칠피(漆皮) 추출물의 담도암 세포주 SNU-1079와 SNU-1196에 대한 항암효과 Study on Anti-Cancer Effects of Rhus Verniciflua Stokes Extracted with Sterile Distilled Water on Two Cholangiocarcinoma Cell Lines, SNU-1079 and SNU-1196원문보기
Objectives : This study was performed to investigate the anti-cancer effects of Rhus verniciflua Stokes (RVS) extracted with sterile distilled water on cholangiocarcinoma cell lines. Materials and Methods : Two cholangiocarcinoma cell lines, SNU-1079 and SNU-1196, were used in this study. Cells were...
Objectives : This study was performed to investigate the anti-cancer effects of Rhus verniciflua Stokes (RVS) extracted with sterile distilled water on cholangiocarcinoma cell lines. Materials and Methods : Two cholangiocarcinoma cell lines, SNU-1079 and SNU-1196, were used in this study. Cells were treated with different concentrations of RVS for 24, 48, and 72 hours. Cell count, viability, apoptosis, and mRNA expression of Bax, Bcl-2, Mcl-1, survivin, caspase-3, and cyclin D1 and P21 were determined with an automatic cell counter (ADAM-MC), MTT assay, apoptosis assay (Annexin-V/PI staining), and RT-PCR. Results : All cells treated with RVS showed decreased cell counts in a dose-dependent manner. RVS inhibited proliferation of SNU-1196 in a dose-dependent manner, but SNU-1079 proliferation was inhibited in the long-time culture group in a dose-dependent manner. The proportion of early and late-stage apoptotic cells was increased by RVS in a dose-dependent manner in SNU-1196. In contrast, it was increased significantly in SNU-1079 treated with high-dose RVS. After treatment with RVS, the mRNA expression of Bcl-2 was decreased while Bax was increased in SNU-1079. Cyclin D1 mRNA levels were decreased in SNU-1196 in a dose-dependent manner. P21 expression was increased in all cells after the treatment with RVS. Conclusions : RVS appears to have potential as a therapeutic agent for cholangiocarcinoma.
Objectives : This study was performed to investigate the anti-cancer effects of Rhus verniciflua Stokes (RVS) extracted with sterile distilled water on cholangiocarcinoma cell lines. Materials and Methods : Two cholangiocarcinoma cell lines, SNU-1079 and SNU-1196, were used in this study. Cells were treated with different concentrations of RVS for 24, 48, and 72 hours. Cell count, viability, apoptosis, and mRNA expression of Bax, Bcl-2, Mcl-1, survivin, caspase-3, and cyclin D1 and P21 were determined with an automatic cell counter (ADAM-MC), MTT assay, apoptosis assay (Annexin-V/PI staining), and RT-PCR. Results : All cells treated with RVS showed decreased cell counts in a dose-dependent manner. RVS inhibited proliferation of SNU-1196 in a dose-dependent manner, but SNU-1079 proliferation was inhibited in the long-time culture group in a dose-dependent manner. The proportion of early and late-stage apoptotic cells was increased by RVS in a dose-dependent manner in SNU-1196. In contrast, it was increased significantly in SNU-1079 treated with high-dose RVS. After treatment with RVS, the mRNA expression of Bcl-2 was decreased while Bax was increased in SNU-1079. Cyclin D1 mRNA levels were decreased in SNU-1196 in a dose-dependent manner. P21 expression was increased in all cells after the treatment with RVS. Conclusions : RVS appears to have potential as a therapeutic agent for cholangiocarcinoma.
이에 저자는 기원이 다른 2종류의 담도암 세포주 SNU-1079와 SNU-1196을 대상으로 漆皮의 물추출물을 투여하여 세포수, 세포증식, 세포자멸을 측정하고, 세포자멸의 경로를 관찰하기 위해 Bcl-2, Bax, Mcl-1, Survivin, Caspase-3, Cyclin D1 및 P21 mRNA 발현의 변화를 관찰하여 유의한 결과를 얻었기에 이에 보고하는 바이다.
FITC에만 양성반응을 보이는 세포는 조기 세포 자멸, FITC와 PI에 모두 양성반응을 보이는 세포는 후기 세포자멸 단계로, 이 두 가지 단계의 세포수 비율의 합으로 SNU-1079와 SNU-1196 세포주의 세포자멸을 평가하였다.
SNU-1079와 SNU-1196 세포주를 각 1×104 cells/well 농도로 96-well plate에 분주하고, 漆皮 추출물을 0, 50, 100, 200, 400 μg/ml 농도로 처리한 뒤, 24, 48, 72시간 동안 배양하였다.
