[논문]α1,3-Galactosyltransferase 유전자 위치에 사람 Decay Accelerating Factor와 α1,2-Fucosyltransferase 유전자가 Knock-in된 미니돼지 체세포

김지우; 강만종

doi:10.12749/rdb.2015.39.3.59

[국내논문] α1,3-Galactosyltransferase 유전자 위치에 사람 Decay Accelerating Factor와 α1,2-Fucosyltransferase 유전자가 Knock-in된 미니돼지 체세포
Knock-in Somatic Cells of Human Decay Accelerating Factor and α1,2-Fucosyltransferase Gene on the α1,3-Galactosyltransferase Gene Locus of Miniature Pig 원문보기

Reproductive & developmental biology = 한국동물번식학회지, v.39 no.3, 2015년, pp.59 - 67

김지우 (전남대학교 농업생명과학대학 동물자원학부) , 강만종 (전남대학교 농업생명과학대학 동물자원학부)

초록
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동물의 장기를 인간에게 이식하게 되면 초급성거부반응(Hyperacute rejection, HAR)이 일어난다. 초급성거부반응은 면역계의 구성요소 중 보체(complement)에 의해 일어나는 거부반응으로 돼지의 혈관세포 표면에 있는 $Gal{\alpha}$(1,3)Gal 당분자에 인간의 항체가 즉각 반응하기 때문에 일어나며, ${\alpha}1,3$-galactosyltransferase(${\alpha}1,3$-GT) 유전자는 돼지 혈관세포 표면의 $Gal{\alpha}$(1,3)Gal 당분자 생성에 관여한다. 따라서 인간에게 돼지의 장기를 이식하기 위해서는 ${\alpha}1,3$-galactosyltransferase 유전자를 제거하는 것이 필요한 것으로 알려져 있다. 본 연구실의 이전 연구에서, 시카고 미니돼지 귀체세포에서 상동 재조합(Homologous recombination)을 통해 ${\alpha}1,3$-galactosyltransferase 유전자가 제거된 체세포를 개발한 바 있으며, 이 체세포를 통하여 ${\alpha}1,3$-GT 유전자가 제거된 돼지도 생산된 바 있다. 본 연구에서는, human serum 처리 시 돼지 세포를 보호해 준다고 보고되고 있는 human complement regulator인 human Decay-accelerating factor(hDAF)와 human ${\alpha}1,2$-fucosyltransferase(hHT)유전자를 ${\alpha}1,3$-GT 유전자 위치에 gene targeting하여 동시에 hDAF와 hHT가 발현하는 체세포를 개발하였다. Knock-in vector는 hDAF와 hHT 두 유전자가 발현할 수 있도록 IRES로 연결하였으며, ${\alpha}1,3$-GT 유전자의 start codon을 이용하여 발현할 수 있도록 구축하였다. 구축한 vector는 electroporation을 통해 미니 돼지 체세포에 도입하였으며, PCR 결과, ${\alpha}1,3$-GT 유전자 위치에서 상동 재조합이 일어났음을 확인하였다. Positive-negative 선별 방법을 통해 얻은 gene targeting 된 체세포는 RT-PCR에 의해 hDAF와 hHT 유전자의 발현이 확인되었으며, 대조군(NIH minipig)에 비해 ${\alpha}1,3$-GT 유전자의 발현이 감소하였다. 또한 이들 세포에 100% human complement serum을 처리하였을 때 knock-in 세포가 대조군에 비해 30% 정도 더 높은 생존율을 보였다. 따라서 개발된 체세포는 이종간 장기이식을 위한 돼지 생산과 함께 이를 이용한 이종간의 장기 이식 시 초급성 거부반응을 억제하는 데 사용될 수 있을 것으로 생각된다.

Abstract ▼ AI-Helper

Galactose-${\alpha}1,3$-galactose (${\alpha}1,3$-Gal) epitope is synthesized at a high concentration on the surface of pig cells by ${\alpha}1,3$-galactosyltransferase gene (GGTA1). The ${\alpha}1,3$-Gal is responsible for hyperacute rejection in pig-to-human xenotransplantation. The generation of transgenic pigs as organ donors for humans is necessary to eliminate the GGTA1 gene that synthesize $Gal{\alpha}$(1,3)Gal. To prevent hyperacute graft rejection in pig-to-human xenotransplantation, previously, we developed ${\alpha}1,3$-galactosyltransferase gene-knock-out somatic cell by homologous recombination. In this study, we established cell lines of ${\alpha}1,3$-GT knock-out expressing hDAF and hHT gene from minipig fibroblasts to apply somatic cell nuclear transfer. The hDAF and hHT mRNA were expressed in the knock-in somatic cells and ${\alpha}1,3$-GT mRNA was suppressed. However, the knock-in somatic cells were increased resistance to human serum-mediated cytolysis.

주제어

AI 본문요약
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문제 정의

그러므로, 본 연구의 목적은 보다 효과적으로 초급성거부반응을 억제하기 위하여 α1,3-GT 유전자 위치에 human complement inhibitor인 hDAF와 hHT가 knock-in된 체세포를 개발하는 데 있다.

