃芩과 黃柏은 10%, 60 μl였고, 黃連은 10%, 20 μl였다.
그러나 대조군으로 사용한 doxycycline에서는 억제환이 전혀 나타나지 않아 삼환계 항생제에 대한 내성을 보였고 반면 ciprofloxacin은 동일한 항균력을 유지하였다. 결론적으로 梔子를 제외한 네 가지 추출물들은 삼환계 항생제 내성을 갖는 S. Typhimurium에 대해 증식 억제 효과가 있음을 볼 수 있었다.
전체적으로 黃連의 억제환 크기가 확연히 크게 나타나 항균효과가 다른 추출물에 비해 뛰어남을 알 수 있었다. 그 뒤로는 黃連解毒湯, 黃芩, 黃柏, 梔子 순으로 항균효과를 보였다. 원액의 접종량에 따른 항균력 비교 실험과 항균력을 보인 최소 희석 농도 검액을 접종량을 달리하여 비교한 실험으로 추출물들의 MIC(Table 9)를 알 수 있었는데.
Typhimurium에 대해 항균력을 가지는 것을 알 수 있다. 그러나 梔子의 항균력은 항생제로의 효과를 기대하기에 미미하였고 그 외 黃連解毒湯, 黃芩, 黃連, 黃柏은 유의한 항균력을 보였다. 이미 선행연구들에서 黃連, 黃柏의 berberine, 黃芩의 baicalein, wogonin 등의 성분들이 식중독 유발 세균들에 대해 항균효과가 있음이 밝혀졌는데32, 본 연구결과에서도 이들 한약재들과 복합처방인 黃連解毒湯이 표준균주 뿐만 아니라 삼환계 항생제 내성 균주까지도 여전히 항균력이 있는 것으로 나타나 앞으로 이들 물질들의 천연항생제로서의 역할을 기대해 볼 수 있었다.
黃連解毒湯, 黃連, 黃柏, 黃芩은 50%까지 항균력을 보였다. 단지 梔子추출물은 100%에서만 항균력을 보였다. 원액(100%)에서의 항균력은 접종량이 많아짐에 따라 더 우수한 항균력이 나타나는 것을 볼 수 있었다.
먼저 표준균주를 대상으로 한 추출물들의 희석률에 따른 항균력 비교실험에서 黃連解毒湯, 黃連, 黃芩, 黃柏이 10% 농도까지 항균력을 보였으며 梔子는 100% 원액에서만 작은 억제환을 만들어 항균력을 보였다. 전체적으로 黃連의 억제환 크기가 확연히 크게 나타나 항균효과가 다른 추출물에 비해 뛰어남을 알 수 있었다.
미생물의 생육도 측정은 다섯 추출물 중에서 가장 높은 항균력을 보인 黃連으로 수행되었다. 측정결과 S.
梔子은 100%, 80 μl였다. 시간에 따른 항균력은 16시간, 24시간, 72시간에서 유의한 차이가 없었다. 모든 추출물이 S.
단지 梔子추출물은 100%에서만 항균력을 보였다. 원액(100%)에서의 항균력은 접종량이 많아짐에 따라 더 우수한 항균력이 나타나는 것을 볼 수 있었다. 黃連解毒湯의 MIC는 10%, 20 μl였다.
Typhimurium에 대해 모두 항균력을 보였다. 유의성 있는 항균력을 가진 추출물은 黃連解毒湯과 黃連, 黃芩이었다. 표준균주 실험과 환자 분리균주 실험을 비교하였을 때 梔子를 제외한 네 가지 추출물들은 삼환계 항생제에 내성을 가진 세균에 대해서도 항균력을 보였다.
Typhimurium에 대해 다섯 가지 추출물 모두가 16시간, 24시간, 72시간 배양 후에도 동일한 억제환의 크기를 유지하고 있었다. 이것으로 볼 때, 각 추출물이 16시간 후에 이미 최대 항균력을 보이는 것으로 사료할 수 있으며 72시간 이후까지 항균효과가 지속적으로 유지되는 것을 알 수 있었다.