漆皮 추출물을 각 0, 50, 100, 200, 400 μg/ml 농도로 처리한 SNU-1079와 SNU-1196 세포주를 ice-cold PBS buffer로 2차례 씻어내고, 500 μl binding buffer에서 재침전한 뒤, FITC 결합 Annexin-V(10 mg/ml)와 PI(50 mg/ml) 5 μl로 염색하여, 실온의 어두운 환경에서 5-15분가량 배양하고, FACSCalibur(Becton Dickinson Immunocytometry System, San Jose, CA, USA)를 이용하여 분석하였다.
기원이 다른 두 종류의 담도암 세포주 SNU-1079와 SNU-1196을 대상으로, 漆皮 추출물의 항암효과를 알아보기 위해, 세포수 측정, MTT assay, apoptosis assay(Annexin-V/PI staining), RT-PCR을 시행하였고, 다음과 같은 결론을 얻었다.
또한, 漆皮 추출물에 의한 세포자멸이 어떤 경로를 거쳐 발휘되는지 더 자세히 알아보기 위해, 몇 가지 target gene을 대상으로 RT-PCR을 시행하였다. 세포 자멸은 세포 표면에서 외부 인자가 death receptor 에 결합하면서 시작되는 외인성 경로와, 세포 내부 미토콘드리아의 막 투과성이 높아지면 세포자멸을 위한 단백질이 분비되면서 시작되는 내인성 경로의 2가지로 분류된다21.
먼저 漆皮 추출물이 담도암 세포주의 세포활성에 미치는 영향을 확인하기 위해, 세포수 관찰과 MTT assay를 시행하였다. 실험 시 0, 50, 100, 200, 400 μg/ml 의 농도로 漆皮 추출물을 처리하고, 24시간, 48시간, 72시간동안 배양하였다.
이에 저자는, 漆皮 추출물이 담도암의 치료에 효과가 있을 것이라 예측하고, 그 항암효과를 관찰하고자 세포수 관찰, MTT assay, apoptosis assay, RT-PCR을 시행하였다.
대상 데이터
본 실험에서 사용한 漆皮(Rhus verniciflua Stokes, 이하 RVS)는, 대한약전 및 대한약전외 한약 규격주해9에 근거하였으며, 경희대학교 부속 한방병원에서 구입하여 사용하였다.
한국 세포주 은행에서 기원이 다른 사람 담도암 세포주 2종류, SNU-1079(biliary tract cancer, intrahepatic duct)와 SNU-1196(biliary tract cancer, hepatic duct bifurcation)를 분양받아 사용하였다.
이론/모형
ADAM-MC(한국, Nanoteck Inc.)를 사용하였고, 제작사의 지시에 따라 측정하였다.
RT-PCR은 Applied Biosystem사(CA, USA)의 StepOnePlus RT PCR System을 이용하여 제작사가 권하는 방법에 따라 시행하였으며, House keeping gene인 β-actin을 기준으로 상대적인 유전자의 발현값을 정량적으로 표현하였다.
성능/효과
RPMI 1640 배양액에 FBS 10%와 penicillin/streptomycin 1%를 첨가한 뒤, 5% CO2, 37 ℃ 환경에서 배양하였다.
얻어진 동결건조 분말은 -80 ℃ 냉동고에 보관하고, 사용 시 해동 후, 증류수에 녹여서 0.2 μm syringe filter로 여과하여 필요한 농도(0, 50, 100, 200, 400 ug/ml)로 희석하여 사용하였다.
동결건조기를 이용하여 수득률 4.3%의 분말상태 칠피 0.43 kg을 얻었다.
다음으로, 5x reaction buffer(250 μM Tris-HCL, pH8.3) 4 μl와 RiboLock™ RNase Inhibitor(200 U/μl) 1 μl, 10 μM deoxynucleoside triphosphate(dNTP) MIX 2 μl, RevertAid™ M-MuLV Reverse Transcripase (200 U/μl) 1 μl을 넣고 전체 부피를 20 μl 되도록 조정한 뒤 부드럽게 흔들어 잘 섞어주었다. 25 ℃에 5분간, 42 ℃에 60분간, 70 ℃에 5분간의 조건으로 반응시키고, 합성된 DNA는 -80 ℃에서 보관하였다가 꺼내서 사용하였다.
3시간마다 분광기 상의 400 nm 파장에서 흡광도를 측정하여, 둔화된 변화량이 5% 미만으로 감소 되었을때 추출이 완료된 것으로 판단하였으며, 총 3시간이 소요되었다. 漆皮 추출액은 Whatman 여과지로 여과한 뒤, 감압농축 하였다.