제안 방법

처리 후 얼음에서 2분간 방치하고, Proteinase K(10 mg/ml) 1 ul를 첨가하여 55℃에서 130분 동안 배양하였고, 다시 얼음에서 2분 방치 후, 100℃에서 5분간 배양하였다. 100℃ 배양 후에 가볍게 원심하여 총 45 ul 중 20 ul를 PCR 분석의 주형으로 사용하여 1차 PCR을 수행하였으며, 2차 PCR에서는 체세포로부터 분리한 genome DNA 100 ng을 사용하였다. PCR 반응은 Neo 3'-1(sense primer)과 HT DAF KI 3' primer 1(antisense primer)을 이용하고, 10×Tag buffer, EX tag(TAKARA, Japan), 250 uM dNTP mixture을 이용하여 94℃에서 30초간 denaturation, 68℃에서 30초간 annealing, 72℃에서 4분간 extension 조건으로 수행하였다.
2시간 배양 후, plate에서 human serum과 human complement serum을 제거하고, 1×PBS로 2회 wash 실시하였으며, 15% FBS가 첨가된 DMEM 배양액으로 교체하여 다시 37℃, CO₂ 배양기에서 2시간 배양하였다. 2시간 배양 후 cytotoxicity assay에 사용할 CCK-8 solution(DOJINDO, Japan)을 각 well당 50 ul씩 첨가하여 37℃, CO₂ 배양기에서 2시간 배양한 후 450 nm 흡광도에서 OD값을 측정하였다. Cytotoxicity는 3반복 실시하였으며, 100% human serum을 처리한 세포의 생존율을 100%로 보았을 때의 상대적 값을 계산하였다.
Cytotoxicity assay는 먼저, NIH 미니돼지 귀체세포와 hDAF/hHT Knock-in vector가 도입된 세포를 24 well culture plate의 각 1 well당 5,000개/100 ul를 접종 후 37℃, CO₂ incubator에서 세포가 90% 정도 confluent할 때까지 배양하였다. 세포가 90% 정도 confluent할 때, 1×PBS로 2회 wash 실시한 후, 100% human serum과 100% human complement serum으로 배양액을 교체하여 37℃, CO₂ 배양기에서 2시간 배양하였다.
2시간 배양 후 cytotoxicity assay에 사용할 CCK-8 solution(DOJINDO, Japan)을 각 well당 50 ul씩 첨가하여 37℃, CO₂ 배양기에서 2시간 배양한 후 450 nm 흡광도에서 OD값을 측정하였다. Cytotoxicity는 3반복 실시하였으며, 100% human serum을 처리한 세포의 생존율을 100%로 보았을 때의 상대적 값을 계산하였다.
G418 처리를 통해 선별된 세포는 forward primer로 Neo 유전자 영역의 Neo 3'-1, reverse primer로 knock-in vector 3’ arm의 바깥부분의 염기서열을 사용한 HT DAF KI 3'-1을 이용하여 PCR 증폭하였다.
nls와 5’arm이 subclong된 pGEM T-easy vector를 Nco1- Not1 제한효소 처리하고 hDAF는 BspH1-Sal1 제한효소 처리하여 insert를 제조한 후, 이를 Not1-Sal1 제한효소 처리한 pMCDT-A vector에 3 frgment ligation 하여 pDTnls-GT5-hDAF plasmid을 확보하였다. IRES 부분은 SalI restriction enzyme site를 삽입한 sense primer (GTCGA- CCATGCATCTAGGGC)와 antisense primer (GGGTCG- ACTCTAGAGGATCC)를 이용하여 PCR 증폭하였으며, pGEM T-easy vector에 subcloning하였다. hHT 유전자는 EcoRV restriction enzyme site을 삽입한 primer(GATAT CCTGCAAGCAGCTCGGCCATG)와 3‘는 stop codon 뒤쪽으로 BamHI restriction enzyme site를 삽입한 primer(GGATCCTCAAGGCTTAGCCAATGTCC)를 이용하여 PCR 증폭하여 pGEM T-easy vector에 subcloning하였다.
Knock-in vector는 돼지 α1,3-GT genome 5' 영역 5.6kb의 fragment를 left arm으로 이용하였으며, 돼지 α1,3-GT genome 3‘ 영역 2.5kb의 fragment를 right arm으로 이용하여 구축하였다.
Knock-in vector는 돼지 α1,3-GT의 exon 4의 start codon 위치에 hDAF, IRES, hHT를 순차적으로 연결하여 다음과 같이 제작하였다.
Knock-in vector의 5’arm 부분의 구축을 위하여 5' frag- ment는 SalI restriction enzyme site가 삽입된 primer (GTCGACCAACACTGGATCCTTAACCCATTGAGCGG GTCCA)와 NcoI restriction enzyme site가 삽입된 primer (CCATGGTTTTCTCCTGGGAAAAGAAAAGGAGAAGG GAAAATT)로 PCR 증폭하고, pGEM T-easy vector에 subcloning하였다.
Long PCR은 세포에서 추출한 genomic DNA를 주형으로 사용하였으며, Primer는 KI PCR2 SII(sense primer)와 HT DAF KI 3' primer 1(antisense primer)를 이용하고, 10×Tag buffer, LA tag(TAKARA, Japan), 250 uM dNTP mixture을 이용하여 94℃에서 30초간 denaturation, 68℃에서 30초간 annealing, 72℃에서 10분간 extension을 조건으로 수행하였다.
