선택한 단어 수는 입니다.
최소 단어 이상 선택하여야 합니다.
최소 단어 이상 선택하여야 합니다.
선택한 단어 수는 30입니다.
최대 10 단어까지만 선택 가능합니다.
최대 10 단어까지만 선택 가능합니다.
문제 정의
- 차세대 시퀀싱 기술 중 Roche 454 GS-FLX 시퀀서를 이용한 파이로시퀀싱(pyrosequencing)기법이 메타 지노믹스에 널리 사용되고 있다[6, 16]. 본 연구에서는 메타지 노믹스 기법을 이용하여 울릉도 지역의 토양시료로부터 대량 의 세균군집을 최초로 분석하였다. 또한 울릉도와 가장 가까 운(약 87.
제안 방법
- PCR 산물을 전기영동하여 서열의 길이가 300 bp 이상의 DNA 를 선별하였다. DNA단편의 길이를 Agilent 2100 Bioanalyzer (Agilent Technologies, Santa Clara, CA, USA)를 이용하여 재 확인하였다[18]. 파이로시퀀싱은 ㈜천랩(Seoul, South Korea) 에서 454 GS FLX Titanium Sequencing System (Roche, Branford, CT, USA)을 사용하여 수행하였다.
- FastDNA SPIN Kit (MP Biomedicals, Santa Ana, CA)를 이용하여 토양시료로부터 DNA를 추출하였다. 추출된 DNA 에서 16S rRNA유전자의 V1/V3영역을 증폭하기 위하여 퓨전 프라이머(fusion primer)를 사용하였다[24].
- 증폭된 PCR 산물은 QIAquick PCR Purifica- tion Kit (Qiagen, Valencia, CA)를 이용하여 정제하였으며, 정 제된 DNA 정량은 QuantiT TM PicoGreen dsDNA Assay Kit (Invitrogen, Carlsbad, CA)와 TBS-380 Mini Fluorometer (Turner BioSystems, Sunnyvale, CA)를 이용하여 분석하였다. PCR 산물을 전기영동하여 서열의 길이가 300 bp 이상의 DNA 를 선별하였다. DNA단편의 길이를 Agilent 2100 Bioanalyzer (Agilent Technologies, Santa Clara, CA, USA)를 이용하여 재 확인하였다[18].
- 본 연구에서는 메타지 노믹스 기법을 이용하여 울릉도 지역의 토양시료로부터 대량 의 세균군집을 최초로 분석하였다. 또한 울릉도와 가장 가까 운(약 87.4 km) 독도의 세균군집과 비교 분석하기 위하여, 기 출판된 독도의 동도 및 서도의 세균군집분석 연구결과와 비교 분석을 수행하였다.
- Bradyrhizobiaceae과에 속해 있는 Bradyrhizobium속은 토착 근류균으로 토양내 콩과식물 과 공생하며 질소를 고정하는 균으로 토양 내 널리 분포하고 있다[3, 4, 17]. 본 연구에서는 16S rRNA 유전자 기반의 파이로 시퀀싱을 이용하여 울릉도 토양에서의 세균 군집을 분석하였 고 독도의 동도 및 서도의 세균군집분석 연구결과와 비교분석을 수행하였다. 그 결과 문 수준에서 Proteobacteria문, Acido- bacteria문, 그리고 Actinobacteria문이 전체세균의 81.
- , Seoul, South Korea) 프로그램을 사용하여 수행하였다. 운영분류단 위(Operational Taxonomic Units, OUTs)는 97% 서열 유사성 을 기준으로 CD-HIT 프로그램을 사용하여 분석하였다[15]. 통 계분석(Chao1, Shannon, Simpson, Good's coverage)은 Mo- thur platform을 이용하여 분석하였다[8, 20].