SNU-1079와 SNU-1196 세포주를 6-well plate에 분주하고, 漆皮 추출물을 각 0, 50, 100, 200, 400 μg/ml 농도로 처리하였다. 각 24, 48, 72시간이 경과한 뒤, Qiagen사의 RNeasy Mini Plus Kit를 이용하여 제작사가 권하는 방법에 따라 RNA를 분리하였다.
SNU-1079와 SNU-1196 세포주에 0, 50, 100, 200, 400 μg/ml 농도의 漆皮 추출물을 투여하여 24, 48, 72시간동안 배양한 결과, 전 시간에 걸쳐 농도의존적으로 세포증식이 억제되는 SNU-1196과 달리, SNU-1079 세포주에서는 72시간에서 농도의존적으로 유의하게 세포 증식이 억제되었다(Fig. 2).
2. 漆皮 추출물은, SNU-1196 세포주에서 전 시간에 걸쳐 농도 의존적으로 세포 증식을 억제하였고, SNU-1079 세포주에서는 72시간에서 농도 의존적으로 세포증식을 억제하였다.
6. 漆皮 추출물을 처리한 SNU-1196 세포주에서 48시간 배양시 농도 의존적으로 Cyclin D1 발현이 감소하는 경향을 보였으며, P21의 경우 200 μg/ml 농도의 두 가지 세포주 모두에서 유의하게 mRNA 발현이 증가하였다.
3. 漆皮 추출물을 처리한 SNU-1196 세포주에서는 농도 의존적으로 세포 자멸이 증가하였으나, SNU-1079 세포주에서는 400 μg/ml 고농도에서 급격하게 세포 자멸이 증가하였다.
1. 漆皮 추출물을 처리한 두 가지 세포주 모두에서 농도 의존적으로 세포수가 감소하였다.
5. 漆皮 추출물을 처리한 두 가지 세포주 모두에서, 유의한 Survivin mRNA 발현의 감소나 Caspase-3 mRNA 발현의 증가는 없었다.
마지막으로 G1기에서 S기로의 이행을 주도하는 Cyclin D와 이러한 Cyclin D에 결합하는 Cyclin 의존 인산화효소의(Cdk4 등) inhibitor 역할을 하는 P21의24,25 mRNA 발현을 관찰한 결과, SNU-1196 세포주에서 농도 의존적으로 Cyclin D1 발현이 감소하는 경향을 보였으며, P21의 경우 200 μg/ml 농도에서 두 세포주 모두에서 mRNA 발현이 증가하였다.
먼저 Bcl-2 family로 pro-apoptotic(Bax) 작용과 anti-apoptotic(Bcl-2, Mcl-1) 작용으로 세포자멸을 조절22하는 3가지 mRNA 발현을 관찰한 결과, SNU-1079 세포주에서 세포자멸을 유도하는 Bax의 발현 증가와 세포자멸을 방해하는 Bcl-2의 발현 감소가 유의하게 나타났으나, SNU-1196 세포주에서는 유의한 결과를 보이지 않았다.
본 연구에서는 漆皮 추출물이 세포자멸 실행 단계 뿐 아니라, 조절 단계에서도 유효하게 작용하는 것을 알 수 있었다. 특히 SNU-1079 세포주에서는 외인성 경로, SNU-1196 세포주에서는 세포주기 조절을 통한 세포자멸 효과와 밀접한 관련이 있음을 나타낸다.
실험 시 0, 50, 100, 200, 400 μg/ml 의 농도로 漆皮 추출물을 처리하고, 24시간, 48시간, 72시간동안 배양하였다. 실험결과 SNU-1079과 SNU-1196 세포주 모두에서 농도 의존적으로 세포수가 감소하였다. 세포활성도는 SNU-1196에서 전 시간에 걸쳐 농도 의존적으로 활성도가 감소하였고, SNU-1079에서는 72시간에서 농도 의존적으로 감소하였다.
이상의 결과에서, 漆皮의 물추출물은 담도암세포주의 증식을 억제하는 효과가 있으며, 세포자멸을 유도할 뿐 아니라 세포주기 조절의 단계에서도 유효한 것으로 판단되어 담도암 치료에 유효할 것으로 사료된다. 다만 漆皮 투여에 대한 담도암 발생부위별 반응 및 기전의 차이에 대하여는 향후 추가적인 연구가 더 필요할 것으로 사료된다.