PCR 반응은 Neo 3'-1(sense primer)과 HT DAF KI 3' primer 1(antisense primer)을 이용하고, 10×Tag buffer, EX tag(TAKARA, Japan), 250 uM dNTP mixture을 이용하여 94℃에서 30초간 denaturation, 68℃에서 30초간 annealing, 72℃에서 4분간 extension 조건으로 수행하였다.
PCR 반응을 위한 조성은 각각의 primer 10 pmole, 10×PCR buffer, EX HS tag(TAKARA, Japan), 250 uM dNTP mixture을 포함하며, PCR 조건은 H2a는 94℃에서 30초간 denaturation, 63℃에서 30초간 annealing, 72℃에서 30초간 extension으로 33 cycle 수행하였다.
PCR과 long PCR로 확인된 총 3개의 colony를 24 well, 12 well, 6 well, 10 cm dish로 계대배양하였고, 장시간 배양에 따라 본래의 미니돼지 세포의 핵형(karyotype)에 이상이 있는지 확인하기 위하여 핵형 검사를 실시하였다. 그 결과, Fig.
PGK-neo는 XbaI restriction enzyme site을 삽입한 5’ primer(TCTAGATACCGGGTAGGGGA GGCGCT)와 HindIII restriction enzyme site을 삽입한 3‘ primer(AAGCTTTCAGAAGAACTCGTCAAGA)을 준비된 PGK-neo plasmid을 이용하여 PCR 증폭한 후 pGEM T-easy vector에 subcloning하여 T-easy/PGK-neo plasmid을 확보하였다.
RT-PCR을 통해 α1,3GT-hDAF-hHT knock-in vector가 도입된 세포에서 hDAF와 hHT의 발현을 확인하였으며, hDAF와 hHT의 발현이 human complement serum 처리에 의한 세포 생존율에 영향을 미치는 지 확인하기 위하여 cytotoxicity 분석을 수행하였다.
유전자 발현의 상대적 정량은 ∆Ct값(시료의 Ct값－ H2a RNA의 Ct값)을 계산하고 난 다음 ∆∆Ct값(시료의 ∆Ct값－internal control H2a의 ∆Ct값)을 구하여 internal control H2a의 발현을 1로 보았을 때의 상대적 정량을 2-∆∆Ct값으로 계산하였다. Realtime PCR은 3반복 실시하였으며, 같은 real-time PCR 조건에서 H2a를 internal control로 함께 실시하였다.
SV40 poly A를 연결은 PCR에 의해 Poly A의 5’에 BamHI restriction enzyme site을 삽입(GGATCCTCGCCCTTCCCAACAGTT)하고, 3‘에 XbaI restriction enzyme site가 삽입된 primer(TCTAGA TTAAGATACATTGATGAGTT)을 제조하고 PCR 증폭하여 pGEM T-easy vector에 subcloning하였다.
hHT 유전자는 EcoRV restriction enzyme site을 삽입한 primer(GATAT CCTGCAAGCAGCTCGGCCATG)와 3‘는 stop codon 뒤쪽으로 BamHI restriction enzyme site를 삽입한 primer(GGATCCTCAAGGCTTAGCCAATGTCC)를 이용하여 PCR 증폭하여 pGEM T-easy vector에 subcloning하였다. Sequence를 확인하고 EcoR V-BamH I로 절단하여 hHT insert를 준비하고 EcoR V-BamH1 제한효소 처리한 pBluescript KS vector를 제조하여 insert와 vector를 연결하여 pBKS-HT plasmid를 제조하였다. 앞에서 준비한 SalI - SmaI IRES insert를 pBKS-HT/Sal I-EcoR V vector에 연결하여 pBKSIRES-HT plasmid를 준비하였다.
에 electroporation으로 도입하였다. Transfection된 세포는 12일 동안 G418을 300 ug/ml의 농도로 처리하여 선별하였으며, 상동유전자 재조합이 일어났을 것으로 추정되는 colony만을 pick-up하여 1차 PCR을 수행하였다. 그 결과, Table 1에 나타낸 바와 같이 총 4회 반복에서 174개의 colony를 PCR 분석하였다.
Transfection에 사용할 최종세포는 1.2×107/ml가 되도록 Ham's F-10 배지로 현탁하였으며, 이 세포 현탁액 400 ul와 직선화된 knock-in vector 10 ug/100 ul Ham's F-10 배지를 혼합한 후 4mm gap cuvette(BTX, USA)에 넣은 후 BTX Electro-cell manipulator(ECM 2001, BTX, USA)에 장착한 다음 450 V, 4 pulse, 1 ms으로 전기충격을 실시하였다.
Transfection을 통해 확보한 knock-in된 세포는 양쪽 염색체의 α1,3-GT 유전자 위치 중 한쪽만 삽입된 것으로 상동 유전자 재조합이 일어난 대립유전자와과 일어나지 않은 대립유전자를 확인하기 위하여 본 연구에서 얻은 총 3개의 colony에서 Long PCR을 수행하였다.
pGEM T-easy vector에 subclong된 nls와 5‘arm 부분을 Not1-Xho1과 Sal1-Nco1 제한효소 처리하여 insert를 제조하고, Nco1-Not1 제한효소를 이용하여 다시 pGEM T-easy vector에 3 fragment ligation하였다. hDAF는 hDAF/T-easy vector를 template로 사용하였고, start codon ATG 위치 앞쪽 primer(TCACTAGTGATT CTAGGAATTCATG)와 SalI restriction enzyme site를 삽입한 primer(GTCGACGGGATCCCTAAGTCAGCAA)를 이용하여 PCR 증폭하여 pGEM T-easy vector에 sub- cloning하였다. 본 연구에서 사용한 hDAF/T-easy vectors는 한국생명공학연구원 강용국 박사로부터 제공받았다.