- 전체 파이로시퀀싱 리드 시퀀스들로부터 바코드 시퀀스 및 프라이머 시퀀스를 제거하였으며, 낮은 퀄리티를 가지는 서열 (ambiguous base calls ≥2, read length <300 bp, 또는 average quality value <25)들을 제거하였다. 정확한 분류 할당(taxono- mic assignment) 결과를 얻기 위하여, 시퀀싱 결과들을 은닉 마르코프 모델(Hidden Markov Model (HMMER 3.0 plat- form, http://hmmer.janelia.org/)을 이용하여 비타겟(non- targeting) 16S rRNA 시퀀스와 키메릭(chimeric) 시퀀스들을 분석한 후 제거하였다. 결과의 서열들은 EzTaxon-e 데이터베 이스를 사용하여 BLASTN 탐색 및 쌍정렬(pairwise align- ments)기법을 이용하여 분류 할당을 수행하였다[1, 11].
- 중합효소연쇄반응(polymerase chain reaction)은 PTC-200 Peltier thermal cycler (MJ Research, Waltham, MA)를 이용하여 수행하였다. 증폭된 PCR 산물은 QIAquick PCR Purifica- tion Kit (Qiagen, Valencia, CA)를 이용하여 정제하였으며, 정 제된 DNA 정량은 QuantiT TM PicoGreen dsDNA Assay Kit (Invitrogen, Carlsbad, CA)와 TBS-380 Mini Fluorometer (Turner BioSystems, Sunnyvale, CA)를 이용하여 분석하였다. PCR 산물을 전기영동하여 서열의 길이가 300 bp 이상의 DNA 를 선별하였다.
- FastDNA SPIN Kit (MP Biomedicals, Santa Ana, CA)를 이용하여 토양시료로부터 DNA를 추출하였다. 추출된 DNA 에서 16S rRNA유전자의 V1/V3영역을 증폭하기 위하여 퓨전 프라이머(fusion primer)를 사용하였다[24]. 퓨전 프라이머는 454 특이 어댑터(454 specific adapters), key sequence 4 bp, barcode sequence (7~11 bp unique sequence), linker se- quence 2 bp, universal primers (518R and 27F)를 포함하고 있다.
대상 데이터
- 울릉도 성인봉에서 코어(깊이 15 cm, 직경 2 cm)를 사용하여 토양시료를 채취하였으며, 10코어의 토양시료를 채취하여 혼합 및 균일화시켰다.
- DNA단편의 길이를 Agilent 2100 Bioanalyzer (Agilent Technologies, Santa Clara, CA, USA)를 이용하여 재 확인하였다[18]. 파이로시퀀싱은 ㈜천랩(Seoul, South Korea) 에서 454 GS FLX Titanium Sequencing System (Roche, Branford, CT, USA)을 사용하여 수행하였다. 파이로시퀀싱 결과는 EMBL Sequence Read Archive (SRA) 데이터베이스에 등록하였으며, 부여받은 accession number PRJEB7304이다.
- 퓨전 프라이머는 454 특이 어댑터(454 specific adapters), key sequence 4 bp, barcode sequence (7~11 bp unique sequence), linker se- quence 2 bp, universal primers (518R and 27F)를 포함하고 있다. 포워드 프라이머(forward primer) 27F 시퀀스는 5'- CCTATCCCCTGTGTGCCTTGGCAGTC-TCAG-AC-AGTTT GATCMTGGCTCAG-3′, 리버스 프라이머(reverse primer) 518R 시퀀스는 5′-CCATCTCATCCCTGCGTGTCTCCGAC- TCAG-X-CWTTACCGCGGCTGCTGG-3′이며, 리버스 프라 이머의 X는 바코드 시퀀스를 나타내며 샘플들을 분리하기 위하여 사용되었다.
데이터처리
- 세균 군집 분석은 CLcommunity (Chunlab, Inc., Seoul, South Korea) 프로그램을 사용하여 수행하였다. 운영분류단 위(Operational Taxonomic Units, OUTs)는 97% 서열 유사성 을 기준으로 CD-HIT 프로그램을 사용하여 분석하였다[15].