후속연구
이상의 결과에서, 漆皮의 물추출물은 담도암세포주의 증식을 억제하는 효과가 있으며, 세포자멸을 유도할 뿐 아니라 세포주기 조절의 단계에서도 유효한 것으로 판단되어 담도암 치료에 유효할 것으로 사료된다. 다만 漆皮 투여에 대한 담도암 발생부위별 반응 및 기전의 차이에 대하여는 향후 추가적인 연구가 더 필요할 것으로 사료된다.
다만, 이와 같은 담도암의 발생 부위에 따른 세포자멸기전 차이와 효과적인 치료 농도 및 시간에 대해서는 향후 추가적인 연구가 좀 더 필요할 것으로 사료된다.
이는, SNU-1079의 doubling time이 72시간이기 때문에 나타나는 결과로 생각되며, 상대적으로 doubling time이 짧은 SNU-1196에서는 단기간 漆皮 추출물을 투여하여도 증식 억제가 나타나는 것으로 예측된다. 또한, 50 μg/ml 농도에서는 두 세포주 모두에서 증식 억제가 유의성 있게 나타나지 않는 것으로 보아, 치료시 일정 농도 이상의 漆皮 추출물 투여가 필요할 것으로 사료된다.
한의계에서도 한의학적 접근을 통한 담낭암 및 담도암 치료효과에 대한 증례보고10-12가 진행 중에 있으며, 앞으로도 보다 다양한 접근과 연구가 필요할 것으로 생각된다.
참고문헌 (25)
DeOliveira ML, Cunningham SC, Cameron JL, et al. Cholangiocarcinoma: thirty-one-year experience with 564 patients at a single institution. Ann Surg 2007;245:755-62.
Blechacz BG, Gores GJ. Tumors of the bile ducts, gallbladder and ampulla. In: Feldman ed. Sleisenger and Fordtran's gastrointestinal and liver disease, Volume 1. 9th ed. Philadelphia: Saunders; 2010, p. 1171-6.
Aljiffry M, Walsh MJ, Molinari M. Advances in diagnosis, treatment and palliation of cholangiocarcinoma 1990-2009. World Journal of Gastroenterology 2009;15:4240-62.
Son YO, Lee KY, Lee JC, et al. Selective antiproliferative and apoptotic effects of flavonoids purified from Rhus verniciflua Stokes on normal versus transformed hepatic cell lines. Toxicology Letters 2005;155(1) :115-25.
Jang HS, Kook SH, Son YO, et al. Flavonoids purified from Rhus verniciflua Stokes actively inhibit cell growth and induce apoptosis in human osteosarcoma cells. Biochimica et Biophysica Acta 2005;1726(3):309-16.
Samoszuk M, Tan J, Chorn G. The chalcone butein from Rhus verniciflua Stokes inhibits clonogenic growth of human breast cancer cells co-cultured with fibroblasts. BMC Complementary and Alternative Medicine 2005;5(5).
Lee JC, Lee KY, Kim J, et al. Extract from Rhus verniciflua Stokes is capable of inhibiting the growth of human lymphoma cells. Food and Chemical Toxicology 2004;42(9):1383-8.
Lee JO, Moon JW, Lee SK, Kim SM, Kim NM, Ko SG, et all. Rhus verniciflua Extract Modulates Survival of MCF-7 Breast Cancer Cells through the Modulation of AMPK-Pathway. Biological & Pharmaceutical Bulletin 2014;37(5):794-801.
Lee JC, Lee KY, Kim J, Na CS, Jung NC, Chung GH, et all. Extract from Rhus verniciflua Stokes is capable of inhibiting the growth of human lymphoma cells. Food and Chemical Toxicology 2004;42:1383-8.
Nguyen M, Arkell J, Jackson CJ. Human endothelial gelatinases and angiogenesis. International Journal of Biochemistry and Cell Biology 2001;33(10) :960-70.
Moon G, Lee SH, Park JH. Effect of allergen removed Rhus verniciflua extract on inhibition of tumor metastasis. Journal of Korean Traditional Oncology 2010;15(1):47-61.
Kim JS, Park BY, Park EK, et al. Screening of antiangiogenic activity from plant extracts. Korean Journal of Pharmacognosy 2006;37(4) :253-7.
Oltvai ZN, Milliman CL, Korsmeyer SJ. Bcl-2 heterodimerizes in vivo with a conserved homolog, Bax that accelerates programmed cell death. Cell press 1993;74(4):609-19.
Tamm I, Wang Y, Sausville E, Scudiero DA, Vigna N, Oltersdorf T, et al. IAP-family protein survivin inhibits caspase activity and apoptosis induced by Fas(CD95), Bax, caspases, and anticancer drugs. Cancer Research 1998;58(23) :5315-20.
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