5kb의 fragment를 3' arm으로 이용하여 knock-in vector를 구축하였다. hDAF와 hHT는 동시에 발현할 수 있도록 Internal ribosome entry site(IRES)를 이용하여 연결하였으며, 구축된 knock-in vector를 세포에 삽입한 후 삽입된 세포만을 선별하기 위하여 positive selection marker로 neo유전자를 사용하였고, negative marker로 DT-A를 사용하였다. α1,3-GT 위치에서 hDAF와 hHT가 발현할 수 있도록 α1,3-GT 유전자의 exon 4 ATG 위치에 hDAFIRES-HT의 ATG 위치를 일치시켰다.
hHT 유전자는 EcoRV restriction enzyme site을 삽입한 primer(GATAT CCTGCAAGCAGCTCGGCCATG)와 3‘는 stop codon 뒤쪽으로 BamHI restriction enzyme site를 삽입한 primer(GGATCCTCAAGGCTTAGCCAATGTCC)를 이용하여 PCR 증폭하여 pGEM T-easy vector에 subcloning하였다.
hHT가 발현하는 형질전환 마우스와 돼지의 세포 배양시 Galα(1,3)Gal 당분자를 감소시킨다고 보고된 바 있으며(Cooper 등, 1993), 본 연구에서는 hDAF와 hHT가 α1,3-GT locus에서 α1,3-GT 유전자의 ATG 부분에 삽입되면서 α1,3-GT 유전자가 본래 발현되는 양만큼 발현할 수 있도록 하였다.
nls와 5’arm이 subclong된 pGEM T-easy vector를 Nco1- Not1 제한효소 처리하고 hDAF는 BspH1-Sal1 제한효소 처리하여 insert를 제조한 후, 이를 Not1-Sal1 제한효소 처리한 pMCDT-A vector에 3 frgment ligation 하여 pDTnls-GT5-hDAF plasmid을 확보하였다.
SV40 poly A를 연결은 PCR에 의해 Poly A의 5’에 BamHI restriction enzyme site을 삽입(GGATCCTCGCCCTTCCCAACAGTT)하고, 3‘에 XbaI restriction enzyme site가 삽입된 primer(TCTAGA TTAAGATACATTGATGAGTT)을 제조하고 PCR 증폭하여 pGEM T-easy vector에 subcloning하였다. pGEM T- easy vector에 Poly A를 연결하여 얻은 plasmid는 BamH1-Xba1으로 절단하여 insert를 제작하였고, pBKS-IRES-HT plasmid를 BamH1-Xba1으로 제한효소 처리하여 vector를 제작하였으며, polyA insert와 vector를 연결시켜 pBKS-IRESHT-polyA plasmid를 제조하였다. Knock-in vector의 3’ arm 부분은 다음과 같이 PGK-neo와 α1,3-GT 3‘ frag- ment를 연결시켰다.
pGEM T-easy vector에 subclong된 nls와 5‘arm 부분을 Not1-Xho1과 Sal1-Nco1 제한효소 처리하여 insert를 제조하고, Nco1-Not1 제한효소를 이용하여 다시 pGEM T-easy vector에 3 fragment ligation하였다.
그러므로 knock-in vector가 도입된 세포에서 α1,3-GT, hDAF, hHT의 발현을 RT-PCR과 real-time PCR을 통해 확인하였다.
그리고 준비된 insert 2개를 pBluescript SK에 3 fragment ligation 시켜 pBSK-neo-α1,3-GT 3' plasmid를 구축하였다.
hDAF 유전자가 발현하는 형질전환 돼지는 세포 표면에서 보체계를 조절하며, 이종 간의 장기이식이 일어나는 초급성 거부반응으로부터 효과적으로 보호한다고 보고되었다(Yang과 Sykes, 2007; Baldan 등, 2004; Chen 등, 2006). 또한 hHT의 발현은 human complement serum에 의한 세포 생존율이 증가된다는 연구결과들로 초급성 거부 반응을 방지할 수 있을 것으로 보고되고 있으며(Costa 등, 2002), 본 연구에서 구축한 knockin vector를 도입한 체세포에서 정상적인 hHT의 발현을 통한 human complement serum에 의한 cytolysis를 조사하였다. 본 연구에서 개발한 체세포에서 정상적인 hDAF 유전자와 hHT 유전자의 발현을 확인하였으며, 이는 이종 간의 장기 이식 시 complement 활성에 의해 일어나는 초급성 거부반응을 극복하는 데 도움이 될 것으로 생각된다.
5kb의 fragment를 right arm으로 이용하여 구축하였다. 또한 positive selection marker로는 neo 유전자를 이용하였으며, negative selection marker로는 DT-A 유전자를 이용하여 positive-negative 선별이 가능한 knock-in vector를 구축하였다. Knock-in vector는 돼지 α1,3-GT의 exon 4의 start codon 위치에 hDAF, IRES, hHT를 순차적으로 연결하여 다음과 같이 제작하였다.
본 실험에서 α1,3GT-hDAF-hHT knock-in vector를 NIH 미니돼지 귀 체세포 5×106에 electroporation으로 도입하였다.
본 연구에서 Fig. 1에서 나타낸 바와 같이, 5.6 kb 5' arm과 2.7 kb 3' arm으로 구성된 knockin vector를 구축하였다.
본 연구에서 구축된 hDAF와 hHT가 발현하는 knock-in vector를 미니돼지 귀 체세포에 도입하여 knock-in 된 체세포를 개발하였다. Knock-in 된 미니돼지 체세포를 이용하여 hDAF와 hHT가 α1,3-GT 위치에서 정상적으로 발현하는 형질전환 돼지를 생산 할 수 있을 것으로 생각된다.
본 연구에서는 α1,3-GT 유전자 영역을 이용하여 knock-in vector를 구축하였고, 상동 유전자 재조합을 통해 세포에 knock-in vector의 도입 유무를 확인하기 위한 방법으로 positivenegative selection을 이용하였다.