- 운영분류단 위(Operational Taxonomic Units, OUTs)는 97% 서열 유사성 을 기준으로 CD-HIT 프로그램을 사용하여 분석하였다[15]. 통 계분석(Chao1, Shannon, Simpson, Good's coverage)은 Mo- thur platform을 이용하여 분석하였다[8, 20]. Chao1, Shannon, Simpson값의 계산방법은 Table 1의 공식을 사용하였다.
이론/모형
- 통 계분석(Chao1, Shannon, Simpson, Good's coverage)은 Mo- thur platform을 이용하여 분석하였다[8, 20]. Chao1, Shannon, Simpson값의 계산방법은 Table 1의 공식을 사용하였다.
- org/)을 이용하여 비타겟(non- targeting) 16S rRNA 시퀀스와 키메릭(chimeric) 시퀀스들을 분석한 후 제거하였다. 결과의 서열들은 EzTaxon-e 데이터베 이스를 사용하여 BLASTN 탐색 및 쌍정렬(pairwise align- ments)기법을 이용하여 분류 할당을 수행하였다[1, 11]. 분류 할당은 다음의 컷오프(cutoff) 값을 이용하였다: Species (x≥ 97%), genus (97%>x ≥94%), family (94%>x≥90%), order (90%>x≥85%), class (85%>x≥80%), phylum (80%>x≥ 75%)[5, 19].
- 중합효소연쇄반응(polymerase chain reaction)은 PTC-200 Peltier thermal cycler (MJ Research, Waltham, MA)를 이용하여 수행하였다. 증폭된 PCR 산물은 QIAquick PCR Purifica- tion Kit (Qiagen, Valencia, CA)를 이용하여 정제하였으며, 정 제된 DNA 정량은 QuantiT TM PicoGreen dsDNA Assay Kit (Invitrogen, Carlsbad, CA)와 TBS-380 Mini Fluorometer (Turner BioSystems, Sunnyvale, CA)를 이용하여 분석하였다.
성능/효과
- 06 bp, 최소길이는 283 bp, 최대길이는 522 bp로 분석되었다. CD- HIT 프로그램을 이용하여 97% 서열 유사성을 기준으로 클러 스트링(clustering)을 수행한 결과 총 1, 613개 OTUs가 분석되 었으며, Good's coverage값은 0.7174로 분석되었다(Table 2). 종 풍부도를 산정한 결과 Chao1값은 3, 906으로 나타났다.
- 강(class) 수준에서 분석한 결과 α-proteobacteria강이 36.07 %로 가장 높은 비율을 차지하였고, 다음으로 Acidobacteria_c강(10.65%), Solibacteres강(10.64%), δ-proteobacteria강 (4.42%), γ-proteobacteria강(4.29%), Planctomycetacia강(4.16%), Acti- nobacteria_c강(4.00%), Betaproteobacteria강(3.50%), EU686603 _c강(2.97%), Ktedonobacteria강(2.91%), Acidimicrobiia강(1.32 %), Verrucomicrobiae강(1.27%), Gemmatimonadetes_c강 (1.11%), Sphingobacteria강(1.09%), GU444092_c강(1.06%) 순 으로 분석되었다(Fig. 2). 독도의 세균 군집분석 결과에서 동도 와 서도 모두 α-proteobacteria강이 19.
- 과(family) 수준에서의 분석 결과는 Bradyrhizobiaceae과가 22.83%로 가장 높은 비율을 차지하였고, 다음으로 Acidobac- teriaceae과(10.62%), EU445199_f과(5.72%), Planctomyceta- ceae과(4.03%), Solibacteraceae과(3.63%), FM209092_f과(3.58 %), Steroidobacter_f과(2.81%), EU686603_f과(2.73%), Hy- phomicrobiaceae과(2.33%), Ktedonobacteraceae과(1.75%), AF498716_f과(1.46%), Rhizomicrobium_f과(1.03%), 그리고 Mycobacteriaceae과(1.01%) 순으로 분석되었다(Fig. 3). 울릉 도의 분석결과와 유사하게 독도의 동도 세균 군집분석 결과에서 Bradyrhizobiaceae과가 우점하는 것으로 나타나 있으나, 비 율은 울릉도에서 약 4배 높은 것으로 분석되었다[12].