이상의 결과를 종합해 볼 때, 黃連解毒湯, 黃連, 黃芩, 黃柏, 梔子는 S. Typhimurium에 대해 항균력을 가지는 것을 알 수 있다.
이상의 결과를 종합해보면 黃連解毒湯과 黃連, 黃柏, 黃芩, 梔子 추출물은 S. Typhimurium에 대해 모두 항균력을 보였다.
먼저 표준균주를 대상으로 한 추출물들의 희석률에 따른 항균력 비교실험에서 黃連解毒湯, 黃連, 黃芩, 黃柏이 10% 농도까지 항균력을 보였으며 梔子는 100% 원액에서만 작은 억제환을 만들어 항균력을 보였다. 전체적으로 黃連의 억제환 크기가 확연히 크게 나타나 항균효과가 다른 추출물에 비해 뛰어남을 알 수 있었다. 그 뒤로는 黃連解毒湯, 黃芩, 黃柏, 梔子 순으로 항균효과를 보였다.
원액의 접종량에 따른 항균력 비교 실험과 항균력을 보인 최소 희석 농도 검액을 접종량을 달리하여 비교한 실험으로 추출물들의 MIC(Table 9)를 알 수 있었는데. 최소성장억제농도로 비교한 항균력의 크기도 黃連이 가장 크고 그 다음이 黃連解毒湯, 黃芩, 黃柏, 梔子 순이었다.
유의성 있는 항균력을 가진 추출물은 黃連解毒湯과 黃連, 黃芩이었다. 표준균주 실험과 환자 분리균주 실험을 비교하였을 때 梔子를 제외한 네 가지 추출물들은 삼환계 항생제에 내성을 가진 세균에 대해서도 항균력을 보였다.
후속연구
그러나 본 연구는 희석액에서도 높은 항균력을 나타낼 수 있는 사용량에 대한 연구, 추출방식에 따라 수득률과 항균효과가 다른 것으로 알려져 있기33 때문에 수득률과 효과가 가장 효율적인 추출 방식을 찾는 것에 대한 연구, 또한 한약재들의 항균력이 단순히 재료의 양에 의존적이지 않으므로34 최대의 항균력을 보이는 약재 용량에 대한 연구, 그리고 생체에 투여되었을 때 나타나는 효과에 대한 실험적인 연구 등 추가적인 연구가 필요할 것으로 사료된다.
그러나 梔子의 항균력은 항생제로의 효과를 기대하기에 미미하였고 그 외 黃連解毒湯, 黃芩, 黃連, 黃柏은 유의한 항균력을 보였다. 이미 선행연구들에서 黃連, 黃柏의 berberine, 黃芩의 baicalein, wogonin 등의 성분들이 식중독 유발 세균들에 대해 항균효과가 있음이 밝혀졌는데32, 본 연구결과에서도 이들 한약재들과 복합처방인 黃連解毒湯이 표준균주 뿐만 아니라 삼환계 항생제 내성 균주까지도 여전히 항균력이 있는 것으로 나타나 앞으로 이들 물질들의 천연항생제로서의 역할을 기대해 볼 수 있었다.
참고문헌 (34)
Oldfield EC. Emerging foodborne pathogens: keeping your patients and your families safe.Rev Gastroenterol Disorders 2001;1(4):177-86.
송유진, 박수호, 유지영, 조윤석, 오계헌. 김치에서 분리한 세균인 Lactobacillus plantarum YK-9의식중독 원인세균에 대한 항균활성 및 특성. KSBB Journal 2009;24(3):273-8.
Hiramatsu KN, Aritaka H, Hanaki S, Kawasaki Y, Hosoda S. Hori. Dissemination in Japanese hospitals of strains of Staphylococcus aureus heterogeneously resistant to vancomycin. Lancet 1997;350(9092):1670-3.
항생제내성균주은행, 식품의약품안정청. 항생제 내성균 검사 표준 시험법. 식품의약품안정청. 서울.
Mead PS, Slutsker L, Dietz V, McCaig LF, Bresee JS, Shapiro C, et al. Food-related illness and death in the Unites States. Emerg Infect Dis 1999;5:607-25.
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