본 연구에서는 human complement regulatory protein 중 하나인 hDAF를 발현하도록 knock-in vector를 구축하였으며, hDAF는 세포 표면에서 complement system을 조절한다고 알려져 있다. hDAF 유전자가 발현하는 형질전환 돼지는 세포 표면에서 보체계를 조절하며, 이종 간의 장기이식이 일어나는 초급성 거부반응으로부터 효과적으로 보호한다고 보고되었다(Yang과 Sykes, 2007; Baldan 등, 2004; Chen 등, 2006).
본 연구에서는 이 vector를 α1,3GT-hDAF-HT Knock-in vector라고 명명하였으며, 구축한 vector는 NotI 제한효소 처리를 통해 직선화하여 미니돼지 귀체세포에 transfection 하였다.
세포가 90% 정도 confluent할 때, 1×PBS로 2회 wash 실시한 후, 100% human serum과 100% human complement serum으로 배양액을 교체하여 37℃, CO2 배양기에서 2시간 배양하였다.
PCR 조건은 94℃에서 15초간 denaturation, 50℃에서 30초간 annealing, 72℃에서 20초간 extension으로 45cycle 증폭하였다. 유전자 발현의 상대적 정량은 ∆Ct값(시료의 Ct값－ H2a RNA의 Ct값)을 계산하고 난 다음 ∆∆Ct값(시료의 ∆Ct값－internal control H2a의 ∆Ct값)을 구하여 internal control H2a의 발현을 1로 보았을 때의 상대적 정량을 2-∆∆Ct값으로 계산하였다. Realtime PCR은 3반복 실시하였으며, 같은 real-time PCR 조건에서 H2a를 internal control로 함께 실시하였다.
1차 PCR에서 확인된 positive colony는 3개였다. 이들 colony를 계대 배양하여 genome DNA를 회수한 다음, 2차 PCR과 Long PCR로 상동유전자 재조합 여부를 다시 확인하였다.
이러한 α1,3GT- hDAFHT Knock-in vector는 상동유전자 재조합에 의하여 α1,3-GT 유전자 위치에 삽입되면 α1,3-GT는 knock-out되고, hDAF와 hHT는 α1,3-GT 유전자의 gene regulatory se- quence을 전체적으로 이용하여 발현할 수 있도록 제조하였다.
준비된 pBluescript KS-IRES-HT-polyA vector를 SalIXbaI으로 절단하고, pBluescript SK-neo-α1,3-GT 3' frag- ment vector를 XbaI-SmaI으로 절단하여 각각 insert를 준비하고, pMCDT-A vector를 SalI-SmaI으로 절단하여 준비한 후 3 fragment ligation 하여 pDT-IRES-HT-polyA-neoGT3' plasmid를 제조하였다.
α1,3-GT는 94℃에서 30초간 denaturation, 63℃에서 30초간 annealing, 72℃에서 40초간 extension으로 28 cycle을, hDAF는 94℃에서 30초간 denaturation, 51℃에서 30초간 annealing, 72℃에서 30초간 extension으로 33 cycle을, hHT는 94℃에서 30초간 denaturation, 60℃에서 30초간 annealing, 72℃에서 1분 20초간 extension으로 28 cycle 증폭하였다. 증폭 여부는 2% agarose gel에서 전체 50 ul의 PCR 반응액 중 20 ul를 전기 영동하여 확인하였다.
PCR 반응은 Neo 3'-1(sense primer)과 HT DAF KI 3' primer 1(antisense primer)을 이용하고, 10×Tag buffer, EX tag(TAKARA, Japan), 250 uM dNTP mixture을 이용하여 94℃에서 30초간 denaturation, 68℃에서 30초간 annealing, 72℃에서 4분간 extension 조건으로 수행하였다. 총 50 ul의 PCR 산물 중 20 ul를 0.8% agarose gel에서 전기 영동하여 증폭 여부를 확인하였다. Long PCR은 세포에서 추출한 genomic DNA를 주형으로 사용하였으며, Primer는 KI PCR2 SII(sense primer)와 HT DAF KI 3' primer 1(antisense primer)를 이용하고, 10×Tag buffer, LA tag(TAKARA, Japan), 250 uM dNTP mixture을 이용하여 94℃에서 30초간 denaturation, 68℃에서 30초간 annealing, 72℃에서 10분간 extension을 조건으로 수행하였다.
Long PCR은 세포에서 추출한 genomic DNA를 주형으로 사용하였으며, Primer는 KI PCR2 SII(sense primer)와 HT DAF KI 3' primer 1(antisense primer)를 이용하고, 10×Tag buffer, LA tag(TAKARA, Japan), 250 uM dNTP mixture을 이용하여 94℃에서 30초간 denaturation, 68℃에서 30초간 annealing, 72℃에서 10분간 extension을 조건으로 수행하였다. 총 50 ul의 PCR 산물 중 20 ul를 0.8% agarose gel에서 전기 영동하여 확인하였다. 각 primer의 염기서열은 Table 1에 제시하였다.
회수한 세포는 RNeasy mini kit(QIAGEN, USA)를 사용하여 total RNA를 추출하였으며, 그 중 5 ug을 Superscript II RNaseH-reverse transcriptase(Invitrogen, USA)와 random primer를 이용하여 cDNA에 이용하였으며, 이 cDNA를 주형으로 다음과 같이 α1,3-GT, hDAF, hHT의 발현을 확인하였다.