- 본 연구에서는 16S rRNA 유전자 기반의 파이로 시퀀싱을 이용하여 울릉도 토양에서의 세균 군집을 분석하였 고 독도의 동도 및 서도의 세균군집분석 연구결과와 비교분석을 수행하였다. 그 결과 문 수준에서 Proteobacteria문, Acido- bacteria문, 그리고 Actinobacteria문이 전체세균의 81.47%를 차지하였고, Proteobacteria문이 49.29%로 우점하고 있었다. 강 수준에서는 α-proteobacteria강이 36.
- 독 도의 동도에서는 3, 975, 서도에서는 3, 455으로 울릉도와 동도 의 종 풍부도는 유사하며, 서도에서는 다소 낮게 나타났다[12]. 다양성 지수(Diversity index)를 측정한 결과, Shannon과 Sim- pson값은 각각 6.70, 0.0044로 분석되었다(Table 2). 독도의 동 도에서는 7.
- 83%로 우점하고 있었다. 독도의 동도와 서도의 세균군집 결과와 비교하였 을 때 유사한 다양성을 보이고 Actinobacteria문을 제외하고는 대부분 세균비율이 울릉도에서 높게 나타났다. 울릉도와 독도는 환경적으로 유사하지만 울릉도에서의 식물상이 보다 다양 하고 개체수가 훨씬 많기 때문에 우점하고 있는 세균의 비율은 높은 차이를 보였지만 비우점 세균들이 차지하는 비율은 다양하게 나타났다.
- 2). 독도의 세균 군집분석 결과에서 동도 와 서도 모두 α-proteobacteria강이 19.30%와 15.19%로 우점 도가 가장 높은 것으로 나타나 있으며, 울릉도에서의 비율은 36.7%로 독도와 비교하였을 때 약 2배 정도 높은 것으로 분석 되었다[12]. α-proteobacteria강에는 Rhodospirillales, Ricket- tisales, Rhodobacterales, Sphingomonadales, Caulobacter- ales, Rhizobiales의 6목(order)이 포함되어 있다.
- 문(phylum) 수준에서 세균 군집의 빈도수 분석 결과, Pro- teobacteria문이 48.28%로 가장 높은 비율을 차지하였고, 다음으로 Acidobacteria문(26.30%), Actinobacteria문(6.89%), Chloro- flexi문(4.58), Planctomycetes문(4.56%), Nitrospirae문(1.83%), Bacteroidetes문(1.51%), Verrucomicrobia문(1.48%), 그리고 Gemmatimonadetes문(1.11%) 순으로 분석되었다(Fig. 1). 울 릉도 세균 군집에서 Proteobacteria문, Acidobacteria문, 그리고 Actinobacteria문이 81.
- 1). 울 릉도 세균 군집에서 Proteobacteria문, Acidobacteria문, 그리고 Actinobacteria문이 81.47%를 차지하는 것으로 분석되었다. 독도의 동도와 서도의 세균 군집 분석의 경우에도 Proteo- bacteria문, Acidobacteria문, Actinobacteria문이 우점하고 있 었으며, 이들 3가지 문은 동도에서 78.
- 총 9, 295개의 염기서열에 대하여 전 처리(preprocessing) 과정을 수행한 결과, 3, 776개의 유효염기서열(valid read se- quences)이 분석되었다. 유효염기서열의 평균길이는 456.
후속연구
- 울릉도와 독도의 세균군집의 다양성 차이는 환경요인에 의한 영향보다 지리적인 위치와 더 관련이 있으며 또한 식생의 유형에 따라 세균 군집의 다양성 영향을 미치는 것으로 보인다. 본 연구는 앞으로 울릉도에서의 세균 배양 및 난배양에 대한 정보를 제공하고, 새로운 종의 선별을 용이하게 할 것으로 예상된다.
※ AI-Helper는 부적절한 답변을 할 수 있습니다.