대상 데이터

본 연구에서는 α1,3-GT 유전자 영역을 이용하여 knock-in vector를 구축하였고, 상동 유전자 재조합을 통해 세포에 knock-in vector의 도입 유무를 확인하기 위한 방법으로 positivenegative selection을 이용하였다. Positive selection marker로 neo 유전자를 사용하였고, negative selection marker로는 diphtheria toxin A (DT-A) 유전자를 사용하였다. Diphtheria toxin A fragment는 cytoplasm에서 elongation factor 2 (EF-2)을 불활성화 시켜 단백질 합성을 억제하고 세포 사멸을 일으킨다(Yamaizumi 등, 1978)고 알려져 있으며 knock-in vector가 비특이적으로 삽입되면 DT-A 유전자가 발현하여 세포가 사멸하게 된다.
Template는 1st cDNA 40 ng을 이용하였으며, primer는 RT-PCR에서 사용한 α1,3-GT의 primer와 같은 것을 이용하였다.
pGEM T-easy/PGK-neo plasmid를 XbaI-HindIII으로 절단하여 insert를 준비하고, pGEM T-easy/α1,3-GT 3' fragment plasmid를 HindIII-SmaI으로 제한효소 처리하여 insert를 준비하였다.
Transfection된 세포는 12일 동안 G418을 300 ug/ml의 농도로 처리하여 선별하였으며, 상동유전자 재조합이 일어났을 것으로 추정되는 colony만을 pick-up하여 1차 PCR을 수행하였다. 그 결과, Table 1에 나타낸 바와 같이 총 4회 반복에서 174개의 colony를 PCR 분석하였다. 1차 PCR에서 확인된 positive colony는 3개였다.
본 연구에서 사용된 미니돼지는 국립축산과학원에서 사육되고 있는 NIH 미니돼지를 이용하였다. NIH 미니돼지 귀체세포는 조직배양 방법에 의하여 확보하였으며, 일반적인 세포배양을 위한 배지로는 15% defined Fetal Bovine Serum(Hyclone, USA), 1Xnon-essential amino acid(Welgene, Korea), 10^-4 M β-mercaptoehtanol(Sigma, USA), 100 unit/ml penicillin(Hyclone, USA), 100 ug/ml streptomycin (Hyclone, USA)을 포함하는 DMEM을 이용하였다.
hDAF는 hDAF/T-easy vector를 template로 사용하였고, start codon ATG 위치 앞쪽 primer(TCACTAGTGATT CTAGGAATTCATG)와 SalI restriction enzyme site를 삽입한 primer(GTCGACGGGATCCCTAAGTCAGCAA)를 이용하여 PCR 증폭하여 pGEM T-easy vector에 sub- cloning하였다. 본 연구에서 사용한 hDAF/T-easy vectors는 한국생명공학연구원 강용국 박사로부터 제공받았다. nls와 5’arm이 subclong된 pGEM T-easy vector를 Nco1- Not1 제한효소 처리하고 hDAF는 BspH1-Sal1 제한효소 처리하여 insert를 제조한 후, 이를 Not1-Sal1 제한효소 처리한 pMCDT-A vector에 3 frgment ligation 하여 pDTnls-GT5-hDAF plasmid을 확보하였다.
본 연구에서는 3번의 transfection을 통하여 α1,3GThDAF-hHT Knock-in vector가 도입된 colony를 3개 확보할 수 있었다.

이론/모형

Knock-in vector를 NIH 미니돼지 귀체세포에 도입하기 위하여 electroporation 방법을 사용하였다. 미니돼지 체세포는 15% defined FBS, 1Xnon-essential amino acid, 10^-4 M β-mercaptoehtanol, 100 unit/ml penicillin, 100 ug/ml streptomycin이 첨가된 DMEM 배지에서 배양하였다.
NIH 미니돼지 귀체세포는 조직배양 방법에 의하여 확보하였으며, 일반적인 세포배양을 위한 배지로는 15% defined Fetal Bovine Serum(Hyclone, USA), 1Xnon-essential amino acid(Welgene, Korea), 10-4 M β-mercaptoehtanol(Sigma, USA), 100 unit/ml penicillin(Hyclone, USA), 100 ug/ml streptomycin (Hyclone, USA)을 포함하는 DMEM을 이용하였다.

성능/효과

24 well culture plate에 control로 사용할 NIH 미니돼지 귀체세포와 knock-in된 체세포를 접종하여 90% 이상 confluent한 상태에서 100% human serum과 100% human complement serum을 2시간 처리한 결과, Fig. 6에서 나타낸 바와 같이 control 세포에 비해 α1,3GT-hDAF-hHT knock-in vector가 도입된 세포의 생존율이 30% 정도 높은 것을 확인하였다.
Knock-in vector 도입된 세포에서 α1,3-GT의 발현은 control에 비하여 감소하게 보였으며, real-time PCR 분석을 통해 보다 명확히 확인하였다.
그러므로 knock-in vector가 도입된 세포에서 α1,3-GT, hDAF, hHT의 발현을 RT-PCR과 real-time PCR을 통해 확인하였다. Knock-in vector가 도입된 체세포에서 total RNA를 추출한 후, cDNA를 합성하여 이를 주형으로 하여 PCR를 수행한 결과, Fig. 5a에서 나타낸 바와 같이, hDAF와 hHT의 발현은 control 세포에서는 확인되지 않았고, knock-in vector가 도입된 세포에서만 확인되었다. Knock-in vector 도입된 세포에서 α1,3-GT의 발현은 control에 비하여 감소하게 보였으며, real-time PCR 분석을 통해 보다 명확히 확인하였다.
PCR 증폭결과는 Fig. 2에서 나타낸 바와 같이, transfection을 통해 상동 재조합이 일어나 α1,3GT-hDAF-hHT knock-in vector가 도입된 세포 3개에서는 2.7 kb의 band을 확인할 수 있었다.
hDAF와 hHT가 발현하도록 개발한 체세포에서 total RNA를 추출하여 cDNA합성 후 RT-PCR을 수행한 결과, α1,3-GT 유전자 위치에서 hDAF와 hHT 유전자가 정상적으로 발현함을 확인하였다.
PCR과 long PCR로 확인된 총 3개의 colony를 24 well, 12 well, 6 well, 10 cm dish로 계대배양하였고, 장시간 배양에 따라 본래의 미니돼지 세포의 핵형(karyotype)에 이상이 있는지 확인하기 위하여 핵형 검사를 실시하였다. 그 결과, Fig. 4에서 나타낸 바와 같이, 100% 미니돼지 핵형과 일치하는 것을 확인하였다.
따라서 돼지 α1,3-GT 유전자의 ATG site에 IRES에 의하여 hDAF와 hHT가 연결된 유전자의 ATG site를 일치시키게 한다면 α1,3-GT 유전자는 knock-out되면서 hDAF와 hHT 유전자를 knock-in 하여α1,3-GT 유전자 영역의 promoter와 enhancer 등의 gene regulatory sequence에 의해 발현할 수 있을 것으로 추측된다.
2004년 hDAF가 과발현된 형질전환 돼지의 심장을 baboon 원숭이에 이식시켰을 때 139일 생존하였음이 보고된 바 있다. 따라서 본 연구에서 hDAF와 hHT가 발현하는 체세포를 사용한 돼지 생산으로 인하여 이종간의 장기 이식시 생존율이 증가할 것으로 생각된다.
또한 real-time PCR 분석 결과, α1,3-GT 유전자의 발현이 control 세포에 비하여 80% 감소되었음을 확인할 수 있었다.
이러한 결과는 본 연구에서 개발한 knock-in vector가 도입된 체세포에서도 hDAF와 hHT의 발현이 정상적으로 이루어지고 있으며, 이러한 발현은 Galα(1,3)Gal 당분자 발현을 감소시킬 것으로 생각된다.

후속연구

α1,3-GT 유전자를 knock-out 시킨 돼지 장기의 이식은 초급성 거부반응을 억제할 수 있었지만, 초급성 거부반응에 이은 급성 거부반응을 극복하기 위해서는 더 연구가 필요하다.
Knock-in 된 미니돼지 체세포를 이용하여 hDAF와 hHT가 α1,3-GT 위치에서 정상적으로 발현하는 형질전환 돼지를 생산 할 수 있을 것으로 생각된다.
이러한 positivenegative selection marker를 이용한 gene targeting vector는 생쥐 ES cell을 이용한 gene targeting에 이용되어져왔다(Yanagawa 등, 1999). 따라서 본 연구에서 구축한 knockin vector도 positive selection marker로 neo 유전자와 negative selection marker로 DT-A 유전자를 가지고 있으므로 돼지 체세포에서 정상적으로 기능하여 knock-in vector 도입 세포의 선별이 가능할 것으로 생각된다.
Knock-in 된 미니돼지 체세포를 이용하여 hDAF와 hHT가 α1,3-GT 위치에서 정상적으로 발현하는 형질전환 돼지를 생산 할 수 있을 것으로 생각된다. 또한 이러한 knock-in vector 시스템을 통하여 이종장기 이식 시 초급성 거부반응을 억제할 수 있는 많은 유전자들 중 2개 이상 발현하는 미니돼지 생산도 기대해 본다.
또한 hHT의 발현은 human complement serum에 의한 세포 생존율이 증가된다는 연구결과들로 초급성 거부 반응을 방지할 수 있을 것으로 보고되고 있으며(Costa 등, 2002), 본 연구에서 구축한 knockin vector를 도입한 체세포에서 정상적인 hHT의 발현을 통한 human complement serum에 의한 cytolysis를 조사하였다. 본 연구에서 개발한 체세포에서 정상적인 hDAF 유전자와 hHT 유전자의 발현을 확인하였으며, 이는 이종 간의 장기 이식 시 complement 활성에 의해 일어나는 초급성 거부반응을 극복하는 데 도움이 될 것으로 생각된다. Control과 knock-in vector가 도입된 체세포에 100% human complement serum 처리 시 control에 비해 40% 높은 생존율을 보였으며, 이는 정상적인 hDAF와 hHT의 발현으로 인한 것으로 생각되며, human serum에 의한 cytotoxicity를 더 효과적으로 보고할 수 있을지도 모른다.

질의응답

핵심어	질문	논문에서 추출한 답변
	초급성거부반응이란 무엇인가?	초급성거부반응(Hyperacute rejection)은 동물의 장기를 인간에게 이식할 때, 돼지의 혈관세포 표면에 붙은 당분자에 인간의 항체가 즉각 반응하여 일어나는 거부반응으로 알려져 있다(Platt와 Lin, 1998; Cooper 등, 1993; Sandrin 등, 1993). Galα(1,3)Gal 당분자는 돼지, 마우스, new world monkeys에는 존재하지만, 인간과 old world monkeys에는 부재한다고 알려져 있으며, Xenogeneic natural antibody(XNA)에 의해 인식되는 당사슬항원(carbohydrate epitope)은 대부분이 Galα(1,3)Gal 당분자로 α1,3-galactosyltransferase(α1,3-GT)유전자가 Galα(1,3)Gal 당분자 생성에 관여한다고 보고되어 있다(Blanken와 Van den Eijnden, 1985; Galili 등, 1987; Koren 등, 1992).
	초급성거부반응를 극복하기 위한 방안에는 어떠한 것이 있는가?	Galα(1,3)Gal 당분자는 돼지, 마우스, new world monkeys에는 존재하지만, 인간과 old world monkeys에는 부재한다고 알려져 있으며, Xenogeneic natural antibody(XNA)에 의해 인식되는 당사슬항원(carbohydrate epitope)은 대부분이 Galα(1,3)Gal 당분자로 α1,3-galactosyltransferase(α1,3-GT)유전자가 Galα(1,3)Gal 당분자 생성에 관여한다고 보고되어 있다(Blanken와 Van den Eijnden, 1985; Galili 등, 1987; Koren 등, 1992). α1,3-GT 유전자를 제거시키는 것은 초급성거부반응을 극복하기 위한 방법 중 하나로, α1,3-GT 유전자를 knock-out시킨 돼지가 생산되었다(Lai 등, 2002; Dai 등, 2002). α1,3-GT 유전자를 knock-out 시킨 돼지 장기의 이식은 초급성 거부반응을 억제할 수 있었지만, 초급성 거부반응에 이은 급성 거부반응을 극복하기 위해서는 더 연구가 필요하다.
	사람에게 돼지 장기를 이식하는 이종 간의 장기이식의 면역학적 문제는 어떠한 항체와 관련이 있는가?	이종 간의 장기이식에 따른 치료 목적에 이용할 수 있는 동물자원으로써 돼지는 인간 장기의 부족한 실정을 극복해 나갈 수 있는 대체자원 중의 한 가지이다(Levy 등, 2001). 그러나 사람에게 돼지 장기를 이식하는 데 있어서 발생하는 면역학적 문제는 자연적으로 일어나는 면역체계와 anti-gal 항체의 중요한 역할과 관련이 있다고 보고되고 있다(Morgan, 1995; Levy 등, 2001).

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저자의 다른 논문 :

표제어: PCR

동의어: Packet Collision Rate

용어 설명 출처 목록 (6)

용어 설명: PCR은 세균 특이성이 있는 primer를 이용하여 적은 수의 세균이 있을지라도 쉽게 검출할 수 있는 유용한 방법이며, 이를 이용하여 구강 내 치면세균막이나 타액에서 직접 세균을 검출할 수 있게 되었다[8].

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